CN117165696B - lncRNA相关试剂在调控鸡卵泡发育中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及家禽育种技术领域，目的是提供lncRNA相关试剂在调控鸡卵泡发育中的应用，通过转录组和翻译组测序结果联合分析，筛选出组内差异表达且具有翻译能力的lncRNAXR_003071938.1，发现通过降低该lncRNA，使其编码蛋白减少，和/或使其靶标miRNA‑103‑3p表达增加或吸附降低，和/或抑制其靶基因FBXW7表达，可以促进鸡卵泡颗粒细胞的增殖，抑制鸡卵泡颗粒细胞的凋亡。本发明通过探究降低或抑制lncRNA表达试剂、提升或促进miR‑103‑3p表达试剂或者降miR‑103‑3p吸附试剂在卵泡颗粒细胞的应用，对于研究卵泡发育以及等机制具有很好的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及家禽育种技术领域，具体涉及lncRNA相关试剂在调控鸡卵泡发育中的应用。
背景技术
产蛋性能是母鸡最重要的生产性能之一，主要受遗传、营养以及环境条件等因素影响，这些因素主要通过调控鸡卵巢中卵泡的动态发育作用于卵巢发育从而影响产蛋性能。在家禽繁殖过程中，卵泡闭锁发生在卵泡发育的各个时期，是一种常见的生理现象，鸡卵巢中大部分卵泡会停止生长而发生闭锁，仅少数优势卵泡继续发育直至排卵。优势卵泡的选择在很大程度上决定了动物的繁殖能力，这个动态过程受多种因子调控。
1个完整的卵泡种细胞类型包括卵母细胞腔、颗粒细胞和膜细胞3种。颗粒细胞周围形成膜细胞标志着初级卵泡进入次级卵泡阶段，而卵泡闭锁的明显特征是在颗粒细胞层形成寡核小体，而膜层细胞凋亡较少。鸡卵泡闭锁起始于颗粒细胞层，正常生长卵泡颗粒细胞的增殖和凋亡是并存的，而闭锁卵泡中仅能观察到颗粒细胞的凋亡，因此颗粒细胞的生物学状态决定卵泡是否继续生长或发生闭锁。颗粒细胞能够分泌雌激素、胰岛素等促生长因子，若这些促生长因子缺失，则颗粒细胞将失去调节功能甚至凋亡，从而导致细胞凋亡，故调节颗粒细胞中与分化、增殖、凋亡相关的因子是解决细胞凋亡，从而保证优势卵泡发育的关键。
lncRNA是一类长度超过200nt的非编码RNA，早期被认为不具有生物学活性。随着研究的不断深入，lncRNA的生物学活性不断被揭示，比如lncRNA能够通过翻译小肽发挥生物学活性。在家禽上，卵巢发育相关的lncRNA研究甚少。lnc_13814在母鸭小黄卵泡中明显下调，作为apla-miR-145-4的分子海绵来释放miRNA对DDIT3基因的抑制作用，从而促进鸭颗粒细胞凋亡；lncRNAMSTRG.7894.4在家鸽卵巢中调控差异表达的编码基因FOXK2，从而调节雌激素受体的表达。尽管已在坝上长尾鸡、海兰褐壳蛋鸡、京海黄鸡、罗曼蛋鸡的卵巢、不同卵泡和颗粒细胞中检测到许多lncRNA，但具体某个lncRNA作用于鸡卵泡发育的分子机制仍不清楚。本发明旨在开展这方面的深入研究，以探索lncRNA在鸡卵泡发育过程的调控机制。
发明内容
本发明的目的是提供降低或抑制lncRNA表达试剂在调控鸡卵泡发育中的应用，通过转录组和翻译组测序结果联合分析，筛选出25个既在组内差异表达又具有翻译能力的lncRNAs，并进一步筛选出lncRNAXR_003071938.1，探究其对鸡卵泡发育的作用机制。本发明的技术方案为：
第一方面，本发明提供降低或抑制lncRNA表达试剂在制备促进鸡颗粒细胞增殖及发育或者促进鸡卵泡发育的试剂、组合物或者药物上的应用，所述lncRNA为 XR_003071938.1，其核苷酸序列如SEQ ID. 1所示，所述XR_003071938.1的靶标miRNA为miR-103-3p，所述miR-103-3p的靶基因为FBXW7，所述降低或抑制表达试剂包括：降低或抑制所述lncRNA表达和/或所述lncRNA编码蛋白表达的试剂。
进一步地，所述XR_003071938.1的编码氨基酸序列如SEQ ID. 2所示。
进一步地，所述XR_003071938.1的靶标miRNA为miR-103-3p，所述miR-103-3p的靶基因为FBXW7，所述降低或抑制表达试剂还包括：降低或抑制所述靶基因FBXW7表达的试剂。
优选地，所述试剂具有如SEQ ID. 6和SEQ ID. 7所示的序列。
优选地，所述试剂具有如SEQ ID. 18和SEQ ID. 19所示的序列。
第二方面，本发明还提供提升或促进miR-103-3p表达试剂或者降低miR-103-3p吸附试剂在制备促进颗粒细胞增殖及发育或者促进卵泡发育的试剂、组合物或者药物上的应用。
优选地，所述试剂具有如SEQ ID. 12所示的序列。
第三方面，本发明提供一种促进鸡颗粒细胞增殖及发育的方法，包括：在鸡原代颗粒细胞中转染如SEQ ID. 6和SEQ ID. 7所示的序列。
第四方面，本发明提供一种促进鸡颗粒细胞增殖及发育的方法，包括：在鸡原代颗粒细胞中转染如SEQ ID. 12所示的序列。
第五方面，本发明提供一种促进鸡颗粒细胞增殖及发育的方法，包括：在鸡原代颗粒细胞中转染如SEQ ID. 18和SEQ ID. 19所示的序列。
本发明对正常卵泡和闭锁卵泡进行转录组和翻译组测序，共筛选到170个差异表达lncRNAs和578个具有sORF的lncRNAs，联合分析得到25个既在组内差异表达又具有翻译能力的lncRNAs。然后通过引物设计、qPCR扩增及测序、组织表达验证，筛选出组内差异表达且具有翻译能力的lncRNAXR_003071938.1，并发现通过降低该lncRNA，使其编码蛋白减少，和/或使miRNA-103-3p表达增加或吸附降低从而抑制FBXW7的表达，可以促进鸡卵泡颗粒细胞的增殖，抑制鸡卵泡颗粒细胞的凋亡。本发明通过探究降低或抑制lncRNA表达试剂、提升或促进miR-103-3p表达试剂或者降miR-103-3p吸附试剂在卵泡颗粒细胞的应用，对于研究卵泡发育机制具有很好的应用价值。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例1中lncRNA XR_003071938.1转录组、翻译组测序和qPCR验证，其中，A图表示转录组测序；B图表示翻译组测序；C图表示qPCR验证；LF1代表的是正常组，BF1表示就巢组。
图2为本发明实施例1中lncRNA XR_003071938.1表达特征研究，其中，A图表示lncRNA XR_003071938.1在不同组织中的表达量；B图表示lncRNA XR_003071938.1在等级卵泡中的表达量；C图表示lncRNA XR_003071938.1在SYF、LYF、SWF和LYF中的表达量。
图3为本发明实施例1中基于NCBI ORF Finder预测的XR_003071938.1序列及其翻译的蛋白。
图4为本发明实施例2中XR_003071938.1-122aa编码能力的验证，其中，A：ov-XR_003071938.1-Flag和ov-XR_003071938.1-Flag-MT载体的构建；B：插入3×Flag序列后，XR_003071938.1-122aa的氨基酸序列和蛋白大小；C：Western Blot检测ov-XR_003071938.1-Flag和ov-XR_003071938.1-Flag-MT转染组中的Flag蛋白表达；D：ov-XR_003071938.1-Flag-122aa载体的构建；E：Western Blot 检测ov-XR_003071938.1-Flag-122aa转染组中的Flag蛋白；F：qPCR检测XR_003071938.1在ov-XR_003071938.1-Flag、ov-XR_003071938.1-Flag-MT和ov-XR_003071938.1-Flag-122aa中的表达。
图5为本发明实施例2中XR_003071938.1-122aa对增殖相关基因、蛋白表达及增殖周期的影响，其中，A：qPCR检测XR_003071938.1-122aa对CCND1、CCND2、CDK2和PCNA的表达的影响；B：Western Blot检测XR_003071938.1-122aa对PCNA蛋白表达的影响；C、D：流式细胞周期分析检测XR_003071938.1-122aa对颗粒细胞的增殖周期的作用。
图6为本发明实施例2中ov-XR_003071938.1-122aa对颗粒细胞周期的影响（200Í），A：ov-XR_003071938.1-122aa的细胞增殖数；B：ov-XR_003071938.1-122aa的EdU阳性细胞率；EdU（红色）荧光标记表示正在增殖的细胞数量，hoechst（蓝色）荧光标记表示细胞核。
图7为本发明实施例2中XR_003071938.1-122aa对颗粒细胞凋亡的影响，A：qPCR检测XR_003071938.1-122aa对细胞凋亡相关基因mRNA表达的影响；B、C：Western blot检测XR_003071938.1-122aa对细胞凋亡相关蛋白表达的影响；D：流式细胞术检测XR_003071938.1-122aa对颗粒细胞凋亡率的影响。
图8为本发明实施例2中XR_003071938.1-122aa过表达后对颗粒细胞类固醇激素分泌的影响，其中，A：qPCR检测CYP11A1、CYP19A1和STAR mRNA表达水平；B、C：ELISA检测E2和PROG激素分泌；D、E：Western Blot检测颗粒细胞类固醇激素合成相关基因蛋白表达。
图9为本发明实施例3中qPCR检测XR_003071938.1的干扰效率（A图）和过表达效率（B图）。
图10为本发明实施例3中XR_003071938.1对颗粒细胞增殖的影响，其中，A：干扰XR_003071938.1后采用qPCR检测增殖相关基因表达水平；B：过表达XR_003071938.1后采用qPCR检测增殖相关基因表达水平；C：干扰XR_003071938.1后采用Western blot检测增殖相关蛋白的表达；D：过表达XR_003071938.1后采用Western blot检测增殖相关蛋白的表达。
图11为本发明实施例3中图8 流式细胞周期检测XR_003071938.1对颗粒细胞增殖的影响，其中，A、B、C：干扰XR_003071938.1；D、E、F：过表达XR_003071938.1。
图12为本发明实施例3中si-XR_003071938.1和ov-XR_003071938.1转染颗粒细胞36 h后EdU检测细胞增殖数量（200Í），其中，A为si-XR_003071938.1的染色结果，B是A图统计结果，C是ov-XR_003071938.1的染色结果，D是C图统计结果。EdU红色荧光标记表示正在增殖的细胞数量，hoechst蓝色荧光标记表示细胞核。
图13为本发明实施例3中qPCR检测XR_003071938.1对颗粒细胞凋亡相关基因mRNA表达的影响，其中，A：干扰XR_003071938.1；B：过表达XR_003071938.1。
图14为本发明实施例3中Western blot检测XR_003071938.1对颗粒细胞凋亡相关蛋白表达的影响，其中，A、B：干扰XR_003071938.1；C、D：过表达XR_003071938.1。
图15为本发明实施例3中流式细胞术检测XR_003071938.1对颗粒细胞凋亡的影响，其中，A：干扰XR_003071938.1；B：过表达XR_003071938.1。
图16为本发明实施例3中XR_003071938.1对类固醇激素合成相关基因表达及类固醇激素分泌的影响，其中，A：干扰XR_003071938.1对类固醇激素合成相关基因表达的影响；B：过表达XR_003071938.1对类固醇激素合成相关基因表达的影响；C：干扰XR_003071938.1对类固醇激素分泌的影响；D：过表达XR_003071938.1对类固醇激素分泌的影响。
图17为本发明实施例3中XR_003071938.1对颗粒细胞类固醇激素合成相关蛋白表达的影响，其中，A、B：干扰XR_003071938.1；C、D：过表达XR_003071938.1。
图18为本发明实施例4中lncRNA-miRNA靶标关系预测与验证，其中，图A为miR-103-3p种子序列与XR_003071938.1序列结合方式；图B为gga-miR-103-3p在si- XR_003071938.1、si-NC、ov- XR_003071938.1、ov-NC中的表达情况。
图19为本发明实施例4中miR-103-3P的干扰效率和过表达效率。
图20为本发明实施例4中XR_003071938.1与miR-103-3p靶标关系的验证，其中，A：XR_003071938.1和miR-103-3p的结合位点；B：双荧光酶素报告结果。
图21为本发明实施例4中miR-103-3p对颗粒细胞增殖相关基因及蛋白表达的影响，其中，A：鸡原代颗粒细胞转染miR-103-3p inhibitor后增殖相关基因的表达情况；B：鸡原代颗粒细胞转染miR-103-3p mimics后增殖相关基因的表达情况；C：鸡原代颗粒细胞转染miR-103-3p inhibitor后增殖相关蛋白的表达情况；D鸡原代颗粒细胞转染miR-103-3pmimics后增殖相关蛋白的表达情况。
图22为本发明实施例4中EdU检测miR-103-3p对颗粒细胞增殖的影响（200Í），其中，A、B：转染miR-103-3p inhibitor后EdU检测细胞增殖数量；C、D：转染miR-103-3p mimic后EdU检测细胞增殖数量。EdU（红色）荧光标记表示正在增殖细胞数量；hoechst（蓝色）荧光标记表示细胞核。
图23为本发明实施例4中流式细胞周期检测miR-103-3p对颗粒细胞增殖的影响，其中，A、B：干扰miR-103-3p；C、D：过表达miR-103-3p。
图24为本发明实施例4中qPCR检测miR-103-3p对颗粒细胞凋亡相关基因mRNA表达的影响，其中，A：干扰miR-103-3p；B：过表达miR-103-3p。
图25为本发明实施例4中Western Blot检测miR-103-3p对颗粒细胞凋亡相关基因蛋白表达的影响，其中，A、B：干扰miR-103-3p；C、D：过表达miR-103-3p。
图26为本发明实施例4中流式细胞术检测miR-103-3p对颗粒细胞凋亡的影响，其中，A：干扰miR-103-3p；B：过表达miR-103-3p。
图27为本发明实施例4中qPCR检测miR-103-3p对颗粒细胞类固醇激素合成相关基因mRNA表达的影响，其中，A：干扰miR-103-3p；B：过表达miR-103-3p。
图28为本发明实施例4中ELISA检测miR-103-3p对颗粒细胞内E2和PROG激素分泌的影响，其中，A：干扰miR-103-3p；B：过表达miR-103-3p。
图29为本发明实施例4中miR-103-3p对颗粒细胞类固醇激素合成相关蛋白表达的影响，其中，A、B：干扰miR-103-3p；C、D：过表达miR-103-3p。
图30为本发明实施例5中miRNA-mRNA靶标关系预测与qPCR验证，其中，A：miR-103-3p靶标基因的预测；B：miRNA-mRNA靶标关系的qPCR验证。
图31为本发明实施例5中miR-103-3p靶向FBXW7的双荧光素酶报告验证，其中，A：FBXW7野生型和突变型双荧光素酶报告质粒的构建；B：双荧光酶素报告结果。
图32为本发明实施例5中qPCR检测FBXW7的干扰效率
图33为本发明实施例5中FBXW7干扰后对颗粒细胞增殖的作用，其中，A：CCND1、CCND2、CDK2和PCNA的表达水平；B：PCNA蛋白表达水平；C、D：颗粒细胞的增殖周期。
图34为本发明实施例5中si-FBXW7和si-NC转染鸡颗粒细胞36 h后EdU检测细胞增殖数（200Í），其中，A图为染色结果，B图是数据统计结果；EdU（红色）荧光标记正在增殖细胞数量；Hoechst（蓝色）荧光标记细胞核。
图35为本发明实施例5中FBXW7对颗粒细胞凋亡的影响，其中，A：qPCR检测FBXW7对颗粒细胞凋亡相关基因表达的影响；B、C：Western Blot检测FBXW7对颗粒细胞凋亡相关蛋白表达的影响；D：流式细胞周期检测FBXW7对细胞凋亡的影响。
图36为本发明实施例5中FBXW7干扰后对颗粒细胞类固醇激素的影响，其中，A：qPCR检测CYP11A1、CYP19A1和STAR的mRNA表达水平；B、C：ELISA检测颗粒细胞E2和PROG激素分泌；D、E：Western Blot检测颗粒细胞类固醇激素合成相关基因蛋白表达。
具体实施方式
本发明实施例采用的大恒799肉鸡配套系是四川大恒家禽育种有限公司和四川省畜牧科学研究院培育的三系配套青脚麻羽优质肉鸡新品种（证书号：农09新品种证字第84号），于2020年通过国家畜禽遗传资源委员会审定，并被纳入《国家畜禽遗传资源品种名录（2021年版）》。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在以下实施例中，EdU标记技术、染色、流式细胞术、Western Blot检测、ELISA检测等采用的都是本领域常规检测技术。
实施例1
本研究通过对43周龄大恒肉鸡正常卵泡和闭锁卵泡进行转录组和翻译组测序，分别发现170个差异表达的lncRNAs、47个差异表达miRNAs和578个具有翻译能力lncRNAs。
根据转录组测序得到的lncRNA碱基序列，采用PrimerPremier5.0软件进行引物设计，由于部分lncRNA序列引物设计过程中不符合引物设计原则，最终仅9个lncRNA可以设计出引物，PCR扩增仅只有3个lncRNA扩增出条带，将扩增产物回收后进行sanger测序，将测序结果与转录组测序序列进行比对（如图1所示），发现XR_003071938.1在闭锁卵泡中表达量最高，该lncRNA位于鸡第27号染色体上。XR_003071938.1的引物序列及其扩增序列分别如表1和表2所示：
表1 引物序列信息
表2 3个lncRNA扩增序列
采集正常卵泡和闭锁卵泡提取RNA后进行反转录，通过qPCR验证，lncRNA XR_003071938.1在正常卵泡和闭锁卵泡的表达情况；定量结果显示，lncRNA XR_003071938.1在闭锁卵泡和正常卵泡中的表达量具有显著差异，lncRNA XR_003071938.1在不同组织之间的表达模式进行了探究，lncRNA XR_003071938.1在心、大脑、肌肉、肝、脾、肺、肾、肠、肌胃、子宫和卵巢中均有表达，但其在卵巢中的表达量相较其他组织较高；此外，lncRNAXR_003071938.1表达量从等级卵泡F1-F5（F1-5是不同阶段的等级卵泡）逐渐降低；lncRNAXR_003071938.1在SYF（小黄卵泡）、LYF（大黄卵泡）、SWF（小白卵泡）、LWF（大白卵泡）中的表达量显示其在小白卵泡中的表达量较高，如图2所示，这些结果暗示lncRNAXR_003071938.1对鸡的卵巢发育可能具有重要调控作用。
翻译组测序结果显示，lncRNA在正常卵泡中的翻译效率低于闭锁卵泡，根据XR_003071938.1的全长序列，使用NCBIORFFinder对XR_003071938.1的开放阅读框进行预测（图3），结果发现XR_003071938.1含有一个开放阅读框（ORF），和测序数据一致，该ORF从XR_003071938.1的第199位碱基开始，即XR_003071938.1的第199位碱基为起始密码子ATG，到567位碱基结束，即567位碱基为终止密码子TGA。
XR_003071938.1编码122个氨基酸的小肽XR_003071938.1-122AA，序列如SEQ ID.2所示，根据氨基酸序列预测该蛋白质分子量为12.43 KD。
实施例2
为了验证XR_003071938.1编码蛋白的能力，在XR_003071938.1的ORF的起始密码子ATG序列之后插入了一个3×FLAG蛋白标签序列，并进一步构建过表达质粒ov-XR_003071938.1-FLAG后，并将其初始密码子ATG突变为CCC后，构建另一个载体，命名为ov-XR_003071938.1-FLAG-MT，插入3×FLAG序列后，根据氨基酸序列计算插入标签后XR_003071938.1-122aa-Flag蛋白的大小为15.58kD。用β-tubulin抗体和FLAG抗体进行WesternBlot检测，结果显示在ov-XR_003071938.1-FLAG转染组和ov-XR_003071938.1-FLAG-MT转染组均检测到β-tubulin蛋白；而在ov-XR_003071938.1-FLAG转染组中检测到Flag标签蛋白的表达，且与XR_003071938.1-122aa-Flag的理论大小相符，在ov-XR_003071938.1-FLAG-MT转染组中未检测到Flag标签蛋白的表达。
将带有Flag标记蛋白的XR_003071938.1-122aa序列插入到pcDNA3.1载体上构建ov-XR_003071938.1-Flag-122aa过表达质粒并进行WesternBlot检测，结果表明ov-XR_003071938.1-Flag-122aa能够使Flag标记蛋白成功表达。
qPCR检测ov-XR_003071938.1-FLAG、ov-XR_003071938.1-FLAG-MT和ov-XR_003071938.1-Flag-122aa转染组XR_003071938.1的表达情况，结果表明相比ov-NC（即pcDNA3.1）转染组，ov-XR_003071938.1-FLAG、ov-XR_003071938.1-FLAG-MT和ov-XR_003071938.1-Flag-122aa三组均能提高XR_003071938.1的表达水平，其中ov-XR_003071938.1-Flag-122aa最显著。
上述结果如图4所示，表明XR_003071938.1可以成功编码由122个氨基酸组成的蛋白质。
在鸡原代颗粒细胞中过表达XR_003071938.1-122aa，qPCR（购自SYBR Green RT-PCR试剂盒，宝生物工程（大连）有限公司，下文同）
检测增殖相关基因CCND1、CCND2、CDK2和PCNA的表达情况，结果如图5中A图所示，显示过表达XR_003071938.1-122aa后CCND1、CCND2、CDK2和PCNA的表达相较对照组明显的降低，WesternBlot检测结果（图5中B图）表明XR_003071938.1-122aa转染组中增殖相关蛋白PCNA的丰度显著低于对照组。流式细胞周期分析结果（图5中C图和D图）表明ov-XR-003071938.1-122aa组处于G0/G1期的细胞显著高于ov-NC，S+G2期的细胞显著低于ov-NC。
鸡原代颗粒细胞来自43周龄正常产蛋的大恒肉鸡，颈脱臼法处死，通过剖检观察卵巢发育正常的鸡，采集等级前卵泡，经PBS冲洗后，在PBS缓冲液中轻轻分离颗粒细胞层备用。本试验通过了四川农业大学动物伦理委员会的批准（后面实施例同）。鸡原代颗粒细胞的培养以及过表达XR_003071938.1-122aa操作属于本领域常规操作，这里不作详细描述。
EdU染色结果（图6）显示XR_003071938.1-122aa转染组中EdU染色细胞数量显著少于对照组，流式细胞周期分析技术检测结果显示过表达XR_003071938.1-122aa显著减少了在S期和G2期颗粒细胞的数目，但G0、G1期细胞的数量明显高于对照组。
综上，XR_003071938.1-122aa可抑制鸡原代颗粒细胞的增殖。
qPCR验证细胞凋亡相关基因Caspase3、Caspase8、Caspase9和BCL-2的mRNA水平，结果如图7中A图所示，显示过表达XR_003071938.1-122aa之后，Caspase3、Caspase8和Caspase9的mRNA水平相比较对照组显著上调，但BCL-2的表达被显著下调，WesternBlot检测结果表明XR_003071938.1-122aa可以明显升高Caspase3和Caspase9的蛋白表达水平（图7中B、C图），流式细胞周期检测结果显示，XR_003071938.1-122aa过表达导致颗粒细胞凋亡率的升高（图7中D图）。
综上， XR_003071938.1-122aa对颗粒细胞的凋亡起促进的作用。
qPCR验证类固醇激素合成相关基因CYP11A1、CYP19A1和STAR的mRNA水平，结果如图8中A图所示，显示过表达XR_003071938.1-122aa后，CYP11A1、CYP19A1和STAR的mRNA水平相比较对照组显著降低，ELISA检测结果表明过表达XR_003071938.1-122aa后显著减少了颗粒细胞内生殖激素E2和PROG的分泌水平（图8中B、C图），WesternBlot结果表明过表达XR_003071938.1-122aa可明显降低STAR和CYP19A1的蛋白表达能力（图8中D、E图）。
综上，XR_003071938.1-122aa可抑制鸡原代颗粒细胞类固醇激素的分泌和合成。
实施例3
使用pcDNA3.1-ciR载体构建了XR_003071938.1的过表达质粒，在体外培养鸡原代颗粒细胞转染siRNA（表3）和过表达质粒，24h处理后收集细胞总RNA样品，提取细胞RNA，反转录获得cDNA文库，利用qPCR检测XR_003071938.1在干扰及过表达后在颗粒细胞中的表达量变化情况。
结果显示在颗粒细胞内转染XR_003071938.1的siRNA后，相比较对照组XR_003071938.1的表达量被显著抑制（图9中A图），但转染过表达质粒后，XR_003071938.1的表达量与对照组相比显著升高（图9中B图）。
表3 siRNA序列信息
序列表中U改成W。
通过qPCR法检测转染XR_003071938.1的siRNA和过表达质粒的鸡原代颗粒细胞中增殖相关基因CyclinD1（CCND1）、CyclinD2（CCND2）、CyclinDependentKinase2（CDK2）和ProliferatingCellNuclearAntigen（PCNA）的表达情况，发现XR_003071938.1明显抑制了CCND1、CCND2、CDK2和PCNA的表达（图10中A、B图）。WesternBlot检测发现XR_003071938.1抑制了增殖相关蛋白PCNA的表达（图10中C、D图）。
流式细胞周期分析（图11中A-F图）显示XR_003071938.1能减少S期和G2期颗粒细胞数目，增加G0、G1期颗粒细胞数目，EDU染色（图12中A-D图）发现XR_003071938.1能减少EdU阳性细胞数目。
以上结果表明，XR_003071938.1能抑制鸡原代颗粒细胞增殖，而降低或抑制XR_003071938.1表达，则可以促进鸡原代颗粒细胞增殖。
通过qPCR法检测转染XR_003071938.1的siRNA和过表达质粒的鸡原代颗粒细胞中凋亡相关基因Caspase3、Caspase8、Caspase9和BCL-2的mRNA水平，发现XR_003071938.1明显地升高了Caspase3、Caspase8和Caspase9的mRNA水平，而BCL-2的mRNA水平却显著降低（图13）。Western Blot检测结果显示XR_003071938.1增加了凋亡相关蛋白Caspase3和Caspase9的表达（图14中A-D图）。
用annexin V抗体和碘化丙啶（PI）染色，然后用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。结果如图15所示，表明XR_003071938.1能提高颗粒细胞凋亡率。
上述结果表明，XR_003071938.1能促进颗粒细胞凋亡，而降低或抑制XR_003071938.1表达，则可以促进鸡原代颗粒细胞发育。
通过qPCR法检测转染XR_003071938.1的siRNA和过表达质粒的鸡原代颗粒细胞中类固醇合成相关基因CYP11A1、CYP19A1和STAR的表达，发现XR_003071938.1降低了CYP11A1、CYP19A1和STAR的mRNA水平（图16中A、B图）。ELISA法检测生殖激素E2和PROG的分泌水平，发现XR_003071938.1能抑制生殖激素E2和PROG的分泌（图16中C、D图）。WesternBlot检测结果显示XR_003071938.1能抑制类固醇激素合成相关蛋白STAR和CYP19A1的表达水平（图17中A-D图）。
此外，还可以通过基因编辑诸如CRISPR-Cas9技术来改造XR_003071938.1，从而达到降低或抑制其表达的目的，以促进鸡原代颗粒细胞的增殖和发育。
实施例4
通过RNAhybrid对XR_003071938.1的靶标miRNA进行预测，发现miR-103-3p的种子序列GCAGCATT可与XR_003071938.1的序列结合（图18）。转录组测序结果显示（图19），miR-103-3p在正常卵泡中表达量高于闭锁卵泡，设计miR-103-3p的inhibitor/mimics参照基因序列和Inhibitor/mimics Ncontrol序列（表4），在体外培养鸡原代颗粒细胞并分别转染XR_003071938.1的siRNA和过表达质粒，提取总RNA并进行miRNA的反转录后进行qPCR检测，图19的结果显示miR-103-3p inhibitor明显地减少了鸡原代颗粒细胞内miR-103-3p的表达，但是miR-103-3p mimic显著增加了颗粒细胞内miR-103-3p的表达量；且相比较对照组，miR-103-3p mimic表达量提升约为100倍，同时抑制颗粒细胞中XR_003071938.1表达后，miR-103-3p表达明显增加，而转染XR_003071938.1过表达质粒后，miR-103-3p表达降低。
表4 miRNA inhibitor/mimics序列信息
序列表中U改成W。
将预测到的结合靶标位点与其突变序列构建到双荧光素酶报告基因载体上，分别构建野生型质粒pmirGLO-XR_003071938.1-WT和突变型质粒pmirGLO-XR_003071938.1-MT，其中结合位点的序列由“ATGCTGC”突变为“TACGACG”，分别将双荧光素酶报告基因质粒（WT/MT）和miR-103-3p mimic/mimic NC共转染到鸡DF-1细胞中，然后进行双荧光素酶报告试验，结果显示（图20）：与对照组相比，共转染lncRNA-WT和miR-103-3p mimics明显降低了萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值，其余3个组比值则没有变化，试验结果证实了miR-103-3p是XR_003071938.1的靶标miRNA。miR-103-3p的核酸序列：3’-AGTATCGGGACATGTTACGACGA-5’。
通过在鸡原代颗粒细胞中转染miR-103-3p inhibitor和miR-103-3p mimic，采用qPCR在基因水平检测增殖相关基因CCND1、CCND2、CDK2和PCNA的表达水平，结果显示miR-103-3p显著地提高了CCND1、CCND2、CDK2和PCNA的表达（图21中A、B），Western Blot结果表明miR-103-3p能提高增殖相关蛋白PCNA的表达（图21中C、D）。
EdU结果显示miR-103-3p mimic转染组EdU阳性细胞数目显著多于NC转染组（图22中A-D图）。
流式细胞周期分析结果显示miR-103-3p能增加在S期和G2期，降低G0期和G1期颗粒细胞的数量（图23中A-D图）。
综上，miR-103-3p可促进鸡原代颗粒细胞的增殖。
qPCR验证细胞凋亡相关基因Caspase3、Caspase8、Caspase9和BCL-2的mRNA水平，结果显示miR-103-3p能降低Caspase3、Caspase8和Caspase9的mRNA水平，升高而BCL-2的mRNA水平（图24）。
Western Blot检测结果表明miR-103-3p明显地降低了凋亡相关蛋白Caspase3和Caspase9的表达水平（图25中A-D图）。
流式细胞周期检测结果显示miR-103-3p表达的增加则降低颗粒细胞的凋亡率（图26）。
综上，miR-103-3p对颗粒细胞的凋亡起抑制的作用。
qPCR验证类固醇激素合成相关基因CYP11A1、CYP19A1和STAR的mRNA水平，结果显示miR-103-3p提高了CYP11A1、CYP19A1和STAR的mRNA水平（图27）。ELISA法检测生殖激素E2和PROG分泌水平，发现miR-103-3p能促进E2和PROG分泌（图28）。
Western Blot检测结果表明miR-103-3p能提高类固醇合成相关蛋白STAR和CYP19A1的表达水平（图29中A-D图）。
实施例5
通过DIANA、miRDB和TargetScann软件对miR-103-3p的靶标基因预测，共预测到miR-103-3p的靶标基因14个，通过qPCR对预测到的miR-103-3p靶标基因进行初步验证，发现FBXW7与miR-103-3p有相反的表达模式，故将FBXW7初步作为miR-103-3p的靶标mRNA（图30）。
基于预测的靶标位点，将靶标位点与其前后序列构建到双荧光素酶报告基因载体上（pmirGLO），分别构建野生型双荧光素酶报告基因（pmirGLO-FBXW7-WT）和突变型双荧光素酶报告基因（pmirGLO-FBXW7-MT），其中结合位点的序列由“ATGCTGC”突变为“TACGACG”，体外DF-1细胞的双荧光素酶报告试验结果显示，在共转染双荧光素酶报告基因和miR-103-3p mimics后，pmirGLO-FBXW7-MT质粒中的萤火虫荧光素酶活性降低，但共转染突变报告基因的细胞没有变化表明FBXW7是miR-103-3p的靶基因（图31）。
设计3条siRNA序列（表5中S1、S2、S3），在体外培养鸡原代颗粒细胞转染FBXW7的siRNA（si-FBXW7）后，通过qPCR检测FBXW7的表达量，结果表明在颗粒细胞内转染FBXW7的siRNA后，相比较其他转染组s3-FBXW7可显著降低FBXW7的表达量，S3序列为：S：GGGUGAAUUUAUCCGAAAUTT，AS：AUUUCFFAUAAAUUCACCCTT（图32）。
表5 3条siRNA序列
序列表中U改成W。
qPCR检测增殖相关基因CCND1、CCND2、CDK2和PCNA的表达情况，结果显示FBXW7能降低CCND1、CCND2、CDK2和PCNA的表达（图33中A、B图）。Western Blot检测结果显示，FBXW7能减少增殖相关蛋白PCNA的丰度（图33中C、D图）。EdU染色结果表明FBXW7能降低EdU染色细胞数量，流式细胞周期分析技术结果显示FBXW7能减少S期和G2期、增加G0期和G1期颗粒细胞数（图35）。
综上，FBXW7可抑制鸡原代颗粒细胞的增殖，而抑制FBXW7表达则可以促进鸡原代颗粒细胞的增殖。
qPCR验证细胞凋亡相关基因Caspase3、Caspase8、Caspase9和BCL-2的mRNA水平，结果显示FBXW7能增加Caspase3、Caspase8和Caspase9的mRNA水平，降低BCL-2的表达（图35中A图）。Western Blot检测结果显示FBXW7可以明显提高Caspase3和Caspase9的蛋白表达水平（图35中B、C图）。流式细胞周期检测结果发现FBXW7能提高颗粒细胞凋亡率（图35中D图）。
综上，FBXW7对颗粒细胞的凋亡起促进的作用，而抑制FBXW7表达则可以促进鸡原代颗粒细胞的发育。
qPCR验证类固醇激素合成相关基因CYP11A1、CYP19A1和STAR的mRNA水平，结果显示FBXW7能抑制CYP11A1、CYP19A1和STAR的mRNA水平（图36中A图）。ELISA检测生殖激素E2和PROG水平发现FBXW7能降低颗粒细胞内生殖激素E2和PROG的分泌水平（图36中B、C图）。Western Blot检测结果表明FBXW7可以明显降低STAR和CYP19A1的蛋白表达能力（图36中D、E图）。
综上，FBXW7可抑制鸡原代颗粒细胞类固醇激素的分泌和合成，而抑制FBXW7表达则可以促进鸡原代颗粒细胞类固醇激素的分泌和合成。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (3)
1.降低或抑制lncRNA表达试剂在制备促进鸡颗粒细胞增殖及发育或者促进鸡卵泡发育的试剂、组合物或者药物上的应用，其特征在于，所述lncRNA为 XR_003071938.1，其核苷酸序列如SEQ ID. 1所示，所述XR_003071938.1的靶标miRNA为miR-103-3p，所述miR-103-3p的靶基因为FBXW7，所述降低或抑制表达试剂包括：降低或抑制所述lncRNA表达和/或所述lncRNA编码蛋白表达的试剂；
所述降低或抑制lncRNA表达试剂具有如SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 7所示的序列。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述XR_003071938.1的编码氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一种促进鸡颗粒细胞增殖及发育的方法，其特征在于：包括：在鸡原代颗粒细胞中转染如SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 7所示的序列。
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Non-Patent Citations (7)
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| Ghrelin对鸡等级前卵泡发育的影响;林金杏;毛杰;米玉玲;张才乔;;畜牧兽医学报(09);第1220-1226页 * |
| miR-122-5p regulates proliferation and apoptosis of chicken granulosa cells of hierarchal follicles by targeting MAPK3;Guangfa Zhang等;《Gene》;第824卷;146397 * |
| miR-130a-3p regulates steroid hormone synthesis in goat ovarian granulosa cells by targeting the PMEPA1 gene;Lu Zhu等;《Theriogenology》;第165卷;92-98 * |
| MiRNA-130a在小鼠卵泡发育过程中的表达和对颗粒细胞增殖和凋亡的影响;但意;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》(第09期);D050-4 * |
| 假基因HMGA1P6调控HMGA1/2促进卵巢癌发生发展的机制研究;田晓雪;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科级辑》(第12期);E068-2 * |
| 卵母细胞Fbxw7调控间隙连接在早发性卵巢功能不全中的作用与机制研究;赵茴茴;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科级辑》(第02期);E068-39 * |
| 蛋鸡卵泡发育及其表观遗传调控机制研究进展;茹盟;《畜牧兽医学报》;第54卷(第9期);第3613-3622页 * |
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