CN107033254A - 垂丝海棠花多糖、提取方法及其在制备促凝血药物方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种垂丝海棠花多糖的提取方法，具体为：1）将垂丝海棠花粉碎，常温下依次用石油醚、70±5%乙醇浸提，过滤，烘干残渣，然后用蒸馏水提取，滤液减压浓缩，然后醇沉，沉淀干燥后用蒸馏水溶解，采用Sevag法脱除蛋白，将得到的上清液减压浓缩后再次醇沉，沉淀干燥后用蒸馏水溶解，透析，冷冻干燥即得粗多糖；2）将粗多糖用蒸馏水溶解，上样到DEAE‑52色谱柱，分别用0.0、0.1、0.2 mol/L NaCl进行梯度洗脱，收集合并组分相同的溶液，减压浓缩，透析，冷冻干燥；再次用蒸馏水溶解，上样到Sephadex G‑100色谱柱中用蒸馏水洗脱，合并组分相同的溶液，减压浓缩后冷冻干燥即得。凝血试验表明垂丝海棠花多糖具有一定的体外促凝血活性，可作为一种潜在的止血药。

Description

垂丝海棠花多糖、提取方法及其在制备促凝血药物方面的 应用

技术领域

本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种垂丝海棠花多糖、提取纯化方法以及其在促凝血方面的新用途。

背景技术

垂丝海棠（Malus halliana Koehne）是蔷薇科苹果属植物。垂丝海棠花，气微，味微苦、涩，性平，入肝经。主治血崩，调经和血。文献研究发现：垂丝海棠具有保肝、抗氧化、体外抑制α-葡萄糖苷酶活性，而且垂丝海棠花、叶和果实中都有一定的活性成分，药用价值较高。对垂丝海棠的研究主要集中在园林美化、栽培繁育、保健饮料、生物活性等方面；对其化学成分研究发现：主要为烷烃类化合物且绝大多数为饱和烷烃，还包括烯烃、芳香酸类、醛类、醇类、酯类等多种化合物。

血液凝固的本质，是一系列复杂的酶促反应。在凝血酶的作用下，血浆中可溶性纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白。根据凝血因子的活化途径和凝血因子的差异，可分为内源性凝血途径、外源性凝血途径和凝血共同途径。外源性凝血途径是从组织因子暴露于血液而启动，到因子X被激活的过程；临床上以凝血酶原时间（PT）测定来反映外源性凝血途径的状况。内源性凝血途径是指从因子XII激活，到因子X激活的过程；临床上以活化部分凝血活酶时间（APTT）来反映体内内源性凝血途径的状况。从因子X被激活至纤维蛋白形成，是内、外源共同凝血途径；主要包括凝血酶生成和纤维蛋白形成两个阶段。目前，尚无有关垂丝海棠花多糖对促凝血影响的相关报道。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种垂丝海棠花多糖、提取方法及其在制备促凝血药物方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种垂丝海棠花多糖的提取方法，其包括如下步骤：

1）制备粗多糖：将垂丝海棠花粉碎，在常温条件下依次用石油醚、70±5%乙醇进行浸提，浸提结束后过滤，烘干残渣，然后用蒸馏水于90±5℃进行提取，提取结束后趁热抽滤，滤液减压浓缩获得浓缩液，然后向浓缩液中加入乙醇使终浓度为70±2%，静置，离心得一次沉淀，一次沉淀干燥后用蒸馏水溶解，采用Sevag法脱除蛋白，将得到的上清液减压浓缩后再次加入乙醇并使终浓度为70±2%，静置，离心得二次沉淀（即粗多糖沉淀），干燥，加入蒸馏水溶解后，透析，透析结束后冷冻干燥即得粗多糖；

2）将粗多糖用蒸馏水溶解，0.45 μm微孔滤膜过滤，上样到DEAE-52色谱柱，依次用蒸馏水、0.1 mol/L氯化钠溶液和0.2 mol/L氯化钠溶液进行洗脱，洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，测490 nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，合并同一洗脱峰的多糖样品，减压浓缩，透析，冷冻干燥；其中，蒸馏水的洗脱峰为组分1，0.1 mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分2，0.2 mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分3；

3）组分1用蒸馏水溶解，0.22 μm微孔滤膜过滤，上样到Sephadex G-100色谱柱，用蒸馏水进行洗脱，采用苯酚-硫酸法进行检测，测其在490 nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，得到单一洗脱峰，减压浓缩、冷冻干燥后得到的多糖组分命名为MHP-W；

4）组分2和3均采用步骤3）同样的方法进行洗脱，得到单一洗脱峰，减压浓缩、冷冻干燥后得到的多糖组分分别命名为MHP-1和MHP-2；

垂丝海棠花多糖即为MHP-W、MHP-1和MHP-2中的一种或两种以上的混合物。

具体的，步骤1）中蒸馏水提取时料液的体积比为1 g：15－25 g，每次提取2－4 h，共提取2－4次。石油醚、70±5%乙醇进行浸提时，每次浸提2－4天，共浸提2－4次。，

进一步优选的，步骤1）和2）中，透析在透析袋中进行，透析袋截留分子量为8000－14000，透析2－3天，每4－6 h更换一次蒸馏水。

采用上述提取方法制备得到的垂丝海棠花多糖。

本发明还提供了上述垂丝海棠花多糖在制备促凝血药物方面的应用，也即在制备止血药方面的应用。

和现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明从垂丝海棠花中提取分离获得了垂丝海棠花精制多糖，其包括三个新多糖组分：MHP-W、MHP-1和MHP-2，并对垂丝海棠花精制多糖的体外凝血效果进行考察。本发明通过采用凝血活性模型，筛选对APTT、PT、TT和FIB的作用，测定垂丝海棠花多糖对凝血四项的影响，考察其体外促凝血作用。试验结果表明：垂丝海棠花多糖MHP-W、MHP-1和MHP-2具有一定的体外促凝血活性，因而垂丝海棠花多糖可以作为一种潜在的止血药。

附图说明

图1为经SephadexG-100色谱柱洗脱得到的垂丝海棠花精制多糖组分MHP-W、MHP-1和MHP-2的洗脱曲线图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

下述实施例中所用垂丝海棠花采集于河南大学金明校区，为蔷薇科苹果属植物垂丝海棠花。实施例中乙醇浓度如无特殊说明，均指的是体积浓度。

实施例1 垂丝海棠花多糖的提取

一种垂丝海棠花多糖的提取方法，其以垂丝海棠花为原料，具体包括如下步骤：

1）制备粗多糖：将500 g垂丝海棠花粉碎，在常温条件下依次用石油醚、70%乙醇进行浸提（石油醚、70%乙醇添加量以浸没垂丝海棠花为宜，石油醚、70%乙醇均各浸提3次，每次浸提3天），浸提结束后过滤，将所得残渣烘干。然后用蒸馏水于90℃下进行热水提取（提取时料液比为1 g：20 g，每次提取3 h，共提取3次）。提取结束后趁热用布氏漏斗抽滤，合并滤液，用旋转蒸发仪在48℃下减压浓缩获得浓缩液。向浓缩液中加入95%乙醇并使终浓度为70%，于4℃静置24 h，8000 r/min离心15 min得沉淀，沉淀干燥后用蒸馏水溶解，采用Sevag法脱除蛋白（具体为：将溶解有沉淀的蒸馏水与Sevag试剂按5：1的体积比混合，震荡离心分层，将中间变性蛋白质和下层有机溶剂除去，将上清液按上述步骤重复操作5-10次，直到无变性蛋白质出现；Sevag试剂为体积比5:1的氯仿、正丁醇混合液），将得到的上清液减压浓缩后加入再次加入95%乙醇并使终浓度为70%，于4℃静置24 h，8000 r/min离心15 min得粗多糖沉淀，干燥，加入蒸馏水溶解后，用透析袋在4℃下透析2 天（透析袋截留分子量为8000－14000，透析目的用以除去小分子及离子），每4 h更换一次蒸馏水，透析结束后冷冻干燥（在冷冻干燥机中进行，-40℃真空冷冻干燥10-12 h，下同）即得粗多糖；

2）将250 mg粗多糖用8 mL蒸馏水溶解，0.45 μm微孔滤膜过滤，上样到DEAE-52色谱柱（2.5×60 cm）中，恒流泵的流速为0.8 mL/min，依次用蒸馏水、0.1 mol/L氯化钠溶液和0.2mol/L氯化钠溶液进行洗脱，用自动收集器收集每管6 mL，洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，用酶标仪测490 nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，合并同一洗脱峰的多糖样品，50℃下减压浓缩，透析（用透析袋在4℃下透析2 天，透析袋截留分子量为8000－14000，每4 h更换一次蒸馏水），透析结束后放入冷冻干燥机中冷冻干燥；其中，蒸馏水的洗脱峰为组分1，0.1 mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分2，0.2 mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分3；

3）取50 mg组分1用4 mL蒸馏水溶解，0.22 μm微孔滤膜过滤，上样到Sephadex G-100色谱柱（1.5×100 cm），用蒸馏水进行洗脱（恒流泵的流速为0.4 mL/min，用自动收集器收集每管4 mL），采用苯酚-硫酸法进行检测，酶标仪测其在490 nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，得到单一洗脱峰，50℃减压浓缩、冷冻干燥机中冷冻干燥后得到的多糖组分命名为MHP-W；

4）组分2和3均采用步骤3）同样的方法进行洗脱，得到单一洗脱峰，50℃减压浓缩、冷冻干燥机中冷冻干燥后得到的多糖组分分别命名为MHP-1和MHP-2；其洗脱曲线图如图1所示；

垂丝海棠花多糖即为MHP-W、MHP-1和MHP-2中的一种或两种以上的混合物。

实施例2 垂丝海棠花多糖的抗凝血试验。

方法：家兔体外血浆凝血四项检测。

仪器和材料：TGL-16gR高速台式冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；HF6000-4半自动凝血分析仪（南方汉方医疗器械有限公司）；LRH-150生化培养箱（上海一恒科技有限公司）；氯化钠注射液；0.109 mol/L枸橼酸钠溶液、注射用灯盏花素（湖南恒生制药有限公司，20110202）；活化部分凝血酶时间（APTT）测定试剂盒（1121911）、凝血酶原时间（PT）测定试剂盒（105295）、凝血酶时间（TT）测定试剂盒（121168）、纤维蛋白原（FIB）含量测定试剂盒（132107）均由上海太阳生物技术有限公司生产。

实验动物：雄性兔，体重1.8～2.4 kg，购于河南省动物中心（河南郑州），在25±2℃和湿度45-65％，12/12小时光暗环境中循环饲养，可自由获得水和食物，动物饲养于标准笼。

1.样品溶液的配制

称取MHP-W，MHP-1和MHP-2各1 mg溶解于200 μL生理盐水，制得浓度为5 mg/mL的溶液。称取灯盏花素8 mg溶解于600 μL生理盐水，制得浓度为13.33 mg/mL的溶液。云南白药的浓度为5 mg/mL，与本发明所制得的垂丝海棠花多糖浓度相同。

2 .APTT的检测方法

血浆的制备方法：雄兔耳缘静脉取血3.6 mL，放入含有400 μL浓度为0.109 mol/L的枸橼酸钠的离心管中，轻轻颠倒混匀，3000 rpm离心15 min，取上层清液，备用。

在测试杯中加入25 μL样品溶液，再加入100 μL血浆和37℃预温的APTT试剂100 μL，于37℃孵育5 min后加入37℃预温下的0.025 mol/L CaCl₂溶液100 μL，记录凝固时间，即为APTT值。

3. PT的检测方法

血浆的制备方法同上。在测试杯中加入25 μL的样品溶液，再加入100 μL的血浆，37℃孵育3 min后加入37℃预温的PT试剂200 μL，记录凝固时间，即为PT值。

4 .TT的检测方法

血浆的制备方法同上。在测试杯中加入50 μL样品溶液和200 μL的血浆，孵育3 min后加入TT试剂200 μL，记录凝固时间，即为TT值。

5 .FIB的检测方法

血浆的制备方法同上。按照说明书绘制标准曲线。取200 μL血浆和100 μL样品溶液，然后加入700 μL FIB缓冲液（购买的试剂盒中所含），混匀。取前述稀释后的血浆200 μL，37℃预温3 min，加入100 μL FIB凝血酶溶液（FIB凝血酶溶液是用2.5ml FIB缓冲液稀释FIB凝血酶所得，FIB凝血酶为购买的试剂盒中所含），记录纤维蛋白原的含量，即为FIB值。

6. 数据处理

结果采用算术平均值+标准偏差表示，数值统计采用SPSS19.0软件单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行组间比较，组间差异采用LSD（least significant difference）检测方法，其中P<0.05说明具有统计学意义，图均用GrapPad Prism软件绘制。结果见表1。

与空白组比较, ***p<0.001；与灯盏花素组比较,^### p<0.001；

与云南白药组比较,^￥￥￥ p<0.001。

本发明通过对垂丝海棠花多糖的提取来研究多糖组分MHP-W、MHP-1和MHP-2对APTT、PT、TT和FIB的作用。由表1可以看出：与空白组比较，MHP-W能极显著地缩短TT（p<0.001），并且其作用效果强于阳性对照云南白药（p<0.001），同时MHP-W能显著地升高FIB（p<0.05），据此推测它们通过内、外源性凝血途径以及提高纤维蛋白原的含量促进血液凝固。MHP-1能显著地缩短APTT（p<0.001），其效果强于阳性对照云南白药（p<0.001），并且极显著地延长PT（p<0.001），其效果与阳性对照灯盏花素相似。此外MHP-1还能极显著地缩短TT（p<0.001），但其作用效果弱于阳性对照云南白药（p<0.001），说明它们通过内、外源性凝血途径和凝血共同途径促进血液凝固。MHP-2能极显著地缩短APTT和TT（p<0.001），同时MHP-2显著地延长PT（p<0.05），但其效果弱于阳性对照灯盏花素；MHP-2能极显著地升高FIB（p<0.001），说明它们通过内、外源性凝血途径和凝血共同途径以及提高纤维蛋白原的含量促进血液凝固。分析以上数据，可以得出结论，垂丝海棠花多糖组分MHP- W、MHP-1、MHP-2具有一定的体外促凝血活性，可以作为一种潜在的止血药。

Claims (6)

1.一种垂丝海棠花多糖的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）制备粗多糖：将垂丝海棠花粉碎，在常温条件下依次用石油醚、70±5%乙醇进行浸提，浸提结束后过滤，烘干残渣，然后用蒸馏水于90±5℃进行提取，提取结束后趁热抽滤，滤液减压浓缩获得浓缩液，然后向浓缩液中加入乙醇使终浓度为70±2%，静置，离心得一次沉淀，一次沉淀干燥后用蒸馏水溶解，采用Sevag法脱除蛋白，将得到的上清液减压浓缩后再次加入乙醇并使终浓度为70±2%，静置，离心得二次沉淀，干燥，加入蒸馏水溶解后，透析，透析结束后冷冻干燥即得粗多糖；

2）将粗多糖用蒸馏水溶解，0.45 μm微孔滤膜过滤，上样到DEAE-52色谱柱，依次用蒸馏水、0.1 mol/L氯化钠溶液和0.2 mol/L氯化钠溶液进行洗脱，洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，测490 nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，合并同一洗脱峰的多糖样品，减压浓缩，透析，冷冻干燥；其中，蒸馏水的洗脱峰为组分1，0.1 mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分2，0.2 mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分3；

3）组分1用蒸馏水溶解，0.22 μm微孔滤膜过滤，上样到Sephadex G-100色谱柱，用蒸馏水进行洗脱，采用苯酚-硫酸法进行检测，测其在490 nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，得到单一洗脱峰，减压浓缩、冷冻干燥后得到的多糖组分命名为MHP-W；

4）组分2和3均采用步骤3）同样的方法进行洗脱，得到单一洗脱峰，减压浓缩、冷冻干燥后得到的多糖组分分别命名为MHP-1和MHP-2；

垂丝海棠花多糖即为MHP-W、MHP-1和MHP-2中的一种或两种以上的混合物。

2.如权利要求1所述垂丝海棠花多糖的提取方法，其特征在于，步骤1）中蒸馏水提取时料液比为1 g：15－25 g，每次提取2－4 h，共提取2－4次。

3.如权利要求1所述垂丝海棠花多糖的提取方法，其特征在于，步骤1）和2）中，透析在透析袋中进行，透析袋截留分子量为8000－14000，透析2－3天，每4－6 h更换一次蒸馏水。

4.采用权利要求1至3任一所述提取方法制备得到的垂丝海棠花多糖。

5.权利要求4所述垂丝海棠花多糖在制备促凝血药物方面的应用。

6.权利要求4所述垂丝海棠花多糖在制备止血药方面的应用。