CN107384913A - 一种海马药材基因组dna提取方法 - Google Patents

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程汝滨
葛宇清
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Abstract

本发明一种海马药材基因组DNA提取方法，针对海马药材中表面杂质与真菌、螨虫等污染物多的特点，经本发明清洗液清洗后，有效去除表面的杂质和内部污染物；针对海马药材加工和储藏过程中导致基因组部分降解，DNA浓度低的特点，本发明对SDS提取法的步骤和配方进行了改良和优化，提高药材的裂解效果；裂解完成后，消化液进行抽提沉淀后取上清液加入预冷的异丙醇沉淀DNA，离心弃去液相，沉淀洗涤风干后用TE溶液充分溶解DNA，加入微量RNA酶去除样品中的RNA，获得海马基因组DNA。本发明解决了现有的提取技术获得的DNA质量不高的缺陷，并且避免了真菌和螨虫等对海马基因组的污染，可用于后续的PCR扩增和分子鉴定。

Description

一种海马药材基因组DNA提取方法
技术领域
本发明属生物技术领域，具体涉及一种海马药材的DNA提取方法。
背景技术
海马，别名马头鱼、龙落子鱼，是我国传统的名贵中药材，具有温肾壮阳、散结消肿的功效，常用于肾阳不足所致诸证。现代研究表明，海马中富含氨基酸、活性肽、甾体化合物、脂肪酸和微量元素等多种化学成分，在治疗性功能障碍、延缓机体衰老、抗疲劳、抗肿瘤等方面显示了良好的预防和治疗效果，具有良好的应用和开发前景。
据2010年版《中国药典》规定，海马为海龙科动物线纹海马(Hippocampuskelloggi Jodan et Snyder)、刺海马(Hippocampus histrix Kaup)、大海马(Hippocampuskuda Bleeker)、三斑海马(Hippocampus trimaculatus Leach)或小海马(海蛆)(Hippocampus japonicus Kaup)的干燥体。目前国内每年消耗海马约3000-4000万条，其来源多为野生，质量良莠不齐、品种混杂，掺杂和掺假情况尤为突出，非药典种海马销售比例大，如鲍氏海马(H.barbouri)、棘海马(H.spinosissimus)、太平洋海马(H.ingens)、直立海马(H.erectus)、欧洲海马(H.hippocampus)、虎尾海马(H.comes)等。2010版《中国药典》仅对海马的性状做了简单的描述，难以对海马的质量进行科学的评价和控制。为了确保临床上海马药材使用的安全有效，建立稳定可控的海马质量评价方法迫在眉睫。
DNA条形码技术是通过PCR技术扩增基因序列中的一段通用DNA片段，对扩增的通用DNA片段进行比较分析后，可快速准确的完成物种的识别和鉴定，在中药材的鉴定方便显示了广阔的应用前景。根据海马线粒体DNA片段，如CO1、Cytb和16S rDNA序列，可以从分子水平鉴定海马种类和开发简单快速的鉴别方法。
但《中国药典》规定的海马药材为海马的干体，由于加工和长时间放置后，部分基因组已经降解，传统的基因组提取方法难以获取高质量的基因组DNA。吕国庆等采用传统的SDS法提取中药材地龙干品基因组，发现获得的DNA量少且质量不高，不适合后续的PCR扩增试验。海马药材中含有丰富的蛋白、脂肪、甾醇和多糖等物质，影响DNA的提取效果，进一步增加了海马药材基因组DNA提取的难度。此外，海马药材在储存过程中，极易滋生真菌、螨虫等微生物，污染海马药材基因组DNA，影响后续的PCR扩增效率和分子鉴定准确性，干扰最终的鉴定结果。因此，迫切需要对传统的基因组提取方法进行优化，提高样品中DNA的裂解释放效率，降低多糖和甾醇等次生代谢产物的影响，提高海马药材中DNA的浓度和质量，同时建立简便高效的海马药材预处理方法，去除药材表面杂质和内部滋生的外源微生物的影响。
目前，对动物类中药材干品的基因组提取方法的研究，尚处于起步阶段。蒋超等(2013)采用碱裂解法提取蛇类药材基因组DNA，并成功用于乌梢蛇和金钱白花蛇的分子鉴定；张改霞等(2015)采用天根生化科技(北京)有限公司的基因组提取试剂盒从海马药材中提取基因组，用于海马药材的分子鉴定。试剂盒相对成本高，价格比较昂贵，且无法避免真菌、螨虫等海马内滋生的微生物的污染。
SDS-蛋白酶K法是动物组织材料提取基因组DNA的常用方法之一，可有效破坏细胞膜及细胞中的蛋白质，使基因组DNA从破碎的细胞中释放出来。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为清洁剂，具有吸附作用，可以和样品中的多酚、萜类物质起络合作用，并可与多糖结合。β-巯基乙醇是抗氧化剂，可以拆开蛋白质的二硫键，使酶变性，减少基因组DNA的降解。在SDS-蛋白酶K法的基础上，对海马药材基因组提取过程中的几个重要成分(SDS、蛋白酶K、PVP和β-巯基乙醇)的浓度和顺序进行优化改良，有助于筛选获得高质量的海马药材DNA提取方法，为进一步的PCR扩增和分子鉴定奠定基础。
发明内容
本发明的目的是为解决现有技术中存在的上述问题，提供一种从海马药材中获得高纯度基因组DNA的方法，该方法成本低，提取工艺简单易行，获得的DNA纯度高，避免了海马药材中微生物基因的污染和多糖、蛋白和甾体等物质的影响，能满足后续PCR等分子生物学实验的要求。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种海马药材基因组DNA提取方法，包括以下步骤：
(1)海马药材的预处理：
将海马药材加入清洗液中，在45-50℃水浴中对海马药材超声清洗5-10min，所述清洗液为：50mmol/L Tris-HCl，0.2wt％SDS，余量为水，pH 7.2；
(2)样品的裂解：
将预处理后的海马药材剪碎后，加入海马药材质量30-50倍的SDS裂解液，65℃水浴中裂解消化1-2h，期间每隔5-10min混匀一次，消化彻底后，12000r/min离心，去除未消化的固体不溶物，取上层澄清的样品消化液；
所述SDS裂解液为：100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，2wt％SDS，3wt％PVP，1％β-巯基乙醇，余量为水，pH8.0；
(3)消化液的抽提沉淀：
样品消化液中加入1.1-1.3倍体积的苯酚、氯仿和异戊醇混合液抽提后，4-5℃下12000r/min离心10-15min，取上清液加入等体积的氯仿、异戊醇混合液抽提后，4-5℃下13000r/min离心10-15min，取上清液；
(4)样品基因组DNA沉淀：
在抽提后的水相中加入0.8-1倍体积的预冷异丙醇，摇匀后于-20℃放置0.5-1h，4-5℃下13000r/min离心15-20min，弃去液相，沉淀用75％乙醇洗涤2-3次，去乙醇自然风干；再用TE溶液充分溶解，加入RNA酶后，室温静置10-15min去除样品中的RNA，获得海马基因组DNA。
利用本发明的提取方法获得的基因组DNA具有纯度高、污染小的优点，避免了药材本身多糖、蛋白、色素和外源微生物污染的影响，该提取方法制备的海马药材基因组DNA可用于后续的PCR扩增和分子鉴定。
所述的海马药材包括药典规定的海马药材正品线纹海马、大海马、刺海马、三斑海马、小海马以及主要的海马药材伪品虎尾海马、太平洋海马、棘海马、鲍氏海马、棕海马、吻海马、直立海马、南非海马和欧洲海马。
所述的海马药材包括海马药材的干品、粉末、饮片及炮制后的海马药材，由于加工和长时间放置后，部分基因组已经降解，传统的基因组提取方法难以获取高质量的基因组DNA。
进一步地，海马药材干品的取样部位为海马的尾部、躯干部或者头部的肌肉组织。
步骤(1)中，取海马药材干品10-30mg，加入1mL清洗液进行超声清洗，超声清洗的功率为200～400W，清洗液配方中含有0.2wt％的SDS，SDS作为一种表面活性剂，低浓度的SDS可有效的清除药材表面残留的杂质和内部真菌、螨虫等微生物，且不破坏药材内部的DNA结构。45-50℃的加热处理5-10min，可促进清洗液对药材的浸泡和清洗效果，超声处理可进一步加速杂质的渗出和去除，利于高纯度海马基因组DNA的获取。
优选地，步骤(2)中，裂解消化期间采用微波加热法对样品裂解液处理一次，所述微波加热法处理时间在样品裂解0.5-1h后，采用微波炉解冻档处理，每加热1min后冷却2min，共处理15min。采用微波加热法进行处理能加快药材的裂解，增加裂解效果。
优选地，步骤(2)中，添加适量的蛋白酶K进行消化处理，蛋白酶K浓度为10mg/mL，在裂解消化最开始和微波加热完成后，分两次在裂解液中加入蛋白酶K，每次加入的量为8-15μL。将蛋白酶K的加入方式由通常的一次性加入更改为两次加入，有效提高了蛋白酶K的降解效果，使尽量多的基因组DNA溶于裂解液上清中。
步骤(2)对传统的SDS-蛋白酶K提取基因组的方法，在配方和工艺上进行了改良。针对海马药材加工和储藏过程中导致基因组部分降解，DNA浓度低的特点，调整优化裂解液中SDS的质量百分比浓度为2％，并额外添加了3wt％的PVP和1％的β-巯基乙醇，两者联合使用，可有效的去除药材样品中的酚类和多糖等杂质对基因组DNA的影响。
步骤(3)中，苯酚、氯仿和异戊醇混合液以体积比为25:24:1混合得到；氯仿、异戊醇混合液以体积比为24:1混合得到。
步骤(4)中，RNA酶的浓度为20mg/mL，加入的体积为0.05-0.2μL。
步骤(4)中，TE溶液为：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，余量为水，PH＝8.0。
本发明采用泳检测基因组DNA的完整性，A260/A280和A260/A230测定样品DNA的浓度和纯度。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
(1)建立了一种新的海马药材清洗液配方和工艺，清洗液配方中含有0.2％的SDS，作为一种表面活性剂，低浓度的SDS可有效的清除药材表面残留的杂质和内部真菌、螨虫等微生物，且不破坏药材内部的DNA结构。45-50℃的加热处理5-10min，可促进清洗液对药材的浸泡和清洗效果，超声处理可进一步加速杂质的渗出和去除，利于高纯度海马基因组DNA的获取。
(2)对传统的SDS-蛋白酶K提取基因组的方法，在配方和工艺上进行了改良。调整优化裂解液中SDS的浓度为2％，并额外添加了3％的PVP和1％的β-巯基乙醇，两者联合使用，可有效的去除药材样品中的酚类和多糖等杂质对基因组DNA的影响；增加了裂解消化过程中微波加热的处理流程，将蛋白酶K的加入方式由通常的一次性加入更改为两次加入，有效提高了蛋白酶K的降解效果，使尽量多的基因组DNA溶于裂解液上清中，已得到量大、纯度高的海马药材基因组DNA。
(3)在苯酚、氯仿和异戊醇抽提过程中，抽提液的使用量由通常的1倍体积提高为1.2倍体积，尽可能多的去除水相中的蛋白质、酚类和多糖等物质，提高了基因组DNA的纯度。
(4)本发明提取过程中，不使用液氮研磨样品，避免了液氮研磨过程中容易造成冻伤皮肤的可能性。
(5)本发明所用的试剂和原料易得，均可通过市场购买获得。
附图说明
图1为本发明实施例1提取并纯化的海马药材基因组DNA琼脂糖电泳图；
图2为本发明实施例1提取并纯化的海马药材基因组DNA琼脂糖电泳图；
图3为以本发明实施例1提取获得海马药材基因组DNA为模板，CO1扩增产物的琼脂糖电泳图；
图4为对比例1以传统的SDS法提取获得海马药材基因组DNA为模板，CO1扩增产物的琼脂糖电泳图。
具体实施方式
为了能更清晰地说明本发明的提取方法，下面结合具体实施案例，对本发明的提取方法进行进一步阐述。
实施例1
改良方法海马药材基因组DNA提取
本实施例中材料海马药材为干品，包括2010版《中国药典》规定的5种正品海马样品和市场上常见的11种伪品海马样品，分别是线纹海马、大海马、三斑海马、刺海马、小海马、太平洋海马、虎尾海马、棘海马、鲍氏海马、直立海马、吻海马、西澳海马、棕海马、欧洲海马、贾氏海马和南非海马。本实施例中海马药材样品购于浙江磐安中药材专业市场、安徽亳州中药材专业市场、成都市荷花池中药材专业市场、河北安国中药材专业市场、山东青岛海产品批发市场、山东威海海产品批发市场(以下简写为磐安、亳州、荷花池、安国、青岛、威海和汕头)，具体的样品信息详见表1，包括海马样本的种类、采集地及拉丁名。
表1本实验所用的海马样本种类、采集地及拉丁名
(1)样品预处理
取海马药材干品，用体积分数75％乙醇擦拭表面后，用剪刀取海马尾部的肌肉组织20mg，放入1.5ml离心管中，加入1mL的清洗液(50mmol/L Tris-HCl，0.2wt％SDS，余量为水，pH 7.2)，在50℃水浴锅中超声清洗10min，期间上下颠倒2-3次，如溶液较为浑浊，需更换清洗液1次，得到清洗浸发后的海马药材样品。
(2)样品裂解
样品裂解液为改良后的SDS抽提裂解液，其中SDS的质量百分比浓度调整为2％，并额外添加了PVP和β-巯基乙醇，具体的配方组成如下：100mmol/L Tris-HCl，20mmol/LEDTA，1.4mol/L NaCl，2％SDS，3％PVP，1％β-巯基乙醇，余量为水，pH8.0，其中β-巯基乙醇百分比为体积百分比，其余百分比为质量百分比。其中，由于β-巯基乙醇不稳定，如果提前溶解后会析出沉淀，因此在使用前再加入到裂解液中。
将SDS裂解液加热至65℃，混匀。向预处理后的海马样品中加入750μL预热的裂解液后，65℃水浴浴上消化60-120min，每10min混匀一次。样品消化30-60min时，将裂解的样品用微波加热处理一次，促进样品的裂解和DNA的释放，微波加热的具体步骤如下：将样品放入微波炉中，采用解冻档加热处理，每加热1min后冷却2min，共反复加热5次，总计处理15min。在样品裂解最开始和微波加热结束后，分两次添加蛋白酶K消化处理，蛋白酶K的浓度为10mg/mL，每次添加的量为8-15μL。待样品消化彻底后，12000r/min离心10min后，去除未消化的固体不溶物，取上层澄清的样品消化液。
(3)消化液的抽提
在含有DNA的样品消化液中，加入1.2倍体积的苯酚、氯仿和异戊醇混合液，轻轻颠倒混匀后，室温放置5min，4-5℃下12000r/min离心10-15min，取离心分离获得水相，转移至新的离心管中，加入等体积的氯仿、异戊醇混合液，轻轻颠倒混匀后，室温放置10min，4-5℃下13000r/min离心10-15min，吸取上清液至新的1.5mL离心管中。其中所用的苯酚、氯仿、异戊醇的体积比为25:24:1，氯仿、异戊醇的体积比为24:1。
(4)样品DNA的沉淀
在抽提后的水相中，加入0.8倍体积的预冷异丙醇溶液，轻轻摇匀后于-20℃放置0.5-1h，4℃下13000r/min离心15-20min，弃去液相，取DNA沉淀用75％乙醇洗涤2-3次后，去乙醇，室温放置3-5min，自然风干干燥，再用80μL的TE溶液充分溶解，加入0.05μL浓度为20mg/mL的RNA酶后，室温下静置15min去除样品中的RNA，获得海马基因组DNA。
(5)样品基因组DNA浓度和质量检测
采用Thermo ND-2000超微量分光光度计检测样品中DNA浓度与纯度，记录测得的A260的吸光值、A260/A280和A260/A230的比值。取3μL提取的海马样品基因组DNA，在1％琼脂糖凝胶进行电泳检测(含有4s Green 4μL)，以1×TAE为工作液，100V电压下，电泳40min，采用BIO-RAD Gel DocTM XR+凝胶成像系统及分析系统对凝胶进行拍照、观察。
图1是本发明的实施例1提取并纯化的海马药材基因组DNA琼脂糖电泳图。其中，1：DNA Marker(DL15000)，2：线纹海马，3：大海马，4:三斑海马，5：刺海马，6：小海马，7：太平洋海马，8：鲍氏海马，9：虎尾海马。
图2是本发明的实施例1提取并纯化的海马药材基因组DNA琼脂糖电泳图。其中，1：DNA Marker(DL15000)，2：吻海马，3：棘海马，4：直立海马，5：欧洲海马，6：南非海马，7：西澳海马，8：棕海马，9：贾氏海马。
本发明方法提取的海马药材DNA，在电泳检测时在20kb处一条清晰的DNA条带，说明所提取的基因组DNA是完整的基因组DNA。采用Thermo ND-2000超微量分光光度计对本发明所得的DNA进行纯度检测，结果如表2所示，结果表明，利用本发明获得的海马药材样品DNA浓度在67-240ng/μL，260nm与280nm吸光度(A)的比值(A260/A280)和260nm与230nm吸光度(A)的比值(A260/A230)在1.8-2.0之间(A260/A280和A260/A230可作为为DNA纯度的指标，比值在1.8-2.0之间，说明DNA的纯度高，RNA和蛋白质的污染较少；反之则说明DNA的质量较差)，该结果说明利用本发明获得海马药材的DNA纯度较高。
表2本发明改良方法获取的海马样本基因组DNA检测结果
样品名称 DNA浓度(ng/μL) A260/A280 A260/A230
线纹海马 102.3 1.95 1.82
三斑海马 149.4 1.93 1.99
大海马 79.2 1.83 1.68
刺海马 116.8 1.98 1.93
小海马 120.9 1.94 1.92
太平洋海马 115.6 1.96 1.95
棘海马 197.6 1.91 1.72
贾氏海马 61.1 1.79 1.65
虎尾海马 190.8 1.94 1.90
吻海马 117.3 1.92 1.85
直立海马 113.8 1.91 1.89
鲍氏海马 118.6 1.95 1.92
西澳海马 67.6 1.85 1.72
欧洲海马 214.0 1.91 1.90
南非海马 240.3 1.94 1.94
棕海马 87.7 1.82 1.54
实施例2
改良法获得海马药材基因组DNA的CO1基因PCR扩增
材料为实施案例1中获得的五种正品海马线纹海马、大海马、三班哈马、刺海马、小海马和五种伪品海马太平洋海马、棘海马、虎尾海马、鲍氏海马和直立海马的基因组DNA，使用海马CO1基因的特异性鉴别引物HM-CO1-F：5’-TTCTCAACTAATCACAAACACATCGCCA-3’，和HM-CO1-R：5’-ACTTCAGGRTGTCCRAAGAATCAGAATAAG-3’。
PCR扩增反应总体系为25μL，包括2.5μL 10×rTaq缓冲液、2.5μL 0.25mmol/LdNTPs；上游引物和下游引物各0.4μL，浓度为20μmol/L；0.2μL rTaq DNA聚合酶，1μL上述DNA模板，双蒸水补齐至25μL体系。
PCR反应在S100TM Thermal Cycler基因扩增仪上进行扩增，具体参数如下：预变性温度94℃，时间5min；变性温度为94℃，时间为45s，退火温度54℃，时间1min，延伸温度72℃时间45s，此过程进行32个循环；终延伸温度72℃，时间15min。
取2μL海马基因组PCR扩增产物，在1％琼脂糖凝胶进行电泳检测(含有4s Green 4μl)，以1×TAE为工作液，100V电压下，电泳40min，采用BIO-RAD Gel DocTM XR+凝胶成像系统及分析系统对凝胶进行拍照、观察。
图3是以本发明的实施例1提取获得海马药材基因组DNA为模板，CO1扩增产物的琼脂糖电泳图，其中，1：DNA Marker(DL2000)，2：线纹海马样品提取DNA为模板的CO1扩增产物，3：大海马样品提取DNA为模板的CO1扩增产物，4：三斑海马样品提取DNA为模板的CO1扩增产物，5：刺海马样品提取DNA为模板的CO1扩增产物，6：小海马样品提取DNA为模板的CO1扩增产物，7：太平洋海马样品提取DNA为模板的CO1扩增产物，8：棘海马样品提取DNA为模板的CO1扩增产物，9：虎尾海马样品提取DNA为模板的CO1扩增产物，10：鲍氏海马样品提取DNA为模板的CO1扩增产物，11：直立海马样品提取DNA为模板的CO1扩增产物。
以本发明法所得海马药材基因组DNA作模板，分别用HM-CO1-F和HM-CO1-R引物对药材基因组中的CO1基因进行扩增，能得到条带清晰的图谱。10个海马药材的CO1基因，扩增成功率为100％。
对比例1
传统SDS法海马药材基因组提取
(1)传统的SDS法参考徐伟丽的方法(参见：徐伟丽,杜明,李启明,等.动物肌肉组织基因组DNA两种提取方法的比较[J].食品工业科技,2011(12):81-84)，其中SDS裂解消化液的组成为：10mmol/L Tris-HCl，25mmol/L EDTA，0.5％SDS，0.01％蛋白酶K，余量为水，pH8.0。
取海马药材正品三班海马、小海马、大海马和伪品太平洋海马、棘海马和虎尾海马的尾部肌肉20mg，加到到1.5mL离心管中，加入1.2mL SDS裂解消化液，悬浮、混匀，置于50℃下温育12h，直至肌肉组织碎块基本裂解。将消化液分装至2个1.5mL离心管总后，分别加入600μL酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，漩涡振荡器混匀，12000r/min离心10min，取上清液，转移至新管，加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)混匀重复抽提，12000r/min离心10min，取上清液，转移至新管，加入等体积的氯仿，混匀重复抽提，12000r/min离心10min，取上清液，转移至新管，加入0.8倍体积的异丙醇，-20℃放置20min，12000r/min离心10min，弃去溶液，用70％乙醇洗涤沉淀，室温晾干20min，加入30μL TE(pH8.0)溶解，4℃放置过夜。
(2)传统SDS法海马药材样品的基因组DNA浓度和纯度检测
采用Thermo ND-2000超微量分光光度计对本对比例所得的DNA进行纯度检测，结果表明，传统的SDS法获取的海马药材的基因组DNA浓度均低于20ng/μL，在260nm及280nm吸光度(A)的比值(A260/A280)和260nm及230nm吸光度(A)的比值(A260/A230)在0.86-3.32之间(A260/A280和A260/A230可作为为DNA纯度的指标，比值在1.8-2.0之间，说明DNA的纯度高，RNA和蛋白质的污染较少；反之则说明DAN的质量较差)，该结果说明传统的SDS法提取获得海马药材DNA有杂质的污染，质量较差。
表3传统的SDS法获取海马样本基因组DNA检测结果
对比例2
传统SDS法获取海马药材基因组DNA的CO1基因PCR扩增
材料为对比例1中获得的三种正品海马三班海马、小海马、大海马和三种伪品海马太平洋海马、棘海马和虎尾海马的基因组DNA，使用海马CO1基因的特异性鉴别引物HM-CO1-F：
5’-TTCTCAACTAATCACAAACACATCGCCA-3’，和HM-CO1-R：
5’-ACTTCAGGRTGTCCRAAGAATCAGAATAAG-3’。
PCR扩增反应总体系为25μL，包括2.5μL 10×rTaq缓冲液、2.5μL 0.25mmol/LdNTPs；上游引物和下游引物各0.4μL，浓度为20μmol/L；0.2μL rTaq DNA聚合酶，1μL上述DNA模板，双蒸水补齐至25μL体系。
PCR反应在S100TM Thermal Cycler基因扩增仪上进行扩增，具体参数如下：预变性温度94℃，时间5min；变性温度为94℃，时间为45s，退火温度54℃，时间1min，延伸温度72℃时间45s，此过程进行32个循环；终延伸温度72℃，时间15min。
取2μL海马基因组PCR扩增产物，在1％琼脂糖凝胶进行电泳检测(含有4s Green 4μL)，以1×TAE为工作液，100V电压下，电泳40min，采用BIO-RAD Gel DocTM XR+凝胶成像系统及分析系统对凝胶进行拍照、观察。
图4是对比例1以传统的SDS法提取获得海马药材基因组DNA为模板，CO1扩增产物的琼脂糖电泳图。其中，1：DNA Marker(DL2000)，2：三斑海马样品提取DNA为模板的CO1扩增产物，3：小海马样品提取DNA为模板的CO1扩增产物，4：大海马样品提取DNA为模板的CO1扩增产物，5：太平洋海马样品提取DNA为模板的CO1扩增产物，6：棘海马样品提取DNA为模板的CO1扩增产物，7：护卫海马样品提取DNA为模板的CO1扩增产物。
以传统的SDS法所得海马药材基因组DNA作模板，分别用HM-CO1-F和HM-CO1-R引物对药材基因组中的CO1基因进行扩增，仅有三斑海马和小海马能得到条带清晰的图谱。6个海马药材的CO1基因，仅有2个可以扩增成功，扩增成功率仅为33.3％。

Claims (6)

1.一种海马药材基因组DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)海马药材的预处理：
将海马药材加入清洗液中，在45-50℃水浴中对海马药材超声清洗5-10min，所述清洗液为：50mmol/L Tris-HCl，0.2wt％SDS，余量为水，pH 7.2；
(2)样品的裂解：
将预处理后的海马药材剪碎后，加入海马药材质量30-50倍的SDS裂解液，65℃水浴中裂解消化1-2h，期间每隔5-10min混匀一次，消化彻底后，12000r/min离心，去除未消化的固体不溶物，取上层澄清的样品消化液；
所述SDS裂解液为：100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，2wt％SDS，3wt％PVP，1％β-巯基乙醇，余量为水，pH8.0；
(3)消化液的抽提沉淀：
样品消化液中加入1.1-1.3倍体积的苯酚、氯仿和异戊醇混合液抽提后，4-5℃下12000r/min离心10-15min，取上清液加入等体积的氯仿、异戊醇混合液抽提后，4-5℃下13000r/min离心10-15min，取上清液；
(4)样品基因组DNA沉淀：
在抽提后的水相中加入0.8-1倍体积的预冷异丙醇，摇匀后于-20℃放置0.5-1h，4-5℃下13000r/min离心15-20min，弃去液相，沉淀用75％乙醇洗涤2-3次，去乙醇自然风干；再用TE溶液充分溶解，加入RNA酶后，室温静置10-15min去除样品中的RNA，获得海马基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的海马药材基因组DNA提取方法，其特征在于，所述的海马药材包括海马药材的干品、粉末、饮片及炮制后的海马药材。
3.根据权利要求1所述的海马药材基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(2)中，裂解消化期间采用微波加热法对样品裂解液处理一次，所述微波加热法处理时间在样品裂解0.5-1h后，采用微波炉解冻档处理，每加热1min后冷却2min，共处理15min。
4.根据权利要求3所述的海马药材基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(2)中，添加蛋白酶K进行消化处理，蛋白酶K浓度为10mg/mL，在裂解消化最开始和微波加热完成后，分两次在裂解液中加入蛋白酶K，每次加入的量为8-15μL。
5.根据权利要求1所述的海马药材基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(3)中，苯酚、氯仿和异戊醇混合液以体积比为25:24:1混合得到；氯仿、异戊醇混合液以体积比为24:1混合得到。
6.根据权利要求1所述的海马药材基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(4)中，RNA酶的浓度为20mg/mL，加入的体积为0.05-0.2μL。
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