CN110025629A - 垂丝海棠花多糖在制备免疫增强药物方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种在制备免疫增强药物方面的应用。本发明使用环磷酰胺建立小鼠免疫力低下模型，测定小鼠脾脏指数、胸腺指数、炭粒廓清能力、血清溶血素含量、脾淋巴细胞增殖能力、小鼠血清及脾组织中LDH和ACP的含量、细胞因子（IL‑2、IL‑6、TNF‑α、IFN‑γ）的含量及mRNA表达、小鼠血清及脾组织中的氧化指标等，试验结果表明：垂丝海棠花多糖可有效改善环磷酰胺引起的免疫抑制和氧化应激，增强小鼠免疫能力；说明垂丝海棠花多糖可以增强小鼠免疫力，用作制备免疫增强药物。

Description

垂丝海棠花多糖在制备免疫增强药物方面的应用
技术领域
本发明属于多糖药物技术领域，具体涉及一种垂丝海棠花多糖在制备免疫增强药物方面的应用。
背景技术
垂丝海棠(Malus halliana Koehne)为蔷薇科苹果属落叶乔木，别名海棠、垂枝海棠，是中国的特有植物。分布于四川、安徽、陕西、浙江和云南等地，主要为观赏植物栽培，有重瓣、白花等变种。其味淡、苦，性平，入肝经，具有调经和血的功效，主治血崩。药理研究表明，垂丝海棠花具有保肝、抗氧化、体外α-葡萄糖苷酶抑制、体外抗凝血等生物活性。如，中国专利申请CN201710333531.6公开了一种垂丝海棠花多糖、提取方法及其在制备促凝血药物方面的应用；专利申请CN201810039139.5公开了一种垂丝海棠花多糖及其提取方法和在制备治疗功能性便秘药物方面的应用。
垂丝海棠花的化学研究主要集中在黄酮类化合物。多糖作为生物大分子目前已发现在免疫调节和免疫系统衡态维持等方面发挥着重要的作用。但是，目前未见有关垂丝海棠花多糖的体内活性研究。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种垂丝海棠花多糖在制备免疫增强药物方面的应用，其治疗效果显著，且无毒副作用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种垂丝海棠花多糖在制备免疫增强药物方面的应用。
上述垂丝海棠花多糖在制备免疫增强药物方面的应用，具体的，垂丝海棠花多糖的适宜用量为16-50mg/kg。
具体的，上述垂丝海棠花多糖经下述步骤制备获得：将干燥的垂丝海棠花用石油醚加热回流，然后取残渣用乙醇浸泡，浸泡结束后取出残渣并加水煎煮，煎煮结束后过滤，滤液加95％乙醇至终浓度为70―85％，静置，取沉淀物，分别用无水乙醇、丙酮、石油醚淋洗，淋洗后所得沉淀即为垂丝海棠花多糖。
进一步优选的，上述垂丝海棠花多糖经下述步骤制备获得：将干燥的垂丝海棠花用石油醚加热回流2―4次，每次加热回流时间为1―4h；然后取残渣用60―80％乙醇浸泡2―4次，每次浸泡24±12h；浸泡结束后取出残渣并加水煎煮2―4次，每次煎煮2―4h，煎煮结束后过滤，合并滤液并加入95％乙醇至终浓度为70―85％，静置，取沉淀物，分别用无水乙醇、丙酮、石油醚淋洗，用水复溶，复溶液浓缩后经冷冻干燥即得垂丝海棠花多糖。
环磷酰胺为常用抗肿瘤药物，对多种肿瘤均有一定治疗作用。环磷酰胺无体外活性，主要通过肝脏P450酶水解进而发挥作用，其可引起免疫抑制和氧化应激反应。免疫功能较为复杂，涉及机体各个方面，所以关于免疫功能的影响需涉及多个方面。垂丝海棠花多糖是否同时具有免疫调节的作用，值得研究。本发明使用环磷酰胺腹腔注射建立小鼠免疫低下模型，研究了垂丝海棠花多糖增强免疫力方面的作用。
本发明利用垂丝海棠花多糖给予小鼠灌胃600mg/(kg·d)、400mg/(kg·d)、200mg/(kg·d)，注射环磷酰胺80mg/(kg·d)，建立小鼠免疫抑制模型，了解小鼠免疫情况。本发明测定了小鼠脾脏指数、胸腺指数、炭粒廓清能力、血清溶血素含量、脾淋巴细胞增殖能力，同时测定小鼠血清及脾组织中LDH和ACP的含量；同时测定了细胞因子(IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ)的含量及mRNA表达，以及小鼠血清及脾组织中的氧化指标。经试验发现：垂丝海棠花多糖能够增强小鼠的免疫力，具有较好的免疫增强功效，可用于制备免疫增强药物。
附图说明
图1为垂丝海棠花多糖对细胞因子mRNA表达的影响，图中，与空白组相比：*P<0.05，*P<0.01，***P<0.001；与模型组相比：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
下述应用试验中所用垂丝海棠花多糖经下述步骤获得：将960g干燥的垂丝海棠花，用2L石油醚加热回流3次(每次加热回流时间为2h)；然后取残渣用20L 70％乙醇浸泡3次(每次浸泡24h)。浸泡结束后捞出残渣并加入25L蒸馏水，煎煮3次每次煎煮3h，煎煮结束后过滤，合并滤液并加入95％乙醇至终浓度为80％左右。静置24h，取沉淀物，分别用无水乙醇、丙酮、石油醚各淋洗3次，阴凉处放至无有机试剂气味，蒸馏水复溶，复溶液浓缩后经冷冻干燥即得到垂丝海棠花多糖，约114g。
应用试验
一、试验动物
SPF级昆明小鼠，雌雄各半，20-22g。购买于河南省实验动物中心，许可证号：SCXK(豫)2017-0004。实验前适应性饲养1周(温度25±2℃，光照12h/d，湿度40～45％)，喂养标准饲料，自由饮水。
二、试验试剂与仪器
环磷酰胺Cyclophosphamide(批号：17110825，江苏恒瑞制药有限公司)；印度墨汁(批号：171225，Phygene)；RPMI-1640培养基(批号：20181015，Solarbio，北京索莱宝科技有限公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)，红细胞裂解液(Solarbio，北京索莱宝科技有限公司)，刀豆蛋白A(ConA，美国Sigma公司)，脂多糖(LPS，美国Sigma公司)，CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所)；乳酸脱氢酶(LDH)和酸性磷酸酶(ACP)测定试剂盒(批号：20181108、20181113，均为南京建成科技有限公司)；总超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)和过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒(批号：20181108、20181110、20181113、20181114，均为南京建成科技有限公司)；小鼠白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒(批号：201805，均为南京森贝伽生物科技有限公司)；Trizol试剂(康为世纪生物科技有限公司)；PrimeScriptTMRT reagent kitwith Gdna Eraser试剂盒、TB GreenTM EX TaqTMⅡ(Tli RNadeH Plus)，Bulk试剂盒(TaKaRa公司)。
Multiskan GO全波长酶标仪(Thermo Electron)，CO2细胞培养箱(Thermoscientific)，7500 Real Time PCR System(Thermo Fisher)。
三、统计学处理
采用SPSS19.0软件单因素方差分析法(One-Way ANOVA)对数据进行统计处理。
四、实验分组及给药
昆明小鼠按体重随机分为5组，每组10只，雌雄各半。高中低剂量组分别灌胃600、400、200mg/kg垂丝海棠花多糖，模型组、空白组灌胃生理盐水，连续给药21天，模型组、高、中、低剂量组于给药第18、19、20、21天腹腔注射环磷酰胺80mg/kg，空白组注射生理盐水。末次给药后，小鼠禁食不禁水12h，称重，脱颈处死。
五、指标测定
1、胸腺指数和脾脏指数的测定
取脾脏和胸腺，冷生理盐水清洗，称重，计算小鼠脾脏指数和胸腺指数。胸腺指数＝胸腺重量(mg)/体重(10g)；脾脏指数＝脾脏重量(mg)/体重(10g)。
2、碳粒廓清的测定
尾静脉注射印度墨汁(10倍稀释)0.1ml/10g，分别于5min(t1)、15min(t2)眼眶取血20μL溶于2mL 0.1％Na2CO3溶液中，680nm测吸光度(OD1,OD2)，计算廓清指数K值，脱颈处死小鼠，取肝脏、脾脏称重，计算吞噬指数A。
3、鸡红细胞溶血素测定
给药第7d腹腔注射5％的鸡红细胞生理盐水混悬液0.2mL引起小鼠免疫反应。末次给药后，取血，离心，取血清用生理盐水稀释100倍，取稀释血清1mL，与5％鸡红细胞悬液0.5mL、补体(10％豚鼠血清)0.5mL混合，在37℃保温30min后，冰水浴终止反应。离心，取上清液540nm处测定吸光度(OD)。
4、脾淋巴细胞增殖能力测定
小鼠脱颈处死后，75％乙醇浸泡3min，无菌超净台内取脾脏，冷PBS清洗，剪碎，一次性注射器活塞胶头研磨过200目筛，1500r/min离心10min，弃上清，加3倍体积红细胞裂解液吹打均匀，冰上反应15min裂解红细胞，1500r/min离心10min弃上清，加入RPMI-1640培养基终止裂解洗去裂解液，1500r/min离心10min，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬，37℃，5％CO2培养24h后去除贴壁细胞，得原代脾细胞，台盼蓝染色，细胞计数，活细胞率在90～93％。
脾原代细胞按1×105个/孔接种到96孔细胞培养板中，以LPS和Con A为诱导剂，各组中分别加入LPS(终浓度1μg/mL)或Con A(终浓度5μg/mL)，37℃，5％CO2培养68h后每孔加入10μL CCK-8继续培养4h，450nm测定吸光度(OD)值。以加入LPS或Con A的为诱导组，未加诱导剂的为对照组，依照下列公式计算各组的细胞增殖率。
5、细胞因子含量测定及mRNA表达
眼球取血，静置30min，4℃，3500r/min离心10min，取血清，ELISA试剂盒测定IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ含量。
取脾脏，冷PBS清洗，称重，冰上剪碎，然后提取RNA，测定RNA浓度和纯度。逆转录试剂盒进行RNA逆转录，逆转录的cDNA于-20℃保存。采用RT-PCR试剂盒进行反应，按照程序进行PCR扩增。以GAPDH为内参，IL-2、IL-6、TNF-α和FN-γ基因表达计算采用2-ΔΔCT方法。
6、乳酸脱氢酶(LDH)和酸性磷酸酶(ACP)及抗氧化应激能力测定
小鼠眼球取血，静置30min，4℃、3500r/min离心10min，取血清。取脾脏，冷生理盐水清洗，称重，制作相应浓度的组织匀浆。测定血清和脾组织匀浆LDH、ACP、SOD、MDA、CAT、AOC活性。
六、垂丝海棠花多糖增强免疫力的结果与分析
1、垂丝海棠花多糖对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响
垂丝海棠花多糖对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响见表1。由表1可以看出：与空白组相比，模型组的脾脏指数和胸腺指数显著降低(P<0.001)；与模型组相比，垂丝海棠花多糖高中低三个剂量组的脾脏指数显著升高(P<0.05，P<0.01)，垂丝海棠花多糖高和中剂量组显著升高了小鼠胸腺指数(P<0.05，P<0.01)，低剂量组虽然可以升高小鼠胸腺指数，但与模型组相比没有统计学意义的差异。
表1垂丝海棠花多糖对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响(n＝10)
与空白组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。
2、垂丝海棠花多糖对小鼠炭粒廓清能力的影响
垂丝海棠花多糖对小鼠炭粒廓清能力的影响见表2。由表2可知：与空白组相比，模型组的廓清指数K和吞噬指数A显著降低(P<0.001)；与模型组相比，垂丝海棠花多糖高中低三个剂量组的廓清指数K和吞噬指数A均显著升高(P<0.05，P<0.01)。
表2垂丝海棠花多糖对小鼠炭粒廓清能力的影响(n＝10)
与空白组相比：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
与模型组相比：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。
3、垂丝海棠花多糖对小鼠血清溶血素水平的影响
垂丝海棠花多糖对小鼠血清溶血素水平的影响见表3。由表3可知：与空白组相比，模型组小鼠中的血清溶血素水平显著降低(P<0.001)；与模型组相比，垂丝海棠花多糖高、中、低剂量组的血清溶血素水平显著升高(P<0.01，P<0.001)，但没有剂量依赖性。
表3垂丝海棠花多糖对小鼠血清溶血素水平的影响(n＝10)
与空白组相比：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
与模型组相比：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；
与高剂量组相比：△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001。
4、垂丝海棠花多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响
垂丝海棠花多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响见表4。由表4可知，LPS和ConA分别诱导后，模型组的B淋巴细胞增殖能力和T淋巴细胞增殖能力显著低于空白组(P<0.001)；与模型组相比，垂丝海棠花多糖高、中剂量组淋巴细胞增殖能力显著提高，低剂量组淋巴细胞增殖能力虽有所增加，但无统计学意义差异。
表4垂丝海棠花多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响(n＝10)
与空白组相比：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
与模型组相比：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。
5、垂丝海棠花多糖对小鼠ACP和LDH含量的影响
垂丝海棠花多糖对血清ACP和LDH活性的影响见表5，垂丝海棠花多糖对脾组织ACP和LDH活性的影响见表6。由表5可知：模型组血清中ACP和LDH活性均显著低于空白组(P<0.01)；与模型组相比，垂丝海棠花多糖高剂量组、中剂量组的ACP及LDH活性均显著增高(P<0.05，P<0.01)，垂丝海棠花多糖低剂量组ACP活性显著增高(P<0.05)，LDH活性虽有增高但无统计学差异。由表6可知：模型组脾组织匀浆中ACP和LDH活性均显著低于空白组(P<0.001)；与模型组相比，垂丝海棠花多糖高、中、低剂量组ACP和LDH活性均显著增高(P<0.05，P<0.01)。
表5垂丝海棠花多糖对血清ACP和LDH活性的影响(n＝10)
与空白组相比：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
与模型组相比：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。
表6垂丝海棠花多糖对脾组织ACP和LDH活性的影响(n＝10)
与空白组相比：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
与模型组相比：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。
6、垂丝海棠花多糖对小鼠细胞因子含量的影响
垂丝海棠花多糖对小鼠细胞因子含量的影响见表7。由表7可知：模型组血清中IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ含量显著低于空白组(P<0.01，P<0.001)；与模型组相比，垂丝海棠花多糖高、中剂量组血清中IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α的含量显著增高(P<0.01，P<0.001)，低剂量组血清中IL-2、IL-6、IFN-γ的含量显著增高(P<0.001)；TNF-α的含量较模型组有所增加，但没有显著差异。
表7垂丝海棠花多糖对小鼠细胞因子含量的影响(n＝10)
与空白组相比：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
与模型组相比：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；
与高剂量组相比：△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001。
7、垂丝海棠花多糖对小鼠细胞因子mRNA表达的影响
垂丝海棠花多糖对细胞因子mRNA表达的影响见图1。由图1可知：模型组脾组织中IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ的mRNA表达显著低于空白组(P<0.001，P<0.01)；与模型组相比，垂丝海棠花多糖高剂量组脾组织中IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的mRNA表达显著增高(P<0.05，P<0.001)；中剂量组脾组织中IL-6、IFN-γ和TNF-α的mRNA表达显著增高(P<0.05，P<0.001)，IL-2虽有增高但无统计学差异；低剂量组IL-2、IL-6、和IFN-γ的mRNA表达显著增高(P<0.001)，但TNF-α无差异。
8、垂丝海棠花多糖对小鼠抗氧化能力的影响
垂丝海棠花多糖对血清中SOD、MDA、T-AOC和CAT活性的影响见表8，垂丝海棠花多糖对脾组织中SOD、MDA、T-AOC和CAT活性的影响见表9。由表8可知：模型组血清中SOD、CAT和T-AOC活性均显著低于空白组(P<0.001)，MDA含量显著高于空白组(P<0.001)；与模型组相比，垂丝海棠花多糖高、中、低剂量组SOD、CAT和T-AOC活性均显著增高(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，MDA含量显著降低(P<0.001)。由表9可知：模型组脾组织匀浆中SOD、CAT和T-AOC活性均显著低于空白组(P<0.001，P<0.01)，MDA含量显著高于空白组(P<0.001)；与模型组相比，垂丝海棠花多糖高中低三个剂量组的SOD、T-AOC和CAT活性均显著增高(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，MDA含量显著降低(P<0.001)。
表8垂丝海棠花多糖对血清中SOD、MDA、T-AOC和CAT活性的影响(n＝10)
与空白组相比：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
与模型组相比：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。
表9垂丝海棠花多糖对脾组织中SOD、MDA、T-AOC和CAT活性的影响(n＝10)
与空白组相比：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
与模型组相比：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。
通过上述测定小鼠脾脏指数、胸腺指数、炭粒廓清能力、血清溶血素含量、脾淋巴细胞增殖能力、小鼠血清及脾组织中LDH和ACP的含量、细胞因子(IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ)的含量及mRNA表达，以及小鼠血清及脾组织中的氧化指标等参数，我们发现：垂丝海棠花多糖可以提高脾脏指数和胸腺指数，增强小鼠炭粒廓清能力、单核吞噬细胞的吞噬能力，促进脾淋巴细胞增殖，增强小鼠血清溶血素含量、巨噬细胞活性，提高细胞因子(IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ)的含量及促进mRNA表达；同时，垂丝海棠花多糖改善了环磷酰胺引起的氧化应激。
上述结果表明：垂丝海棠花多糖可有效改善环磷酰胺引起的免疫抑制和氧化应激，增强小鼠免疫能力。说明垂丝海棠花多糖具有较好的免疫增强功效，可用于制备免疫增强药物。

Claims (4)

1.垂丝海棠花多糖在制备免疫增强药物方面的应用。
2.如权利要求1所述垂丝海棠花多糖在制备免疫增强药物方面的应用，其特征在于，垂丝海棠花多糖用量为16-50 mg/kg。
3.如权利要求1所述垂丝海棠花多糖在制备免疫增强药物方面的应用，其特征在于，所述垂丝海棠花多糖经下述步骤制备获得：将干燥的垂丝海棠花用石油醚加热回流，然后取残渣用乙醇浸泡，浸泡结束后取出残渣并加水煎煮，煎煮结束后过滤，滤液加95%乙醇至终浓度为70―85%，静置，取沉淀物，分别用无水乙醇、丙酮、石油醚淋洗，淋洗后所得沉淀即为垂丝海棠花多糖。
4.如权利要求1所述垂丝海棠花多糖在制备免疫增强药物方面的应用，其特征在于，将干燥的垂丝海棠花用石油醚加热回流2―4次，每次加热回流时间为1―4 h；然后取残渣用60―80%乙醇浸泡2―4次，每次浸泡24 ±12 h；浸泡结束后取出残渣并加水煎煮2―4次，每次煎煮2―4 h，煎煮结束后过滤，合并滤液并加入95%乙醇至终浓度为70―85%，静置，取沉淀物，分别用无水乙醇、丙酮、石油醚淋洗，用水复溶，复溶液浓缩后经冷冻干燥即得垂丝海棠花多糖。
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