CN106928347A - 一种水蛭素的分离方法 - Google Patents

一种水蛭素的分离方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106928347A
CN106928347A CN201710147089.8A CN201710147089A CN106928347A CN 106928347 A CN106928347 A CN 106928347A CN 201710147089 A CN201710147089 A CN 201710147089A CN 106928347 A CN106928347 A CN 106928347A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hirudin
separation method
freeze
sample
salt solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710147089.8A
Other languages
English (en)
Inventor
汤浩强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Foshan Love Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Foshan Love Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Foshan Love Biotechnology Co Ltd filed Critical Foshan Love Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201710147089.8A priority Critical patent/CN106928347A/zh
Publication of CN106928347A publication Critical patent/CN106928347A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种水蛭素的分离方法，包括以下步骤：在水蛭的唾液或胃液中加入盐水进行稀释；在37℃～100℃水浴加热3～300min，使样品的温度加热至36~38℃；将样品转移至带有滤膜的离心管中进行离心处理，滤膜的截留分子量为5000~10000kDa；将离心得到的滤液，静置，取上清液；对上清液进行冷冻干燥，得到水蛭素冻干粉。本发明方法步骤简单，效率高，水蛭素的活性高，可以达到400U/g以上；同时完全不需要采用有毒的溶剂，保证药物的纯正，而且对环境无污染，适合工业化生产。

Description

一种水蛭素的分离方法
技术领域
本发明涉及生物制药领域，主要涉及一种水蛭素的分离方法。
背景技术
血栓是导致心脑血管疾病发生的主要原因，而凝血酶是导致血栓形成的主要原因。水蛭素是迄今发现的最强的凝血酶特异性抑制剂，能与凝血酶特异性结合使之丧失凝血活力。目前，水蛭素主要以日本医蛭、菲牛蛭、欧洲医用水蛭、印度水蛭、亚马逊巨型水蛭等为原料提取。临床实验表明，水蛭素既能使血栓融化从而消除或缓解病情，也能防止血栓形成，具有极好的预防和治疗血栓性心血管疾病的效果。
目前，国内外提取水蛭素的方法有多种。例如1970年Markwardt采用的乙醇分级沉淀、阳离子交换、凝胶过滤以及阴离子交换等步骤获得水蛭素。中国专利—医用天然水蛭素的提取方法（申请号92107076）是将水蛭捣碎成浆状，加热，用冰醋酸调pH值，冷却至室温，用Na2CO3溶液调节pH值，离心收集滤液，沉淀用生理盐水浸提2~3次，离心收集滤液，合并滤液，透析，透析液用乙醇沉淀，收集沉淀，低温干燥的水蛭素。这些工艺存在提取步骤繁琐、水蛭利用率低、水蛭素的活性低等问题。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种水蛭素的分离方法，旨在解决现有水蛭素的提取方法存在的提取步骤繁琐、水蛭利用率低、水蛭素的活性低等问题。
本发明的技术方案如下：
一种水蛭素的分离方法，其中，包括以下步骤：
在水蛭的唾液或胃液中加入盐水进行稀释；
在37℃～100℃水浴加热3～300min，使样品的温度加热至36~38℃；
将样品转移至带有滤膜的离心管中进行离心处理，滤膜的截留分子量为5000~10000kDa；
将离心得到的滤液，静置，取上清液；
对上清液进行冷冻干燥，得到水蛭素冻干粉。
所述的水蛭素的分离方法，其中，盐水的添加量为唾液或胃液的总体积的0.4~20倍，盐水的浓度为0.1~68%。
所述的水蛭素的分离方法，其中，所述盐水采用生理盐水。
所述的水蛭素的分离方法，其中，所述水浴加热温度设置为37~50℃。
所述的水蛭素的分离方法，其中，离心过程中，转速1000~8000rpm，离心时间为1~100min。
所述的水蛭素的分离方法，其中，冷冻干燥过程，是在-40℃条件下，冷冻5h～100h。
有益效果：本发明的水蛭素的分离方法，步骤简单，效率高，水蛭素的活性高，可以达到400U/g以上；只需采用水蛭的唾液或胃液即可完成水蛭素的分离，无需杀死水蛭，大大降低了分离成本，提高水蛭的利用率；完全不需要采用有毒的溶剂，只需采用生理盐水即可完成分离，降低分离成本，同时保证药物的纯正，而且对环境无污染，适合工业化生产。
具体实施方式
本发明提供一种水蛭素的分离方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所提供的水蛭素的分离方法，以水蛭的唾液或胃液为提取对象，水蛭可重复使用，大大提高水蛭的利用率并降低水蛭素的制作成本。而且，本发明所提供的分离方法，步骤简单，水蛭素含量和活性高。
具体地，本发明所提供的水蛭素的分离方法，包括以下步骤：
稀释：在水蛭的唾液或胃液中加入盐水进行稀释；
水浴加热：在37℃～100℃水浴加热3～300min，使样品的温度加热至36~38℃；
滤膜离心：将样品转移至带有滤膜的离心管中进行离心处理，滤膜的截留分子量为5000~10000kDa；
静置：将离心得到的滤液，静置，取上清液；
冷冻干燥：对上清液进行冷冻干燥，得到水蛭素冻干粉。
其中，在稀释步骤中，采用盐水对水蛭的唾液或胃液进行稀释，使水蛭素便于分离。盐水的添加量为唾液或胃液的总体积的0.4~20倍，盐水的浓度可以为0.1~68%，优选地，所述盐水采用生理盐水。
在水浴加热步骤中，是为了使样品的温度加热至37.5℃左右，其加热的作用也是为了使水蛭素便于分离。在水浴加热的过程中，优选为对样品进行搅拌，使样品受热均匀，提高分离效率。水浴加热的时间和温度根据实际环境温度进行控制，环境温度低或水浴温度低则加热时间长，环境温度高或水浴温度高则加热时间短。优选地，为了保证样品质量，所述水浴加热温度设置为37~50℃。
在滤膜离心和静置步骤中，水蛭素的大小为7000kDa左右，因此先采用滤膜截留比水蛭素大的分子，可以截留悬浮杂质、粘度大的物质以及分子量在百万级的大分子，过滤掉这些酶类物质，酶类物质均能破坏水蛭素的化学结构而致使其活性降低进而影响水蛭素的疗效；由于水蛭素的浮力较大浮于上清液中，而剩余的小分子杂质浮力较小会沉于底部，因此，离心完毕后取滤液静置一段时间，即可得到溶解有水蛭素的上清液。在冷冻干燥前通过滤膜和静置去除大分子杂质和小分子杂质，使得冷冻干燥步骤得到的水蛭素干粉纯度高。在离心过程中，转速可以为1000~8000rpm，优选为转速1000~2500rpm，离心时间为1~100min，离心时间可以根据样品量和离心速度调节。同时，采用滤膜离心，也可以大大提高分离效率，减少分离所需时间。
在冷冻干燥中，是在-40℃条件下，冷冻5h～100h，得到含有水蛭素的冻干粉。
采用本发明所提供的水蛭素的分离方法，步骤简单，效率高，水蛭素的活性高，可以达到100~800U/g；同时完全不需要采用有毒的溶剂，保证药物的纯正，而且对环境无污染，适合工业化生产。
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
取水蛭唾液（或水蛭胃液）180ml ，加入生理盐水200ml，50℃水浴搅拌10min；将样品转移至带有滤膜的离心管中进行离心处理，滤膜的截留分子量为5000kDa，2000rpm～2500rpm离心10 min；静置20min，取上清液冷冻干燥（-40℃，35h），得水蛭素冻干粉10g。
实施例2
取水蛭唾液（或水蛭胃液）440ml ，加入生理盐水2000ml，37℃水浴搅拌10min；将样品转移至带有滤膜的离心管中进行离心处理，滤膜的截留分子量为7000kDa，2000rpm～2500rpm离心10 min；静置20min，取上清液冷冻干燥（-40℃，20h），得水蛭素冻干粉23g。
实施例3
取水蛭唾液（或水蛭胃液）500ml ，加入生理盐水250ml，40℃水浴搅拌10min；将样品转移至带有滤膜的离心管中进行离心处理，滤膜的截留分子量为10000kDa，2000rpm～2500rpm离心10 min；静置20min，取上清液冷冻干燥（-40℃，10h），得水蛭素冻干粉25g。
将实施例1~3制备得打偶的水蛭素冻干粉进行活性测试，测试方法参考《中华人民共和国药典》（一部）.北京：中国医药科技出版社，2015，p84。
精密称量取水蛭素供试样品1g，用0.9%NaCl溶解稀释成5ml。低温条件下，5000r.min-1，离心20min。精密量取提取液100 µL，置试管(8 mm x 38mm)中，加入含0.5％(牛)纤维蛋白原(以凝固物计)的Tris—HCl缓冲液200 µL，摇匀，置水浴(37±0.5)℃中缓缓滴加凝血酶溶液至凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积，按下式计算。
式中水蛭素含量单位为U/g；C1—凝血酶溶液的浓度，U/mL；C2—供试验样品的浓度，g/mL；V1—消耗凝血酶溶液的体积，µL；V2—供试样溶液的加入量，µL。
其中，三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)缓冲液的配制，取0.2moL/L三羟甲基氨基甲烷溶液25 mL与0.1 moL/L盐酸溶液约40 mL，加水至100 mL，调节pH 7.4。凝血酶溶液的配制为取凝血酶试剂适量，加生理盐水配制成每1 mL含凝血酶40个单位(临用配制)。
从每个实施例的产品取4g，分别分为四组，每组1g进行测试，活性测试结果如下表1所示。实施例1~3所得的水蛭素活性均在400U/g以上。
表1 实施例1~3的活性测试结果
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (6)

1.一种水蛭素的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
在水蛭的唾液或胃液中加入盐水进行稀释；
在37℃～100℃水浴加热3～300min，使样品的温度加热至36~38℃；
将样品转移至带有滤膜的离心管中进行离心处理，滤膜的截留分子量为5000~10000kDa；
将离心得到的滤液，静置，取上清液；
对上清液进行冷冻干燥，得到水蛭素冻干粉。
2.根据权利要求1所述的水蛭素的分离方法，其特征在于，盐水的添加量为唾液或胃液的总体积的0.4~20倍，盐水的浓度为0.1~68%。
3.根据权利要求1所述的水蛭素的分离方法，其特征在于，所述盐水采用生理盐水。
4.根据权利要求1所述的水蛭素的分离方法，其特征在于，所述水浴加热温度设置为37~50℃。
5.根据权利要求1所述的水蛭素的分离方法，其特征在于，离心过程中，转速1000~8000rpm，离心时间为1~100min。
6.根据权利要求1所述的水蛭素的分离方法，其特征在于，冷冻干燥过程，是在-40℃条件下，冷冻5h～100h。
CN201710147089.8A 2017-03-13 2017-03-13 一种水蛭素的分离方法 Pending CN106928347A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710147089.8A CN106928347A (zh) 2017-03-13 2017-03-13 一种水蛭素的分离方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710147089.8A CN106928347A (zh) 2017-03-13 2017-03-13 一种水蛭素的分离方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106928347A true CN106928347A (zh) 2017-07-07

Family

ID=59432278

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710147089.8A Pending CN106928347A (zh) 2017-03-13 2017-03-13 一种水蛭素的分离方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106928347A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107595891A (zh) * 2017-09-11 2018-01-19 重庆多普泰制药股份有限公司 一种水蛭加工工艺
CN108727487A (zh) * 2018-05-07 2018-11-02 广东海洋大学 一种水蛭素的液膜萃取方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101230087A (zh) * 2007-01-22 2008-07-30 广东海洋大学 一种以菲牛蛭冷冻新鲜体为原材料的水蛭素生产工艺
CN102286098A (zh) * 2011-08-18 2011-12-21 周维官 一种天然水蛭素的生产方法
CN102964446A (zh) * 2012-11-28 2013-03-13 周维官 一种吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法
CN104761635A (zh) * 2015-03-24 2015-07-08 靖江至高生物科技有限公司 一种水蛭素提取分离的工艺
CN104774259A (zh) * 2015-04-21 2015-07-15 虞龙 一种基于膜从水蛭中提取水蛭素的方法
CN104926937A (zh) * 2015-06-19 2015-09-23 广西复鑫益生物科技有限公司平南分公司 一种从水蛭唾液中提取水蛭素的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101230087A (zh) * 2007-01-22 2008-07-30 广东海洋大学 一种以菲牛蛭冷冻新鲜体为原材料的水蛭素生产工艺
CN102286098A (zh) * 2011-08-18 2011-12-21 周维官 一种天然水蛭素的生产方法
CN102964446A (zh) * 2012-11-28 2013-03-13 周维官 一种吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法
CN104761635A (zh) * 2015-03-24 2015-07-08 靖江至高生物科技有限公司 一种水蛭素提取分离的工艺
CN104774259A (zh) * 2015-04-21 2015-07-15 虞龙 一种基于膜从水蛭中提取水蛭素的方法
CN104926937A (zh) * 2015-06-19 2015-09-23 广西复鑫益生物科技有限公司平南分公司 一种从水蛭唾液中提取水蛭素的方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107595891A (zh) * 2017-09-11 2018-01-19 重庆多普泰制药股份有限公司 一种水蛭加工工艺
CN108727487A (zh) * 2018-05-07 2018-11-02 广东海洋大学 一种水蛭素的液膜萃取方法
CN108727487B (zh) * 2018-05-07 2021-05-07 广东海洋大学 一种水蛭素的液膜萃取方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108703989B (zh) 一种工业化制备白芸豆α-淀粉酶抑制剂的方法
CN106883304A (zh) 一种猴头菇中不同性质多糖综合制备及纯化方法
CN109527270A (zh) 水蛭特异性营养诱导液及天然水蛭素的提取方法
CN101433553B (zh) 小牛血去蛋白提取物制备方法及其冻干粉
WO2012013112A1 (zh) 盐析萃取海参中有效成分的方法
CN101195839B (zh) 白芨多糖胶精制工艺
CN105039480A (zh) 一种中华鳖源胶原蛋白的纯化方法
CN106928347A (zh) 一种水蛭素的分离方法
CN111423524B (zh) 一种荷叶多糖的提取方法
CN107033254A (zh) 垂丝海棠花多糖、提取方法及其在制备促凝血药物方面的应用
CN105131099B (zh) 一种从柞蚕丝脱胶工业废水中制备丝胶蛋白的方法
CN103884549A (zh) 一种痰细胞处理液及其应用
CN104531813B (zh) 一种山羊角活性多肽的制备方法
CN106478831A (zh) 一种牡丹多糖及其制备方法和应用
CN106222151A (zh) 一种重组枯草杆菌纤溶酶及其肠溶胶囊的制备方法
CN107652369A (zh) 一种抗凝血女贞花多糖及其提取分离方法和应用
CN105131139B (zh) 一种肺炎链球菌荚膜多糖的纯化方法
CN107082819A (zh) 一种肺炎链球菌荚膜多糖的纯化方法
CN110606880B (zh) 蚯蚓弹力蛋白与蚓激酶的联合制备工艺
CN107540756A (zh) 一种促凝血女贞花多糖及其提取分离方法和应用
CN102274241B (zh) 提取羊胚胎提取物的方法及含有该提取物的药物组合物
CN106072098A (zh) 一种西瓜霜食用凝胶的制备方法
CN110093335A (zh) 一种沙蚕激酶的提取方法
CN104814244A (zh) 一种高纯度甘薯蛋白的提取方法
CN114249805B (zh) 一种活性大分子蚕丝胶蛋白的制备方法及其干片

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170707

RJ01 Rejection of invention patent application after publication