CN105542023A - 黑莓籽多糖在制备抗血栓药物方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种黑莓籽多糖在制备抗血栓药物方面的应用，该黑莓籽多糖为将黑莓籽粉碎后，用水提醇沉的方法得到粗多糖，再分别通过DEAE-52纤维素柱色谱和SephadexG-100凝胶柱色谱得到三个多糖。并对这三个多糖的体内抗血栓作用进行考察，结果表明：这三个多糖均具有良好的抗血栓作用，可单独或组合用于制备抗血栓药物。

Description

黑莓籽多糖在制备抗血栓药物方面的应用

技术领域

本发明属于医药和/或保健品技术领域，具体涉及一种黑莓籽活性成分的提取方法及其新用途，确切地说是黑莓籽多糖在制备抗血栓药物方面的应用。

背景技术

黑莓Rubusspp.Blackberry为蔷薇科悬钩子属聚合果类植物，未作药用，是世界上新兴的四种小果类果树之一。原产北美，其果实酸甜可口，具有很高的营养价值和药用价值，除鲜食外还大部分制成速冻果、果汁、果酒和果酱等食品。文献检索发现：对黑莓的研究主要集中在果实挥发油、黑莓籽油脂肪酸成分和黑莓叶、种子中黄酮、花色苷及维生素E含量分析方面。

黑莓籽是黑莓果酒、黑莓汁等加工产品的副产物，含有约27.14%的功能性油脂，其中不饱和脂肪酸总量高达93.55%，此外还有人体必需的氨基酸，在对抗动脉粥样硬化，抗糖尿病、免疫调节、促进生长和智力发育等方面具有重要的作用。而多糖（Polysaccharide）是生物体内除蛋白质和核酸以外的又一重要的生物分子，是生命活动中起中心作用的那些分子（如遗传物质、酶、抗体、激素、膜蛋白等）不可缺少的组成成分。多糖的研究已成为继蛋白质、核酸研究之后探索生命奥秘的有一个重大前沿。

血液中存在着互相拮抗的凝血系统和抗血栓系统（纤维蛋白溶解系统）。在生理情况下血液中的凝血因子不断地被激活，从而产生凝血酶，形成微量的纤维蛋白，沉着于血管内膜上。但这些微量的纤维蛋白又不断地被激活了的纤维蛋白溶解系统所溶解，同时被激活的凝血因子也不断地被单核吞噬细胞系统所吞噬。凝血系统和纤维蛋白溶解系统的动态平衡，既保证了血液有潜在的可凝固性又始终保证了血液的流体状态。然而，有时在某些能促进凝固过程的因素的作用下，打破了上述的动态平衡，触发了凝血过程，便形成血栓。

血栓形成是许多疾病如心肌梗死、缺血性卒死、深静脉血栓等的基本病理过程，它严重地危害着人类的健康，它的形成与血小板的聚集、粘附，内源性和外源性凝血系统以及纤维蛋白的形成密切相关。根据世界卫生组织的调查报告，由于动脉粥样硬化导致的血栓疾病引起的死亡已经排到了第一位。动脉血栓是由于动脉粥样硬化，斑块不稳定发生了斑块的破裂，使血液里的血小板发生聚集，激活了体内的凝血系统，最后导致血栓形成。一旦堵塞以后就会发生组织的缺血和坏死，产生严重的后果。在动脉血栓性疾病的急性或特殊状态下，需要辅助使用抗血栓药物，才能达到更好的抗血栓效果。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种具有抗血栓作用的黑莓籽多糖，同时提供其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

黑莓籽多糖的提取分离方法，其包括以下步骤：

（1）将黑莓籽粉碎，室温下用石油醚脱脂，挥干石油醚后，药渣用乙醇提取，过滤，阴干残渣，再向残渣中加入蒸馏水提取，趁热抽滤，合并滤液后减压浓缩，再向浓缩液中加入乙醇，静置离心，得到的沉淀再加蒸馏水溶解透析以除去小分子杂质，减压浓缩，冷冻干燥即得黑莓籽粗多糖；

（2）取黑莓籽粗多糖溶于蒸馏水中，过滤，弃去杂质后加入到DEAE-52纤维素柱色谱，依次用蒸馏水、0.1mol/L氯化钠溶液和0.2mol/L氯化钠溶液进行洗脱，洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，测490nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，合并同一洗脱峰的多糖样品，透析、浓缩后冷冻干燥；其中，蒸馏水洗脱峰为组分1，0.1mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分2，0.2mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分3；

（3）组分1溶于蒸馏水中、过滤弃去杂质，加入到SephadexG-100凝胶柱色谱，用蒸馏水进行洗脱，采用苯酚-硫酸法进行检测，测其在490nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，得到两组洗脱峰，浓缩第2组洗脱峰，冷冻干燥得到的多糖命名为BSP-1；

（4）组分2和组分3均采用步骤（3）的方法进行洗脱，得到单一洗脱峰，分别命名为BSP-2和BSP-3；

黑莓籽多糖即为BSP-1、BSP-2和BSP-3中的一种或两种以上的混合物。

采用上述方法制备得到的黑莓籽多糖。

上述黑莓籽多糖在制备抗血栓药物方面的应用。

本发明以黑莓籽为原料，用水提醇沉的方法得到粗多糖，过DEAE-52纤维素柱色谱和SephadexG-100凝胶柱色谱得到3个多糖组分。其中，DEAE-52纤维素柱色谱：为二乙氨基乙基型纤维素，是一种阴离子交换纤维素，常用于多糖纯化和分离。粗多糖溶液吸附于DEAE-52后，以不同离子强度的盐进行洗脱，根据多糖的离子交换能力差异进行分离。SephadexG-100凝胶柱色谱：是一种半合成的凝胶，基本骨架是以葡萄糖(右旋糖酐)为残基的多糖，在链状结构间，以3-氯-1,2-环氧丙烷为交联剂，以醚桥相互连接成为三维空间的网状高分子化合物。

本发明的有益效果：本发明对黑莓籽多糖的体内抗血栓作用进行考察，结果表明：上述的三种多糖均具有良好的抗血栓作用，可单独或组合用于制备抗血栓药物。

附图说明

图1为黑莓籽多糖DEAE-52洗脱曲线；

图2为组分1的SephadexG-100凝胶柱色谱洗脱曲线；

图3为组分2的SephadexG-100凝胶柱色谱洗脱曲线；

图4为组分3的SephadexG-100凝胶柱色谱洗脱曲线；

图5为标准单糖混合物的GC色谱图；图中，1为半乳糖，2为果糖，3为甘露糖，4为鼠李糖，5为阿拉伯糖，6为木糖；

图6为BSP-1水解物的GC色谱图；图中，1为半乳糖，2为果糖，4为鼠李糖，5为阿拉伯糖，6为木糖；

图7为BSP-2水解物的GC色谱图；图中，1为半乳糖，2为果糖，4为鼠李糖，5为阿拉伯糖，6为木糖；

图8为BSP-3水解物的GC色谱图；图中，1为半乳糖，2为果糖，4为鼠李糖，5为阿拉伯糖。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

下述实施例中，所用黑莓籽购自河南省封丘县黑莓种植基地，为蔷薇科悬钩子属植物黑莓（Rubusspp.Blackberry）的籽。

实施例1

1黑莓籽多糖的提取、分离、纯化

1.1黑莓籽多糖提取分离

将黑莓籽粉碎，室温下用石油醚脱脂3次，挥干石油醚后，用70V%乙醇提取3次，过滤，阴干残渣，然后按料液比为20mL/g的比例加入蒸馏水，80℃下提取3次，每次3h。趁热抽滤，合并滤液后减压浓缩，用95V%乙醇调至乙醇的终浓度为70V%，4℃静置24h后离心（10000r/min，10min），得到的沉淀加蒸馏水溶解透析（48h，每4h换一次蒸馏水）以除去小分子杂质，减压浓缩、冷冻干燥即得黑莓籽粗多糖。

取300mg的黑莓籽粗多糖溶于10mL蒸馏水中，过滤，弃去杂质后加入到DEAE-52纤维素柱色谱中(2.5×60cm)，依次用蒸馏水、0.1mol/L氯化钠溶液和0.2mol/L氯化钠溶液进行洗脱，洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，测其在490nm处的吸光度。以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线（见图1），合并同一洗脱峰的多糖样品。透析、浓缩后冷冻干燥。其中，蒸馏水洗脱峰为组分1，0.1mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分2，0.2mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分3。

称取70mg组分1溶于5mL蒸馏水中、过滤弃去杂质，加入到SephadexG-100凝胶柱色谱中(1.5×100cm)，用蒸馏水进行洗脱（洗脱流速为0.5mL/min，每管2mL）采用苯酚-硫酸法进行检测，检测490nm处的吸光度。以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线（见图2），得到两组洗脱峰，浓缩第2组洗脱峰，冷冻干燥得到的多糖命名为BSP-1。

组分2和组分3均采用组分1的方法进行洗脱（绘制的洗脱曲线分别见图3和4）），得单一洗脱峰，分别命名为BSP-2和BPS-3。

分子量的测定和组分分析

2.1分子量测定

多糖样品BSP-1、BSP-2和BSP-3送至北京市理化分析测试中心检测，根据中华人民共和国药典（2010年版）二部附录VH（分子排阻色谱法）进行测定。

分子量测定结果

表1三种多糖的分子量分布

2.3单糖组成分析

2.4多糖的水解

准确称取10mg的BSP-1、BSP-2和BSP-3分别溶于2mL、2mol/L的三氟乙酸中，再转移到5mL安瓿瓶中，充氮气封管。于110℃下水解3h，再用旋转蒸发除去三氟乙酸溶液,残余物中加入少量甲醇溶解，再旋转蒸发到干，如此反复3次，得到水解产物备用。

单糖的衍生化

向水解产物中依次加入10mg盐酸羟胺和0.5mL吡啶，振荡混匀，放入90℃水浴中加热反应30min。取出后冷却至室温，加入0.5mL醋酸酐，在90℃下继续反应30min进行乙酰化，反应产物经0.22μm滤膜过滤后注入气相色谱进行分析；标准单糖用相同方法处理，并制成标准单糖衍生物混合液。

气相色谱条件

色谱柱：ThermoTG-Waxms（30m×0.32mm，0.5μm)；进样温度：250℃；FID检测器温度：280℃；色谱柱升温程序：初始温度100℃保持1min，然后以4℃/min的速率由100℃升至230℃，保持10min；载气：高纯氮气，流速2mL/min；进样量为2μL。

单糖组成分析结果

标准单糖混合物的GC色谱图见图5，图6、7、8分为BSP-1、BSP-2、BSP-3经水解后的单糖GC色谱图，通过和标准单糖图谱中保留时间的比较可以确定样品的单糖组成。由图6可知，BSP-1至少由半乳糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖组成，其摩尔比为半乳糖：果糖：鼠李糖：阿拉伯糖：木糖=19.13:2.27:3.30:5.48:1.78；由图7可知，BSP-2至少由半乳糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖组成，摩尔比为半乳糖：果糖：鼠李糖：阿拉伯糖：木糖=2.55:1.95:7.40:17.98:8.71；由图8可知，BSP-3至少由半乳糖、果糖、鼠李糖和阿拉伯糖组成，其摩尔比=0.58:0.91:3.41:2.63。

实施例2

本实施例为实施例1所得黑莓籽多糖（BSP-1，BSP-2，BSP-3）的抗血栓作用试验。

方法：采用皮下注射盐酸肾上腺素和冰水浴的方法制备大鼠的急性血瘀模型。大鼠连续灌胃7次，考察黑莓籽多糖对急性血瘀模型大鼠血液流变性和凝血四项的影响。

仪器和材料：HF6000-4半自动凝血分析仪、HT-100C血流变粘度测试仪、TGL-16gR高速台式冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；凝血酶原时间（PT）测定试剂盒（105262）、活化部分凝血酶时间（APTT）测定试剂盒（1121781）、凝血酶时间（TT）测定试剂盒（121119）、纤维蛋白原（FIB）含量测定试剂盒（132079）均由上海太阳生物技术有限公司生产。

实验动物：SPF级的SD大鼠，雌雄各半，体重230～270g，由河南省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(豫)2010-0002。

实验方法：雌雄各半的SD大鼠，随机分为7组，每组6只。分别为空白对照组、模型组、阳性对照组和三个给药组。连续给药7次，早晚各一次（每次间隔12h），空白对照组和模型组给予相应的空白溶剂（食用开水），阳性对照组给予阿司匹林（100mg/kg），三个给药组分别给予相应的药物（120mg/kg），即BSP-1，BSP-2，BSP-3。于第5次给药后开始造模，方法如下：

大鼠皮下注射盐酸肾上腺素注射液（0.8mg/kg）2次，间隔时间为4h。第1次皮下给予盐酸肾上腺素后2h，将大鼠置于0～2℃冰水中游泳5min，造成大鼠急性血瘀模型。最后一次皮下注射盐酸肾上腺素后大鼠禁食不禁水饲养，在相应的时间给第六次药。最后一次注射盐酸肾上腺素16h进行最后一次给药，给药30min后用10%水合氯醛（300mg/kg）麻醉大鼠，于腹主动脉取血，测量相应的指标。

数据处理：结果采用算术平均值和标准差表示，数值统计采用SPSS19.0软件单因素方差分析法（One-WayANOVA）比较其显著性差异。测定结果如下：

表1黑莓籽多糖对急性血瘀模型大鼠的全血粘度和血浆粘度的影响

注：Datarepresentmean±SD.n=6；

与空白比较^### P＜0.001,0.001＜^## P＜0.01

与模型比较，^△△△ P＜0.001,0.01＜^△△ P＜0.01，^△ P＜0.05

与阳性对照相比， ^*** P＜0.001，0.001＜ ^** P＜0.01, ^* P＜0.05。

由表1可知，模型组与空白组相比，在高、中、低切变频率下全血粘度均极显著地升高（P<0.001），在中切切变率下的血浆粘度非常显著地升高（0.001<P<0.01），说明大鼠急性血瘀模型造模成功。各给药组与模型组相比，高、中、低切变频率下的全血粘度均显著降低（P<0.001,or,0.001<P<0.01,or,P<0.05），中切变频率下的血浆粘度显著降低（0.001<P<0.01,or,P<0.05），说明BSP-1、BSP-2和BSP-3具有良好的抗血栓活性，且BSP-1降低急性血瘀模型大鼠全血粘度和血浆粘度的效果与阳性对照阿司匹林相当（P>0.05）。

表2黑莓籽多糖对急性血瘀模型大鼠凝血四项的影响

注：Datarepresentmean±SD.n=6；

与空白比较^### P＜0.001,0.001＜^# P＜0.05

与模型比较，^△△△ P＜0.001

与阳性对照相比， ^*** P＜0.001, ^* P＜0.05。

由表2可知：模型组与空白组相比，APTT、PT和TT均极显著地降低，而FIB极显著地升高（P<0.001），说明大鼠急性血瘀模型造模成功。与模型组相比，各给药组能极显著地延长APTT、PT和TT（P<0.001），且BSP-2和BSP-3能极显著地降低FIB（P<0.001）。说明黑莓籽多糖可以通过抑制血液的凝固来抑制血栓的形成。

综上可以看出：BSP-1、BSP-2和BSP-3均具有良好的抗血栓作用，可单独或组合用于制备抗血栓药物。

Claims (3)

1.黑莓籽多糖的提取分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将黑莓籽粉碎，室温下用石油醚脱脂，挥干石油醚后，药渣用乙醇提取，过滤，阴干残渣，再向残渣中加入蒸馏水提取，趁热抽滤，合并滤液后减压浓缩，再向浓缩液中加入乙醇，静置离心，得到的沉淀再加蒸馏水溶解透析以除去小分子杂质，减压浓缩，冷冻干燥即得黑莓籽粗多糖；

（2）取黑莓籽粗多糖溶于蒸馏水中，过滤，弃去杂质后加入到DEAE-52纤维素柱色谱，依次用蒸馏水、0.1mol/L氯化钠溶液和0.2mol/L氯化钠溶液进行洗脱，洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，测490nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，合并同一洗脱峰的多糖样品，透析、浓缩后冷冻干燥；其中，蒸馏水洗脱峰为组分1，0.1mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分2，0.2mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分3；

（3）组分1溶于蒸馏水中、过滤弃去杂质，加入到SephadexG-100凝胶柱色谱，用蒸馏水进行洗脱，采用苯酚-硫酸法进行检测，测其在490nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，得到两组洗脱峰，浓缩第2组洗脱峰，冷冻干燥得到的多糖命名为BSP-1；

（4）组分2和组分3均采用步骤（3）的方法进行洗脱，得到单一洗脱峰，分别命名为BSP-2和BSP-3；

黑莓籽多糖即为BSP-1、BSP-2和BSP-3中的一种或两种以上的混合物。

2.采用权利要求1所述方法制备得到的黑莓籽多糖。

3.权利要求2所述黑莓籽多糖在制备抗血栓药物方面的应用。