CN110093335B - 一种沙蚕激酶的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种沙蚕激酶的提取方法，包括沙蚕预处理，添加缓冲液匀浆，挤压过滤，酶解及沙蚕激酶活化，高温除杂，混合分级盐析，先用低浓度的混合盐溶液进行盐析去除杂质，再用高浓度的混合盐溶液进行盐析收集富含目标蛋白的沉淀物；将所得沉淀物进行疏水层析和离子层析，超滤浓缩，冷冻干燥，获得高效价纤溶酶。本发明方法可提高进沙蚕组织中沙蚕激酶的盐析溶出程度及沙蚕激酶活化程度，提升了提取产率及产品效价。本发明方法提取率高，适用于工业化生产。

Description

一种沙蚕激酶的提取方法
技术领域
本发明涉及一种沙蚕激酶的制备方法，属于生物制药领域。
背景技术
疣吻沙蚕(俗称禾虫，Tylorrhynehush eterochaetus)，在系统分类上属于无脊椎动物中的环节动物门(Annelida)，多毛纲(Polychaeta)，游走目(Errantia),沙蚕科(Nereidae)，疣吻沙蚕属(Tylorrhynchus)，是一广泛分布于暖温带和亚热带沿海的种，在印度尼西亚、越南、日本及我国南京、上海、福建、广东和广西等都有分布。
全球心脑血管治疗市场仍将保持快速发展的势头，并在全球医药市场上继续占据重要的地位。心脑血管治疗市场的规模及其重要性已经使其成为许多制药公司的一个重要目标，而心血管疾病患者的人数增加正在推动这一市场的发展。心脑血管药在全球范围内是第一大类药，约占药品总规模的20％。无论国内外，心脑血管治疗市场都非常巨大.所以，开发从沙蚕中获得的纤溶酶其溶栓活性不低于蚓激酶活性，它既有直接降解纤维蛋白的作用，又能激活纤溶酶原，间接降解纤维蛋白。与尿激酶相比，沙蚕溶纤酶具有较好的热稳定性，尿激酶在37℃很快失活，故尿激酶不适宜制成口服制剂，只能静脉注射。而沙蚕溶纤酶则可以研制成适宜口服的新型溶栓药物或保健食品，其热稳定性较蚓激酶相对较高。
中国专利CN1234443A公开了一种沙蚕激酶及其提取方法和用途的专利，其在沙蚕中提取沙蚕激酶分子量在25000～55000之间，等电点在3～7之间，但其沙蚕激酶提取率较低，500g沙蚕仅获得约4000～5000U沙蚕激酶。博士论文《一种新型日本刺沙蚕纤溶酶的分离、特性及质量标准》中探索了沙蚕激酶的提取方法，其采用硫酸铵盐析、PhenylSepharose 6FF疏水层析、DEAE Sepharose FF阴离子离子交换层析和Sephacryl S-100HR凝胶过滤层析，获得日本刺沙蚕纤溶酶。该提取方法虽与本发明所采用的沙蚕种类不同，但该方法对沙蚕激酶的提取方法进行了初步探索，对提取方法进行放大处理时，其仍存在，初提取液黏度大，盐析过程中沉淀杂质含量较高及盐用量大，提取产率及效价低的问题。
发明内容
为克服现有沙蚕激酶提取过程中沙蚕激酶初提液黏度大，沙蚕激酶盐析得率低及杂质含量高、产品效价低的问题，本发明对现有提取方法进行改进，提供了一种从沙蚕中提取沙蚕激酶的方法，该方法可提高沙蚕组织中沙蚕激酶的盐析析出程度及沙蚕激酶活化程度，提升了提取产率及产品效价。本发明方法提取率高，适用于工业化生产。
本发明技术方案如下：
一种沙蚕激酶的提取方法，包括如下步骤：
将沙蚕添加预冷的磷酸盐缓冲液后匀浆，挤压过滤，收集滤液；
向所得滤液中加入碱性脂肪酶，保温酶解并使沙蚕激酶活化，制得酶解液；
通常可在酶解后降至常温，过滤得滤液或离心收集上清液，得酶解液；
将所得酶解液于55～60℃高温除杂后，将滤液或离心所得上清液用0.5μm微孔滤膜过滤，收集膜过滤液；
将所得膜过滤液分级盐析，即先用低浓度的混合盐溶液进行盐析去除杂质，再用高浓度的混合盐溶液进行盐析，离心收集沉淀物；
将所得沉淀物依次疏水层析、凝胶过滤除盐层析、离子交换层析，超滤浓缩，冷冻干燥，制得沙蚕激酶。
本发明方法提取所得沙蚕激酶为高效价纤溶酶。
进一步地，选取生理阶段为未性成熟的沙蚕成虫，优选采用鲜活的沙蚕。具体采用的沙蚕种类可为疣吻沙蚕(Tylorrhynchus heterochaetus)，俗称禾虫。
进一步地，将选取鲜活的沙蚕进行饥饿饲养(可置于清洁的流动海水中饥饿饲养12h)后再进行后续操作。
进一步地，在匀浆前先将沙蚕清洗消毒，获得预处理沙蚕。沙蚕消毒方法优选采用臭氧消毒。为进一步提高消毒效果，降低对沙蚕活性的影响，可将沙蚕放在臭氧浓度0.3～0.5mg/L的水中，并在此浓度下维持10～15min进行消毒。
进一步地，所述匀浆是将预冷的磷酸盐缓冲液添加到沙蚕中，在组织粉碎机中进行短时间粉碎，优选采用预冷到8～10℃的pH 7.5～8.5，0.14～0.18mM磷酸盐缓冲液。组织粉碎时间优选为10～20s，然后随即采用6层纱布进行挤压过滤。所述磷酸盐缓冲液与沙蚕的比例为2～2.5L/kg。
进一步地，所述酶解条件：采用碱性脂肪酶，酶添加量为沙蚕重量的0.05～0.2％，最适酶解pH为7.0～9.0，酶解温度为30～35℃，酶解时间为2.0～3.0h。
本发明研究发现，采用的碱性脂肪酶可降解过滤液中的脂肪，从而降低过滤液的黏度，利于后续步骤的分级盐析。通过匀浆、挤压过滤的组织液大多数来自沙蚕的体腔，其部位沙蚕激酶含量较高。本发明意外地发现，在保温酶解过程中，沙蚕激酶酶原逐渐被激活，转变成具有较强纤溶酶活性的纤溶酶，其与脂肪酶共同作用能够改变溶液的黏度，并使酶原进一步被活化。
进一步地，所述高温除杂为控制酶解液温度在55～60℃，优选维持时间为30～50min。本发明研究发现，滤液中的纤溶酶活性在上述温度范围内随处理温度的升高变化较小，沙蚕激酶有一定的温度耐受性。采取上述相对较高温度处理，可以使其他杂质蛋白变性、沉淀，从而通过离心或过滤将蛋白质等杂质去除。
进一步地，所述用低浓度的混合盐溶液进行盐析去除杂质，其条件为调至盐析溶液中(NH4)2SO4浓度为2.5～3.0g/L，NaCl浓度为7.0～8.0g/L，在低温6～10℃条件下进行搅拌和盐析去除杂质。
进一步地，所述用高浓度的混合盐溶液进行盐析，其条件为调至盐析溶液中(NH4)2SO4浓度为7.0～8.0g/L，NaCl浓度为17.0～19.0g/L，在低温6～10℃条件下进行搅拌和盐析，收集沉淀，获得粗制品。
本发明研究发现，若盐析溶液的(NH4)2SO4浓度为2.5～3.0g/L，NaCl浓度为7.0～8.0g/L条件下，上清液的纤溶酶活性基本保持不变，故在此条件下盐析去除溶液中的杂质蛋白；若浓度继续增加盐浓度则会造成上清液的纤溶酶活性的降低。通过此种方法收集的沉淀含纯度较高的沙蚕激酶，从而去除了大量的核酸、脂肪、杂蛋白等大分子物质。
进一步地，所述疏水层析选用的介质为Butyl Sepharose FF(丁基琼脂糖凝胶)。所用平衡缓冲液为含有1.0M/L(NH4)2SO4的pH7.4 15mM的磷酸盐缓冲液；洗脱缓冲液为pH7.4，15mM磷酸盐缓冲液。优选收集纤溶酶活性较高的组分进行后续除盐层析。
进一步地，所述凝胶过滤除盐层析选用的介质为Sephadex G-25 M(葡聚糖凝胶G25)。所用平衡缓冲液和洗脱缓冲液均为pH7.4，20mM Tris-HCl buffer。收集活性蛋白质组分。
进一步地，所述离子交换层析所用介质为DEAE Sepharose FF。优选收集纤溶酶活性较高的组分进行超滤浓缩除盐，冷冻干燥，即可获得高效价的沙蚕激酶(纤溶酶)。
本发明所用原料均可市售购得，或按本领域常规方法制备。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实例。
较佳地，上述沙蚕激酶的提取方法，包括以下步骤：
1)取鲜活的疣吻沙蚕(Tylorrhynchus heterochaetus)，饥饿饲养处理后臭氧消毒；
2)将消毒后的沙蚕放入预冷到8～10℃的pH 7.5～8.5，0.14～0.16mM磷酸盐缓冲液中，匀浆，挤压过滤，收集滤液；沙蚕与所述磷酸盐缓冲液的比例为10kg/(20～25)L；
3)向所得滤液中加入碱性脂肪酶，于pH 7.0～9.0、温度30～35℃条件下，保温酶解2.0～3.0h；酶解后置于4℃条件下离心(10000rpm，20min)，收集上清液(去除细胞组织碎片等其他不溶物沉淀物)；碱性脂肪酶添加量为沙蚕重量的0.1％～0.2％；
4)将所得酶解液升温至55～60℃，维持30～50min；然后迅速在冰水中冷却至室温，4℃条件下离心(10000rpm，20min)，收集上清液，去除沉淀；将上清液用0.5μm的微孔滤膜过滤(除去细胞组织碎片等其他不溶物)，收集膜过滤液；
5)向所得膜过滤液中加入(NH4)2SO4和NaCl，使硫酸铵浓度为2.5～3.0g/L，氯化钠浓度为7.0～8.0g/L，在冰浴中持续搅拌20min，然后置于4℃条件下，静置盐析4h；离心(10000rpm冷冻离心15min)去除沉淀，收集上清液；
向所得上清液中继续加入(NH4)2SO4和NaCl，使硫酸铵浓度为7.0～8.0g/L，氯化钠浓度为17.0～19.0g/L；在冰浴中持续搅拌20min，然后置于4℃条件下，静置盐析4h；离心(10000rpm冷冻离心15min)，弃去上清液，收集沉淀，将沉淀真空冷冻干燥，备用；
6)疏水层析：采用Butyl Sepharose FF(丁基琼脂糖凝胶)作为疏水介质，(例如装柱体积为200ml的凝胶柱)，平衡缓冲液为含有1.0M/L(NH4)2SO4的pH7.4，15mM磷酸盐缓冲液；洗脱缓冲液为pH7.4，15mM磷酸盐缓冲液；
具体疏水层析过程包括：将步骤5)所得冻干沉淀中加入所述洗脱缓冲液溶解，并加入研磨成细粉的(NH4)2SO4，使其电导率略高于平衡缓冲液；再用平衡缓冲液将该样品浓度稀释到8mg/ml，经0.22μm滤膜过滤后上样；控制上样流速为40ml/min，并以相同的流速用平衡缓冲液充分平衡色谱柱，至检测基线平稳；然后采用线性梯度洗脱方式进行洗脱，洗脱缓冲液成分由0％增至100％进行洗脱冲液，检测流出液体基线平稳后停止洗脱；按出峰先后顺序共收集A、B、C、D和E峰洗脱液(参见图1)，取纤溶酶活性较高的C峰组分物质进行后续纯化；
7)凝胶过滤除盐层析：采用Sephadex G-25M(葡聚糖凝胶G25)作为介质对步骤6)分离所得组分进行除盐层析；(例如装柱体积为200ml)，平衡缓冲液和洗脱缓冲液均为pH7.4，20mM Tris-HCl buffer；具体操作：将步骤6)收集的含活性蛋白的溶液，控制流速为40ml/min进行上样，样品总体积不超过柱体积的20％；然后继续用缓冲液进行洗脱，收集各峰组分并混合，进行后续纯化。
8)离子交换层析：采用DEAE Sepharose FF凝胶材料为介质进行子交换层析，(例如装柱体积为150ml)，平衡缓冲液为pH7.4，20mM Tris-HCl buffer；洗脱缓冲液为含1.0M/L NaCl的pH7.4，20mM/L Tris-HCl buffer；
具体离子交换层析过程包括：将步骤7)处理收集的含活性蛋白的溶液，控制其电导略低于平衡缓冲液电导率，0.22μm微孔滤膜过滤后上样；用平衡缓冲液冲洗平衡色谱柱至检测基线平稳，流速控制为30ml/min进行上样，后用平衡缓冲液将未被吸附的物质洗去至接近基线平稳，然后采用线性梯度洗脱方式，洗脱缓冲液成分由0％增至100％进行洗脱冲液，检测流出液体基线平稳后停止洗脱；按出峰先后顺序共收集A、B、C、D和E峰洗溶液(参见图2)，取活性较高的B峰物质进行后续操作；
9)超滤浓缩及冷冻干燥：取纤溶酶活性较高的活性组分(例如步骤8)所得B组分)进行超滤除盐脱水，脱去小分子物质，直至溶液电导率≤0.2×103μs/cm；并将澄清液于-40℃下真空冷冻10小时，继续升温至35℃干燥得到沙蚕激酶冻干粉。
本发明还包括上述方法制备的沙蚕激酶。该沙蚕激酶比活力为5.4～5.9万IU/mg(以尿激酶为标准品测定)。
本发明还包括上述方法制备的沙蚕激酶在制备药物上的应用。
所述药物可制成药学上可接受的各种剂型。
具体地，本发明提供一种沙蚕激酶肠溶片，其包括上述方法制备的沙蚕激酶。
优选地，所述沙蚕激酶肠溶片的片芯包括以下重量份的组分：上述沙蚕激酶110～130份，羟丙基纤维素130～170份，滑石粉70～80份，硬脂酸镁28～32份，羧甲基淀粉钠40～50份，蔗糖1100～1300份。
所述沙蚕激酶肠溶片可采用本领域常规方法制备。例如，蔗糖进行粉碎过80目筛，将沙蚕激酶粉、羟丙基纤维素、硬脂酸镁、蔗糖和部分羧甲基淀粉钠、部分滑石粉进行充分混合，混合后添加乙醇水溶液进行拌浆、制粒，干燥、整粒；将颗粒与剩余的羧甲基淀粉钠和滑石粉进行充分混合后压片，制得片芯，将片芯进行肠溶薄膜包衣，肠溶包衣材料(丙烯酸树脂Ⅱ号和Ⅲ号)，经检测合格后，即得沙蚕激酶肠溶片。
综上所述，与现有技术相比，本发明沙蚕激酶的提取方法具有如下优点：
1.本发明所述的沙蚕激酶的提取方法，其中采用添加脂肪酶以降低滤液的黏度，在后续混合盐析过程中，可提高盐析效率。
2.本发明所述的沙蚕激酶的提取方法，其采用混合分级盐析法对沙蚕激酶盐析，其整个提取过程可缩小盐的用量，且盐析产物中杂质相对较低，更有利后续分离。
3.本发明所述的沙蚕激酶的提取方法，其采用高温除杂，可降低部分提取产物中的杂蛋白，有利于增加沙蚕激酶的纯度。
附图说明
图1为本发明实施例1Butyl Sepharose FF(丁基琼脂糖凝胶)作为疏水介质洗脱图。
图2为本发明实施例1DEAE Sepharose FF凝胶材料进行阴离子交换层洗脱图。
图3为本发明实施例1制备的沙蚕激酶高效液相峰保留时间图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
以下所用沙蚕均为疣吻沙蚕(Tylorrhynchus heterochaetus)，俗称禾虫。
实施例1
1.样品预处理：称取鲜活的沙蚕10Kg，置于过滤后流动海水中饥饿饲养12h，饥饿处理后将沙蚕置于经过滤净化的海水中，并用臭氧发生器向水中充入臭氧，使水中臭氧浓度为0.3mg/L，并在此浓度下维持13min。
2.样品粉碎及过滤：将消毒后的沙蚕放入到22L提前预冷到9℃的pH8.0，0.15mM磷酸盐缓冲液添加到沙蚕中，组织粉碎时间为15s，然后随即采用6层纱布进行挤压过滤，收集滤液。
3.酶解和酶激活：将过滤液体放在室温下，向过滤液中加入最适pH7.0～9.0的碱性脂肪酶，添加量为沙蚕重量的0.15％，并在32℃条件下，保温酶解2.5h，酶解后置于4℃条件下10000rpm离心20min，收集上清液，去除细胞组织碎片等其他不溶物沉淀物。
4.高温除杂：将装有上述膜过滤液的容器放入到水浴池中进行缓慢搅拌升温，并控制温度在57℃，维持时间为40min。迅速在冰水中冷却至室温，4℃条件下10000rpm离心20min，收集上清液，去除沉淀。上清液依次通过0.5μm的微孔滤膜除去细胞组织碎片等其他不溶物，收集膜过滤液。
5.混合分级盐析：除杂盐析，取上述膜过滤液，向液体中缓慢加入研细的(NH4)2SO4和NaCl粉末，分别至硫酸铵浓度为2.8g/L，氯化钠浓度为7.5g/L。在冰浴中持续搅拌20min，然后置于4℃条件下，静置盐析4h。以10000rpm冷冻离心15min，去除沉淀，收集上清液。
目标产物盐析，取上述上清液，继续加入(NH4)2SO4和NaCl粉末，分别至硫酸铵浓度为7.5g/L，氯化钠浓度为18.0g/L。在冰浴中持续搅拌20min，然后置于4℃条件下，静置盐析4h。以10000rpm冷冻离心15min，弃去上清液，收集沉淀，将沉淀真空冷冻干燥。
6.疏水层析：采用Butyl Sepharose FF(丁基琼脂糖凝胶)作为疏水介质，装柱体积为200ml的凝胶柱，平衡缓冲液为含有1.0M/L(NH4)2SO4的pH7.4，15mM磷酸盐缓冲液；洗脱缓冲液为pH7.4，15mM磷酸盐缓冲液。向上述冻干沉淀中加入洗脱缓冲液溶解，并不断加入研磨成细粉的(NH4)2SO4，使其电导率略高于平衡缓冲液。再用平衡缓冲液将样品浓度稀释到8mg/ml，经0.22μm滤膜过滤后上样。控制流速为40ml/min进行上样，并以相同的流速用平衡充分平衡色谱柱，至检测基线平稳。然后采用线性梯度洗脱方式进行洗脱，洗脱缓冲液成分由0％增至100％进行洗脱冲液，检测流出液体基线平稳后停止洗脱。按出峰先后顺序共收集A、B、C、D和E峰洗脱液(见图1)，取纤溶酶活性较高的C峰组分物质进行后续纯化。
7.除盐层析：采用Sephadex G-25M凝胶过滤层析进行上步分离组分的除盐，装柱体积为200ml，平衡缓冲液和洗脱缓冲液均为pH7.4，20mM Tris-HCl buffer。将上步收集的含活性蛋白的溶液，控制流速为40ml/min进行上样，样品总体积不超过柱体积的20％。然后继续用缓冲液进行洗脱，收集各峰组分并混合，进行后续纯化。
8.离子交换层析：采用DEAE Sepharose FF凝胶材料进行阴离子交换层，装柱体积为150ml，平衡缓冲液为pH7.4，20mM Tris-HCl buffer；洗脱缓冲液为含1.0M/L NaCl的pH7.4，20mM/L Tris-HCl buffer。将上述处理收集的含活性蛋白的溶液，控制其电导略低于平衡缓冲液电导率，0.22μm微孔滤膜过滤后上样。用平衡缓冲液冲洗平衡色谱柱至检测基线平稳，流速控制为30ml/min进行上样，后用平衡缓冲液将未被吸附的物质洗去至接近基线平稳，然后采用线性梯度洗脱方式，洗脱缓冲液成分由0％增至100％进行洗脱冲液，检测流出液体基线平稳后停止洗脱。按出峰先后顺序共收集A、B、C、D和E峰洗溶液(见图2)，取活性较高的B峰物质进行后续操作。
9.超滤浓缩及冷冻干燥：取纤溶酶活性较高的B组分进行超滤除盐脱水，脱去小分子物质，直至溶液电导率≤0.2×103μs/cm。并将澄清液于-40℃下真空冷冻10小时，继续升温至35℃干燥得到沙蚕激酶冻干粉。
共得到6.2g沙蚕激酶冻干粉，收率0.62‰，纯度为97.3％，其含水量为5.6％，以尿激酶为标准品测定的比活力为58326IU/mg。
实施例2
1.样品预处理：称取鲜活的沙蚕10Kg，置于过滤后流动海水中饥饿饲养12h，饥饿处理后将沙蚕置于经过滤净化的海水中，并用臭氧发生器向水中充入臭氧，使水中臭氧浓度为0.4mg/L，并在此浓度下维持10min。
2.样品粉碎及过滤：将消毒后的沙蚕放入到20L提前预冷到8℃的pH 7.5，0.14mM磷酸盐缓冲液添加到沙蚕中，组织粉碎时间为10s，然后随即采用6层纱布进行挤压过滤，收集滤液。
3.酶解和酶激活：将过滤液体放在室温下，向过滤液中加入最适pH7.0～9.0的碱性脂肪酶，添加量为沙蚕重量的0.1％，并在30℃条件下，保温酶解2.0h，酶解后置于4℃条件下10000rpm离心20min，收集上清液，去除细胞组织碎片等其他不溶物沉淀物。
4.高温除杂：将装有上述膜过滤液的容器放入到水浴池中进行缓慢搅拌升温，并控制温度在55℃，维持时间为30min。迅速在冰水中冷却至室温，4℃条件下10000rpm离心20min，收集上清液，去除沉淀。上清液通过0.5μm的微孔滤膜除去细胞组织碎片等其他不溶物，收集膜过滤液。
5.混合分级盐析：除杂盐析，取上述膜过滤液，向液体中缓慢加入研细的(NH4)2SO4和NaCl粉末，分别至硫酸铵浓度为2.5g/L，氯化钠浓度为7.0g/L。在冰浴中持续搅拌20min，然后置于4℃条件下，静置盐析4h。以10000rpm冷冻离心15min，去除沉淀，收集上清液。
目标产物盐析，取上述上清液，继续加入(NH4)2SO4和NaCl粉末，分别至硫酸铵浓度为7.0g/L，氯化钠浓度为17.0g/L。在冰浴中持续搅拌20min，然后置于4℃条件下，静置盐析4h。以10000rpm冷冻离心15min，弃去上清液，收集沉淀，将沉淀真空冷冻干燥。
步骤6-9与实施例1相同。
得到5.9g沙蚕激酶冻干粉，收率0.59‰，纯度为97.1％其含水量为5.6％，以尿激酶为标准品测定的比活力为57680IU/mg。
实施例3
1.样品预处理：称取鲜活的沙蚕10Kg，置于过滤后流动海水中饥饿饲养12h，饥饿处理后将沙蚕置于经过滤净化的海水中，并用臭氧发生器向水中充入臭氧，使水中臭氧浓度为0.3mg/L，并在此浓度下维持15min。
2.样品粉碎及过滤：将消毒后的沙蚕放入到25L提前预冷到10℃的pH8.5，0.16mM磷酸盐缓冲液添加到沙蚕中，组织粉碎时间为20s，然后随即采用6层纱布进行挤压过滤，收集滤液。
3.酶解和酶激活：将过滤液体放在室温下，向过滤液中加入最适pH7.0～9.0的碱性脂肪酶，添加量为沙蚕重量的0.2％，并在35℃条件下，保温酶解3.0h，酶解后置于4℃条件下10000rpm离心20min，收集上清液，去除细胞组织碎片等其他不溶物沉淀物。
4.高温除杂：将装有上述膜过滤液的容器放入到水浴池中进行缓慢搅拌升温，并控制温度在60℃，维持时间为50min。迅速在冰水中冷却至室温，4℃条件下10000rpm离心20min，收集上清液，去除沉淀。上清液通过0.5μm的微孔滤膜除去细胞组织碎片等其他不溶物，收集膜过滤液。
5.混合分级盐析：除杂盐析，取上述膜过滤液，向液体中缓慢加入研细的(NH4)2SO4和NaCl粉末，分别至硫酸铵浓度为3.0g/L，氯化钠浓度为8.0g/L。在冰浴中持续搅拌20min，然后置于4℃条件下，静置盐析4h。以10000rpm冷冻离心15min，去除沉淀，收集上清液。
目标产物盐析，取上述上清液，继续加入(NH4)2SO4和NaCl粉末，分别至硫酸铵浓度为8.0g/L，氯化钠浓度为19.0g/L。在冰浴中持续搅拌20min，然后置于4℃条件下，静置盐析4h。以10000rpm冷冻离心15min，弃去上清液，收集沉淀，将沉淀真空冷冻干燥。
步骤6-9与实施例1相同。
得到5.9g沙蚕激酶冻干粉，收率0.59‰，纯度为97.3％，其含水量为5.6％，以尿激酶为标准品测定的比活力为54264IU/mg。
实施例4
1.样品预处理：称取鲜活的沙蚕10Kg，置于过滤后流动海水中饥饿饲养12h，饥饿处理后将沙蚕置于经过滤净化的海水中，并用臭氧发生器向水中充入臭氧，使水中臭氧浓度为0.3mg/L，并在此浓度下维持14min。
2.样品粉碎及过滤：将消毒后的沙蚕放入到24L提前预冷到9℃的pH 78，0.15mM磷酸盐缓冲液添加到沙蚕中，组织粉碎时间为18s，然后随即采用6层纱布进行挤压过滤，收集滤液。
3.酶解和酶激活：将过滤液体放在室温下，向过滤液中加入最适pH7.0～9.0的碱性脂肪酶，添加量为沙蚕重量的0.18％，并在34℃条件下，保温酶解2.8h，酶解后置于4℃条件下10000rpm离心20min，收集上清液，去除细胞组织碎片等其他不溶物沉淀物。
4.高温除杂：将装有上述膜过滤液的容器放入到水浴池中进行缓慢搅拌升温，并控制温度在56℃，维持时间为35min。迅速在冰水中冷却至室温，4℃条件下10000rpm离心20min，收集上清液，去除沉淀。上清液通过0.5μm的微孔滤膜除去细胞组织碎片等其他不溶物，收集膜过滤液。
5.混合分级盐析：除杂盐析，取上述膜过滤液，向液体中缓慢加入研细的(NH4)2SO4和NaCl粉末，分别至硫酸铵浓度为2.8g/L，氯化钠浓度为7.6g/L。在冰浴中持续搅拌20min，然后置于4℃条件下，静置盐析4h。以10000rpm冷冻离心15min，去除沉淀，收集上清液。
目标产物盐析，取上述上清液，继续加入(NH4)2SO4和NaCl粉末，分别至硫酸铵浓度为7.8g/L，氯化钠浓度为17.8g/L。在冰浴中持续搅拌20min，然后置于4℃条件下，静置盐析4h。以10000rpm冷冻离心15min，弃去上清液，收集沉淀，将沉淀真空冷冻干燥。
步骤6-9与实施例1相同。
得到6.3g沙蚕激酶冻干粉，收率0.63‰，纯度为97.2％，其含水量为5.6％，以尿激酶为标准品测定的比活力为55686IU/mg。
实施例5
沙蚕激酶肠溶片的制备
处方(10000片)：实施例1制备的沙蚕激酶120g，羟丙基纤维素150g，滑石粉76g，硬脂酸镁30g，羧甲基淀粉钠46g，蔗糖1198g。
将上述原料和蔗糖进行粉碎过80目筛，将沙蚕激酶粉、羟甲基纤维素、硬脂酸镁、蔗糖和部分羧甲基淀粉钠、部分滑石粉进行充分混合，混合后添加乙醇水溶液进行拌浆、制粒，干燥、整粒；将颗粒与剩余的羧甲基淀粉钠和滑石粉进行充分混合后压片，制得片芯，将片芯进行肠溶薄膜包衣，肠溶包衣材料(丙烯酸树脂Ⅱ号和Ⅲ号)，经检测合格后，即得沙蚕激酶肠溶片。所得的沙蚕激酶肠溶片≥6万IU/粒。
对比例1
步骤1-3与实施例1相同。
4.硫酸铵分级盐析：除杂盐析，取上述膜过滤液，向液体中缓慢加入研细的(NH4)2SO4粉末，分别至硫酸铵浓度为20％饱和度。在冰浴中持续搅拌20min，然后置于4℃条件下，静置盐析4h。以10000rpm冷冻离心15min，去除沉淀，收集上清液。
目标产物盐析，取上述上清液，继续加入(NH4)2SO4，分别至硫酸铵浓度为50％饱和度。在冰浴中持续搅拌20min，然后置于4℃条件下，静置盐析4h。以10000rpm冷冻离心15min，弃去上清液，收集沉淀，将沉淀真空冷冻干燥。
步骤5-9与实施例1相同。
得到4.8g沙蚕激酶冻干粉，收率0.48‰，纯度为90.3％，其含水量为5.6％，以尿激酶为标准品测定的比活力为52230IU/mg。
对比例2
步骤1-3与实施例1相同。
4.混合分级盐析：除杂盐析，取上述膜过滤液，向液体中缓慢加入研细的NaCl粉末，氯化钠浓度为0.1mol/L。在冰浴中持续搅拌20min，然后置于4℃条件下，静置盐析4h。以10000rpm冷冻离心15min，去除沉淀，收集上清液。
目标产物盐析，取上述上清液，继续加入NaCl粉末，氯化钠浓度为0.1mol/L。在冰浴中持续搅拌20min，然后置于4℃条件下，静置盐析4h。以10000rpm冷冻离心15min，弃去上清液，收集沉淀，将沉淀真空冷冻干燥。
步骤5-9与实施例1相同。
得到4.1g沙蚕激酶冻干粉，收率0.41‰，纯度为91.6％，其含水量为5.5％，以尿激酶为标准品测定的比活力为52160IU/mg。
对比例3
步骤1-2与实施例1相同。
3.酶解和纤溶酶激活：将过滤液体放在室温下，向过滤液中加入0.1％的蛋白酶，并在35℃条件下，保温酶解6h，酶解后置于4℃条件下10000rpm离心20min，上清液通过0.5μm的微孔滤膜除去细胞组织碎片等其他不溶物，收集膜过滤液。
步骤4-9与实施例1相同。
得到5.6g沙蚕激酶冻干粉，收率0.56‰，纯度为92.0％，其含水量为5.5％，以尿激酶为标准品测定的比活力为48630IU/mg。
对比例4
步骤1-5与实施例1相同。
6.疏水层析：采用Phenyal Sepharose6FF(苯基琼脂糖凝胶)作为疏水介质，装柱体积为200ml的凝胶柱，选用平衡缓冲液为含有1.0M/L(NH4)2SO4的pH7.4，15mM磷酸盐缓冲液；洗脱缓冲液为pH7.4，15mM磷酸盐缓冲液。向上述冻干沉淀中加入洗脱缓冲液溶解，并不断加入研磨成细粉的(NH4)2SO4，使其电导率略高于平衡缓冲液。再用平衡缓冲液将样品浓度稀释到8mg/ml，经0.22μm滤膜过滤后上样。控制流速为40ml/min进行上样，并以相同的流速用平衡充分平衡色谱柱，至检测基线平稳。然后采用线性梯度洗脱方式进行洗脱，洗脱缓冲液成分由0％增至100％进行洗脱冲液，检测流出液体基线平稳后停止洗脱。按出峰先后顺序共收集A、B、C、D和E峰物质(图1)，取纤溶酶活性较高的C峰组分物质进行后续纯化。
步骤7-9与实施例1相同。
得到5.9g沙蚕激酶冻干粉，收率0.59‰，纯度为94.2％，其含水量为5.6％，以尿激酶为标准品测定的比活力为51632IU/mg。
对比例5
步骤1-3与实施例1相同。
4.高温除杂：将装有上述膜过滤液的容器放入到水浴池中进行缓慢搅拌升温，并控制温度在45℃，维持时间为40min。迅速在冰水中冷却至室温，4℃条件下10000rpm离心20min，收集上清液，去除沉淀。上清液通过0.5μm的微孔滤膜除去细胞组织碎片等其他不溶物，收集膜过滤液。
步骤5-9与实施例1相同。
得到5.6g沙蚕激酶冻干粉，收率0.56‰，纯度为92.0％，其含水量为5.6％，以尿激酶为标准品测定的比活力为49230IU/mg。
对比例6
步骤1-3与实施例1相同。
4.高温除杂：将装有上述膜过滤液的容器放入到水浴池中进行缓慢搅拌升温，并控制温度在65℃，维持时间为40min。迅速在冰水中冷却至室温，4℃条件下10000rpm离心20min，收集上清液，去除沉淀。上清液通过0.5μm的微孔滤膜除去细胞组织碎片等其他不溶物，收集膜过滤液。
步骤5-9与实施例1相同。
得到3.8g沙蚕激酶冻干粉，收率0.58‰，纯度为70.6％，其含水量为5.6％，以尿激酶为标准品测定的比活力为32680IU/mg。
实验例1沙蚕组织过滤液黏度的测定
在每批沙蚕组织提取过程中，取脂肪酶处理前和脂肪酶处理后的样品，采用LBY-N6型血液黏度计测定脂肪酶处理前后沙蚕组织匀浆液的黏度，剪切率设定在35.0s-1，试验样品为实施例1-4和对比例3处理过程中的样品。表1数据记录了脂肪酶处理前后过滤液样品的黏度，从结果可以看出脂肪酶对沙蚕组织匀浆过滤液黏度的作用较大。
表1酶处理前后沙蚕组织过滤液黏度的测定
组别 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 对比例3
酶处理前(mpa·s) 9.57±1.64 9.14±1.70 9.20±1.38 9.12±1.30 9.18±1.46
酶处理后(mpa·s) 6.06±0.81 6.24±1.09 6.18±0.82 6.26±1.07 6.84±0.89
实验例2混合分级盐析效果的测定
溶液配制：工作溶液，取0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.8)与0.9％氯化钠溶液(1:17)混合；1.5％琼脂糖溶液，琼脂糖0.75g，加50mL工作溶液加热溶解；1.5mg/ml牛血纤维蛋白原液体，取纤维蛋白原溶液适量，加工作溶液制成每1mL中含1.5mg的可凝蛋白溶液。
纤维蛋白原平板的制备：取牛血纤维蛋白原液13mL，置烧杯中，边搅拌边加入55℃左右琼脂糖溶液13mL，凝血酶溶液1.0mL，立即混匀，快速倒入直径8.5cm的玻璃饲养皿中，室温水平放置1h，打孔(直径3mm)。
样品：上述各实施例1-4及对比例1-3提取过程中，低浓度除杂盐析离心后上清液；高浓度盐析离心后上清液。
操作：准确量取样品10μL，分别点在同一个平板上，加盖，置37℃恒温箱中反应8h，取出后用直尺测量溶圈垂直两直径，取平均值。
结果：从表2数据可以看出，与对比例相比，实施例中混合分级盐析在低浓度除杂盐析过程中有利于保持上清液的溶栓活性，降低沙蚕激酶的随沙蚕的损失；高浓度混合盐析沉淀后其上清液溶栓活性较低，说明沉淀中沙蚕激酶含量较高。
表2盐析除杂及沉淀后上清液纤溶圈直径的测定
Figure BDA0002048814200000141
实验例3纯度的测定
高效液相凝胶过滤色谱法(HPLC gel-filtration)的色谱条件如下：色谱柱：TSK-GEL G2000SW(7.5×300mm)；柱温：25℃；流动相：pH7.0的含0.15M/L NaCl的20mM磷酸盐缓冲液；检测波长：280nm；流速：1.0ml/min；洗脱方式：等度洗脱；洗脱时间：30min；上样量：20μl(0.45μm滤膜过滤)；根据峰面积归一法，测定蛋白质纯度。
实施例1制备的沙蚕激酶样品经过高效液相凝胶过滤色谱法(HPLC gel-filtration)检测的纯度结果如图3；沙蚕激酶在HPLC上表现为单一的色谱峰，峰形对称，分离度较好，保留时间为8.463，通过面积归一法计算其纯度为97.3％。通过对不同批次纯化的样品进行多次纯度检测，结果比较稳定。
实验例4沙蚕激酶纤溶比活力的测定
采用琼脂糖-纤维蛋白平板法，参照蚓激酶的国家药品标准，以尿激酶标准品为标准，计算出每毫克纯化酶的尿激酶活性单位。具体过程如下：
1)溶液配制：工作溶液，取0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.8)与0.9％氯化钠溶液(1:17)混合；1.5％琼脂糖溶液，琼脂糖0.75g，加50mL工作溶液加热溶解；1.5mg/ml牛血纤维蛋白原液体，取纤维蛋白原溶液适量，加工作溶液制成每1mL中含1.5mg的可凝蛋白溶液；凝血酶溶液，取凝血酶，加0.9％氯化钠溶液制成每1mL中含1BP单位的溶液。
2)标准品溶液的制备：取尿激酶标准品，用0.9％氯化钠溶液配制成浓度分别为每1ml中含2560、1280、640、320、160IU尿激酶单位的溶液。
3)样品用0.9％氯化钠溶液配制成30μg/ml的浓度。
4)测定法：取牛血纤维蛋白原液13mL，置烧杯中，边搅拌边加入55℃左右琼脂糖溶液13mL，凝血酶溶液1.0mL，立即混匀，快速倒入直径8.5cm的玻璃饲养皿中，室温水平放置1h，打孔(直径3mm)。准确量取样品10μL，分别点在同一个平板上，加盖，置37℃恒温箱中反应18h，取出后用卡尺测量溶圈垂直两直径，以尿激酶标准品的单位数的对数为横坐标，垂直直径乘积的对数为纵坐标，计算标准曲线回归方程，将纯化的沙蚕激酶溶圈垂直直径乘积的对数代入标准曲线方程，计算其活力单位数。
琼脂糖-纤维蛋白平板法以尿激酶标准品为标准测定的比活力为54000IU/mg(尿激酶活性单位)，这也说明沙蚕激酶的溶解纤维蛋白的能力较强。沙蚕激酶比活力的确定，可以作为以后其纯化纯度的一个监测指标。同时也为以后的临床前研究奠定基础，比如在药效学研究中，可以使用比活力来评价其疗效。
实验例5沙蚕激酶肠溶片溶栓效果评价
选取诊断为脑梗死的患者20例，按随机数字表法分为观察组和对照组，每组各10例。观察组：男性4例，女性6例，年龄60～66岁，平均年龄(63.5±3.0)岁，病程5～10d，平均病程(6.5±1.5)d。对照组：男性4例，女性6例，年龄58～66岁，平均年龄(62.9±3.2)岁，病程5～10d，平均病程(6.4±1.4)d。观察组每天定时服用实施例5制备的沙蚕激酶肠溶片1粒。
结果：治疗前后两组患者纤维蛋白原含量,血小板聚集率，全血黏度，血浆黏度比较对照组患者治疗前各项指标水平差异无统计学意义，治疗后蚓激酶可以有效改善全血黏度，降低纤维蛋白原含量，降低血浆黏度以及血小板聚集率。
表3治疗前后两组患者纤维蛋白原含量，血小板聚集率，全血黏度，血浆黏度比较
Figure BDA0002048814200000161
*P<0.05，与同组治疗前比较；#P<0.05，与对照组治疗前后比较。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (11)

1.一种沙蚕激酶的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
将沙蚕添加预冷的磷酸盐缓冲液后匀浆，挤压过滤，收集滤液；
向所得滤液中加入碱性脂肪酶，保温酶解并使沙蚕激酶活化，制得酶解液；
酶解后降至常温，过滤得滤液或离心收集上清液，得酶解液；
将所得酶解液于55～60℃高温除杂后，将滤液或离心所得上清液用0.5μm微孔滤膜过滤，收集膜过滤液；
将所得膜过滤液分级盐析，即先用低浓度的混合盐溶液进行盐析去除杂质，再用高浓度的混合盐溶液进行盐析，离心收集沉淀物；
所述用低浓度的混合盐溶液进行盐析去除杂质，其条件为调至盐析溶液中(NH4)2SO4浓度为2.5～3.0g/L，NaCl浓度为7.0～8.0g/L，在温度6～10℃条件下进行搅拌和盐析去除杂质；所述用高浓度的混合盐溶液进行盐析，其条件为调至盐析溶液中(NH4)2SO4 浓度为7.0～8.0g/L，NaCl浓度为17.0～19.0g/L，在温度6～10℃条件下进行搅拌和盐析，收集沉淀，获得粗制品；
将所得沉淀物依次疏水层析、凝胶过滤除盐层析、离子交换层析，超滤浓缩，冷冻干燥，制得沙蚕激酶；所述沙蚕激酶比活力为5.4～5.9万IU/mg；
所述酶解的条件：采用碱性脂肪酶，酶添加量为沙蚕重量的0.05～0.2％，最适酶解pH为7.0～9.0，酶解温度为30～35℃，酶解时间为2.0～3.0h。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述匀浆采用预冷到8～10℃的pH7.5～8.5，0.14～0.18mM磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述匀浆时间为10～20s；所述磷酸盐缓冲液与沙蚕的比例为2～2.5L/kg。
4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液与沙蚕的比例为2～2.5L/kg。
5.根据权利要求1、3、4任一项所述的提取方法，其特征在于，所述疏水层析选用的介质为Butyl Sepharose FF。
6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述疏水层析所用平衡缓冲液为含有1.0M/L(NH4)2SO4的pH7.4 15mM磷酸盐缓冲液；洗脱缓冲液为pH7.4 15mM磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求1、3、4任一项所述的提取方法，其特征在于，所述凝胶过滤除盐层析选用的介质为Sephadex G-25M。
8.根据权利要求7所述的提取方法，其特征在于，所述凝胶过滤除盐所用平衡缓冲液和洗脱缓冲液均为pH7.4 20mM Tris-HCl buffer。
9.根据权利要求1、3、4任一项所述的提取方法，其特征在于，所述离子交换层析所用介质为DEAE Sepharose FF。
10.根据权利要求9所述的提取方法，其特征在于，所述离子交换层析所用平衡缓冲液为pH7.4，20mM Tris-HCl buffer；洗脱缓冲液为含1.0M/L NaCl的pH7.4 20mM Tris-HClbuffer。
11.根据权利要求1、3、4任一项所述的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取鲜活的疣吻沙蚕(Tylorrhynchus heterochaetus)，饥饿饲养处理后臭氧消毒；
2)将消毒后的沙蚕放入预冷到8～10℃的pH7.5～8.5，0.14～0.16mM磷酸盐缓冲液中，匀浆，挤压过滤，收集滤液；沙蚕与所述磷酸盐缓冲液的比例为10kg/(20～25)L；
3)向所得滤液中加入碱性脂肪酶，于pH7.0～9.0、温度30～35℃条件下，保温酶解2.0～3.0h；酶解后置于4℃条件下离心，收集上清液；碱性脂肪酶添加量为沙蚕重量的0.1％～0.2％；
4)将所得酶解液升温至55～60℃，维持30～50min；然后迅速在冰水中冷却至室温，4℃条件下离心，收集上清液，去除沉淀；将上清液用0.5μm的微孔滤膜过滤，收集膜过滤液；
5)向所得膜过滤液中加入(NH4)2SO4和NaCl，使硫酸铵浓度为2.5～3.0g/L，氯化钠浓度为7.0～8.0g/L，在冰浴中持续搅拌20min，然后置于4℃条件下，静置盐析4h；离心去除沉淀，收集上清液；
向所得上清液中继续加入(NH4)2SO4和NaCl，使硫酸铵浓度为7.0～8.0g/L，氯化钠浓度为17.0～19.0g/L；在冰浴中持续搅拌20min，然后置于4℃条件下，静置盐析4h；离心，弃去上清液，收集沉淀，将沉淀真空冷冻干燥，备用；
6)疏水层析：采用Butyl Sepharose FF作为疏水介质，平衡缓冲液为含有1.0M/L(NH4)2SO4的pH7.4，15mM磷酸盐缓冲液；洗脱缓冲液为pH7.4，15mM磷酸盐缓冲液；
7)凝胶过滤除盐层析：采用Sephadex G-25M作为介质对步骤6)分离所得组分进行除盐层析；平衡缓冲液和洗脱缓冲液均为pH7.4，20mM Tris-HCl buffer；
8)离子交换层析：采用DEAE Sepharose FF凝胶材料为介质进行子交换层析，平衡缓冲液为pH7.4，20mM Tris-HCl buffer；洗脱缓冲液为含1.0M/L NaCl的pH7.4，20mM/L Tris-HCl buffer；
9)超滤浓缩及冷冻干燥：取纤溶酶活性较高的活性组分进行超滤除盐脱水，脱去小分子物质，直至溶液电导率≤0.2×103μs/cm；并将澄清液真空冷冻干燥，得到沙蚕激酶冻干粉。
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