CN102964446A - 一种吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法，它包括先从吸血水蛭活体中提取天然水蛭素粗品，然后经过分离纯化得到天然水蛭素粉，所述天然水蛭素粗品的提取是先制备特异性诱导液，并将其灌入肠管中得到含特异性诱导液肠管；再将含特异性诱导液肠管投喂给吸血水蛭，然后提取吸血水蛭的唾液或将吸血水蛭磨浆，制得浆液，即得到天然水蛭素粗品；接着采用常规的生化分离方法进行分离纯化制得天然水蛭素粉。本发明工艺简单、提取率高，且明显降低吸血水蛭提取天然水蛭素粗品后的死亡率，并可有效提高生物资源利用率，从而显著降低生产成本，为提取水蛭体内主要有效活性物质如天然水蛭素提供了一条便捷的途径。

Description

一种吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法

技术领域

本发明涉及一种从动物体中提取有效活性成分的生产方法，特别是以吸血水蛭为原料生产天然水蛭素的方法。

背景技术

水蛭，俗称蚂蟥，是蛭纲动物的总称。它是我国传统名贵中药材，具有破血通经、消积散瘀、消肿解毒等功能，临床上用于治疗跌打损伤、目赤肿痛、脑出血、肝硬化、高血压、高脂血症等症，它是我国35种重要活血化瘀中药材之一。

水蛭依据其食性不同，可分为非吸血水蛭和吸血水蛭两大类：

非吸血水蛭，它主要以螺类（如田螺、福寿螺等）、河蚌等软体动物的汁液为食，不吸血，主产于长江沿岸省份（如湖北、江苏等）的河流、湖泊。常见的是宽体金线蛭（Whitman  pigra Whitman），它是我国药材市场上的主流品种，其体内含有目前尚未清楚的某些活血化瘀成分，但不含水蛭素。

吸血水蛭，主要分布在我国华南的广东、广西等省区，生活在稻田、水沟、江河、池塘和湖泊中，以吸食人和脊椎动物血液为生，其中较为常见的是菲牛蛭（Poecilobdella Manillensis Lesson，俗称金边蚂蟥，它已被广西壮族自治区食品药品监督管理局收录入<<广西壮族自治区壮药质量标准>>第二卷（2011年版））。科学研究表明，由吸血水蛭的唾液腺及其所分泌的唾液中含有丰富的水蛭素hirudin、透明质酸酶Orgelase以及血管扩张剂Vasolilator和麻醉剂Anaesthetic等多种生物活性物质，其中水蛭素是这些活性物质中数量最多、活性最显著并且研究得最多、最深入、最有药用价值和最具发展潜力的一种活性物质。

天然水蛭素于1904年被发现后，经化学分析测定，它是由65个氨基酸残基组成的单链多肽，其分子量较低，为7000D。一直来，世界很多国家的许多科学家都研究证实，水蛭素是迄今为止世界上所发现的已知物质中最强的天然抗凝血酶物质，对人类心脑血管疾病尤其是脑血栓等血栓性疾病有较高的疗效，其防治效果是任何物质（包括目前临床上常规使用的阿司匹林和肝素）所难以比拟的，这是因为：一方面，天然水蛭素的抗栓功能不需要其它因子的参与，加上其分子量远比肝素要小，渗透性强，容易到达血栓内部，并将其溶解；另一方面，天然水蛭素不会像肝素等抗凝剂那样易引起出血等难以克服的副作用，从而使天然水蛭素成为世界公认的防治心脑血管疾病最好的天然药物。

目前，能够从水蛭体内提取天然水蛭素的吸血水蛭仅分布于华南的广东、广西和海南等少数的几个省区，其分布范围较窄，且品种和数量均有限，加上天然水蛭素都是存在于吸血水蛭唾液腺及其所分泌的唾液中，在这以前，国内外大多都是采用传统的提取工艺和技术，即选用吸血水蛭的头部或整体进行匀浆或粉碎后，再利用水—丙酮混合剂或生理盐水萃取，然后经过乙醇分级沉淀、普通层析和等电聚焦等步骤提取这些生物活性物质。如默克专利股份有限公司在专利申请号为CN00808873.X《来源于马尼拉水蛭的透明质酸酶,分离、纯化和重组生产方法》中公开的的是用酸性缓冲液匀浆马尼拉水蛭中的水蛭的头离心后，用离子交换层析等方法分离纯化透明质酸酶；如胡维民在专利申请号CN92107076《医用天然水蛭素的提取方法》中公开了用整条水蛭匀浆后提取水蛭素；又如胡远华在专利申请号CN95105650《动物血水蛭水解法及其水蛭水解血》中公开的是使食血水蛭充分吸取动物血数分钟或数小时后用物理或化学方法使血液从水蛭体内流出，收集流出的橙红色血液，本法能有效降解动物血并使之含有医用价值的水蛭素等水蛭分泌物。

对现有技术中天然水蛭素的生产方法检索如下：

1、中国专利号：ZL03113566.8，发明名称：从菲牛蛭活体中提取天然水蛭素的方法。该发明是将清洗干净的菲牛蛭用诱导物质充分喂饱菲牛蛭，然后对菲牛蛭进行挤压使其分泌出唾液（水蛭素粗品），所采用的诱导物质包括无机盐、有机酸和浓度较低的无机酸，选用乙酸、盐酸、磷酸、柠檬酸、精氨酸、赖氨酸、抗坏血酸、胱氨酸、氯化钠、氯化钾、碳酸钠、磷酸钠或磷酸二氢钾的一种或两种、两种以上的混合物，其重量百分浓度为0.1-3%，水溶液的PH在4.5-6.8之间。具体方法是先配置好纯净的混合水溶液，让菲牛蛭充分吃饱，然后对其进行挤压，使其分泌出唾液，每隔一周或10天提取一次，每条鲜活菲牛蛭可以反复提取6-7次，每次能提取水蛭素粗品6-7毫升左右。该法的缺点是：对充分吃饱的菲牛蛭经人工挤压使其分泌出唾液后，菲牛蛭的口腔损伤严重，致使其很容易感染疾病或因体质虚弱很难恢复而造成大批死亡，同时，两次间提取的时间间隔太短，菲牛蛭在得不到营养的补充，机体尚未得到充分恢复后就进入下一次的提取，这样，一方面提取出来的水蛭素粗品数量少，水蛭素含量低，更重要的是另一方面会造成菲牛蛭的死亡明显升高，从而直接导致生产成本过高。

2、中国专利申请号：201010526681.7  发明名称：一种从天然水蛭中提取高抗凝活性水蛭素的方法。该发明是将氯化钠、一水乙酰半胱氨酸盐酸盐、赖氨酸、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的两种或多种物质进行组合，溶解于去离子水中配制成刺激液，刺激液中各物质的重量百分浓度为0.01～5％，其中酶浓度在100U～300U/ml。将活体水蛭称重后置于容器中，按水蛭重量比刺激液体积为1∶1～5倍加入所述刺激液，刺激3小时使水蛭分泌分泌液，分泌液经过16000～20000r/min离心分离得水蛭素粗品，经0.2微米不锈钢膜微滤，再经10000～3000道尔顿分子量的有机膜超滤，再进行反渗透纳滤浓缩，然后按固体比液体的重量体积比为1：6～10加入药用淀粉调配，经喷雾干燥，得水蛭素成品。最终水蛭素提取得率在30％以上，产品活性单位稳定在600AT-U/g至1000AT-U/g。该法的缺点是：刺激液中含有中性蛋白酶、木瓜蛋白酶，这些酶类物质均能破坏水蛭素的化学结构而致使其活性降低进而影响水蛭素的疗效。

3、《黑龙江医药科学》2010年第33卷第04期 87页中“水蛭素的提取及含量测定”分别介绍了用一种不同浓度的氯化钠或其与L- 精氨酸组成的诱导溶液对活体水蛭进行诱导, 收集水蛭唾液腺分泌物, 测定水蛭素含量的报道。该法的缺点是：采用化学物质作为诱导溶液。

  4、中国专利申请号：201110237495.6，发明名称：一种天然水蛭素的生产方法。该发明经含天然水蛭素液体的提取、酸沉、加热、脱水和干燥等步骤，所得到的天然水蛭素粉末。该法主要是用水蛭素液体即水蛭素粗品进行分离化的过程。

5、中国专利申请号：200710026461.6，发明名称：一种以菲牛蛭唾液为原料的水蛭素生产工艺。该发明将菲牛蛭唾液冷冻，然后再解冻，用生理盐水提取，提取液煮沸、过滤、取滤液。固形物用生理盐水提取，过滤。滤液煮沸后迅速冷却，冷藏过夜。离心，取上清液减压浓缩后再冷冻干燥成冻干粉。该法是用水蛭素唾液即水蛭素粗品进行分离化的过程，其步骤繁多。

6、中国专利申请号：201010604457.5，发明名称：用电刺激活体水蛭提取水蛭素的方法。该发明采用电流对生物体腺体得刺激作用，直接使用直流弱电刺激活体水蛭批量提取高纯度水蛭素的方式。该发明在刺激提取水蛭素的过程中，加入了保护剂，而后提取的水蛭素经过纳滤除水，减压喷雾干燥，制备成粉状水蛭素。该法的缺点是：直接使用直流弱电刺激活体水蛭时，水蛭就会立即收缩成坚硬的一团（因水蛭为无脊椎动物），难以提取水蛭素。

7、中国专利：200710066096.1 ，发明名称：一种天然水蛭素有效成分的提取方法。该发明公开了一种天然水蛭素有效成分的提取方法，是用水清洗吸血水蛭干净后加入含量15～25％的乙醇水溶液浸泡30-50小时后，过滤，得滤液和药渣；将菲牛蛭药渣绞碎，再加含量15～25％的丙酮水溶液浸泡，滤过，得滤液，分别将两次滤液真空回收乙醇和丙酮后，合并滤液，常规真空冷冻干燥，得到产品。该发明工艺简单、成本低廉，收率较高、产品质量好、保存期长，但在天然水蛭素提取过程中，要使用到乙醇、丙酮，而丙酮属于有机物，有一定毒性。

从上述专利可以看出，都是使用了化学物质作为诱导液对活体吸血水蛭进行诱导，其安全性受到质疑。同时如采用人工挤压的方法取出水蛭唾液腺分泌物即天然水蛭素粗品，其缺点是在诱导液中没有防治感染的药物，从而造成挤压后损伤了水蛭的口腔，直接导致水蛭很容易感染疾病或体弱、体质下降而致使其死亡率升高，使生产成本明显增加，经济效益不明显。

 

发明内容

本发明的目的是提供一种吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法，即以常见的天然动物蚯蚓的提取液作为特异发性诱导液，并在其中加入抑菌消炎和增强机体体质的物质，同时，每次提取天然水蛭素粗品的时间间隔为11~60天，这样就能克服现有专利中的缺点，从而明显提高吸血水蛭多次提取其唾液即天然水蛭素粗品后的成活率，并且提高天然水蛭素粗品中的水蛭素含量，使其生产成本明显下降，经济效益显著。

本发明的技术方案如下：

一种吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法，它包括先从吸血水蛭活体中提取天然水蛭素粗品，然后经过分离纯化得到天然水蛭素粉。所述天然水蛭素粗品的提取是先制备特异性诱导液，并将其灌入肠管中得到含特异性诱导液肠管；再将含特异性诱导液肠管投喂给吸血水蛭，然后提取吸血水蛭的唾液或将吸血水蛭磨浆，制得浆液，即得到天然水蛭素粗品。

所述特异性诱导液的制备为：在每1000ml特异性诱导液中含有蚯蚓提取液10～300ml，壳聚糖5～50g，黄芪多糖1～20g，葡萄糖粉1～30g；先用适量水溶解上述粉状物质后，加入蚯蚓提取液，再用水加至1000ml，即得到特异性诱导液，备用。

所述蚯蚓提取液，是指将蚯蚓活体或其新鲜冰冻尸体加水，磨浆、过滤得到的滤液。其具体的制备方法是：在清洗干净的蚯蚓活体或其新鲜冰冻尸体中加入1～3倍的干净水，用胶体磨匀浆2～3次、再用100~300目筛网过滤后所得到的滤液即为蚯蚓提取液。本发明中的蚯蚓提取液具有刺激活体吸血水蛭摄食即诱食等作用。

     蚯蚓中药名为地龙，又有土龙、蛐蟮、寒蚓等多个名称，是指环节动物门寡毛纲的动物，主要是指后孔寡毛目的陆栖动物，如参环毛蚓、通俗环毛蚓、赤子爱胜蚓、红色爱胜蚓等。蚯蚓内含多种微量元素和多种具有活性作用的酶类物质。

本发明中的壳聚糖具有良好的营养价值和抑菌消炎防腐等作用，既可有效保护蚯蚓提取液而防止其变质，同时能够有效防治在提取天然水蛭素粗品过程中因挤压损伤吸血水蛭口腔而引起的条件性感染性疾病。

所述黄芪多糖具有：（1）增强机体免疫功能：黄芪多糖富含或特异性的排除侵入机体的异物，对特异性免疫和非特异性免疫均有促进作用，提高机体的抗病能力。（2）促生长作用：黄芪多糖富含多种氨基酸、维生素和多种微量元素，可增加营养，改善食欲，促进生长。（3）抗细菌作用：黄芪多糖对细菌及其病毒性产物有直接抑杀和解毒作用。更主要的是能过调动机体免疫防御功能而发挥扶正祛邪抑菌，杀菌作用。（4）抗病毒作用：黄芪多糖对于干扰素系统有明显的刺激作用，使动物机体产生内源性干扰素，抑制病毒的复制，从而达到抗病毒的目的。黄芪多糖的加入对吸血水蛭身体机能的提高具有促进作用。

 所述葡萄糖是生物体内新陈代谢不可缺少的营养物质，它的氧化反应放出的热量是动物所需能量的重要来源。这样可及时为吸血水蛭快速补充能量，以恢复体质及能量。

所述含特异性诱导液肠管的制备是将制备好的特异性诱导液灌入新鲜的动物大小肠、动物小肠肠衣或人工肠衣内，灌满后用线扎紧肠管两端使其膨胀，每段肠管长为10～100cm。

所述吸血水蛭的投喂是将饥饿15天以上的吸血水蛭分散放在容器中，然后投放含特异性诱导液肠管，让吸血水蛭自由吸吮，在10～60分种内吃饱，吸饱后的吸血水蛭其体重增加1～10倍。

所述吸血水蛭唾液的提取是将吃饱特异性诱导液后的吸血水蛭静置30～120分钟，然后采用物理挤压的方法提取并收集其体内的唾液即天然水蛭素粗品，待唾液提取完成之后继续按常规的方法对吸血水蛭进行养殖管理（在提取天然水蛭素粗品期间不投料），以备供下一次提取天然水蛭素粗品用。所述吸血水蛭唾液提取的时间间隔为11～60天进行一次，每条水蛭可反复提取天然水蛭素粗品3～5次，每次可得天然水蛭素粗品8～12ml。

所述吸血水蛭磨浆制得浆液是指将经过3～5次水蛭素粗品提取之后的吸血水蛭在吸饱特异性诱导液后再进行整体磨浆，然后用20～300目的筛网过滤，取其滤液即为制得的浆液即为天然水蛭素粗品。这一步的主要目的是为了充分利用原料，将原料的价值发挥到最大化。因为经过多次唾液收集之后的吸血水蛭分泌唾液量减少，同时天然水蛭素的含量也在逐步降低，因此在提取一定次数之后将吸血水蛭进行匀浆进行最后一次水蛭素提取，同时发挥它身体的重要的药用价值。

本发明提取的天然水蛭素粗品中的抗凝血酶活性即水蛭素含量为5～50 AT-U（国际单位）/ml。

所述天然水蛭素粗品分离纯化是指天然水蛭素粗品装入容器内，置于40～49℃的恒温水浴中加热30～90分钟，取出冷却至常温，然后用160～300目筛网过滤，取其滤液，然后在3000r/min～15000r/min的离心机离心5～30分钟，取其滤液，再用膜分离、透析法、电泳法或层析法等常规的生化分离方法对其进行分离纯化得到浓缩液，再加入辅料如药用淀粉、甘露醇等后进行冷冻干燥后即得到天然水蛭素粉末。

本发明制备的特异性诱导液能诱导环节动物门蛭纲所有吸血水蛭，其中包括医蛭科和山蛭科的水蛭如菲牛蛭（俗称：金边蚂蟥）、日本医蛭、棒纹牛蛭、湖北牛蛭、海南山蛭等。

天然水蛭素，它是迄今为止世界上所发现的已知物质中最强的天然抗凝血酶物质，其作用优于肝素，对防治人类心脑血管疾病尤其是脑血栓等血栓性疾病具有较高的疗效，此外，还可广泛应用化妆品和保健食品、药品等领域。

本发明产品可利用Markwardt的凝血酶直接滴定法测定抗凝血酶活性即天然水蛭素的含量来监控产品质量。

本发明的优点是：

1、本发明的特异性诱导液是一种纯天然的特异性诱导液，诱导液中的成分无毒、无害、无腐蚀性，这样有利于天然水蛭素的提取和分离纯化；诱导液中含蚯蚓提取液，其含有多种微量元素及活性酶类物质，能够诱导吸血水蛭吮吸。

2、本发明中的壳聚糖具有良好的营养价值和抑菌消炎防腐等作用，可有效提高在提取天然水蛭素粗品过程中吸血水蛭成活率。

3、本发明提高了吸血水蛭的免疫力，在特异性诱导液中添加了黄芪多糖和葡萄糖，这样可为吸血水蛭及时补充其所需的营养和能量，这为反复进行活体水蛭提取天然水蛭素粗品打下了坚实的基础，同时，黄芪多糖为免疫促进剂或调节剂，可增强机体免疫功能，改善机体肠道内环境，促进有益群菌乳酸杆菌的生长，以维持肠道微生态区系的平衡和稳定，从而有利于防治各种病毒感染、细菌性疾病。黄芪多糖的加入可有效防治在提取天然水蛭素粗品过程中因挤压损伤水蛭口腔而引起的条件性感染性疾病，从而提高了吸血水蛭提取其唾液即天然水蛭素粗品后的成活率，减少了死亡率，降低生产成本。

4、本发明工艺简单，天然水蛭素的提取率稳定，提取总量较高。因为采用本发明的方法：（1）一条活体水蛭最多可提取天然水蛭素粗品5次，每次提取天然水蛭素粗品12ml，总共可提取天然水蛭素粗品75ml，比现有的专利：每条水蛭可反复提取天然水蛭素粗品6～7次，每次可得天然水蛭素粗品6～7ml，总共可提取天然水蛭素粗品49ml的提高22.4%；（2）水蛭素提取时间合理，每隔11～60天进行提取天然水蛭素粗品一次，这样其水蛭素含量较高；因为水蛭素的分泌是有一个时间恢复过程的。（3）在最后一次吸血水蛭吸饱特异性诱导液后即对其整条进行磨浆、过滤得到滤液即天然水蛭素粗品，这样就充分利用了水蛭尸体提取其内所含的天然水蛭素，从而达到了原料综合利用的目的。

具体实施例

下面结合具体实例来对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围并不局限实施例表示的范围。

实施例1

本发明的方法包括天然水蛭素粗品的提取和天然水蛭素粗品的分离纯化。

1、天然水蛭素粗品提取按如下步骤进行：

（1）特异性诱导液的制备：

 A、制备蚯蚓提取液：取用水清洗干净的赤子爱胜蚓活体200g，加入200ml的干净水、经用胶体磨匀浆2次、用100目筛网过滤后所得到的滤液即为蚯蚓提取液，备用。

B、先量取上述的蚯蚓提取液120ml，称取壳聚糖60g、黄芪多糖12g、葡萄糖粉12g；先用适量干净水溶解上述粉状物质后，然后加入蚯蚓提取液，再用干净水加至10000 ml即成特异性诱导液，备用。

（2）含特异性诱导液肠管的制备：将上述制备好的特异性诱导液12000 ml灌入充分去除内容物后的猪小肠内，按每隔50cm为一段，灌满后用线扎紧肠管两端使其充分膨胀，备用。

（3）含特异性诱导液肠管的投喂：选取未经提取过天然水蛭素粗品、总重量为1000g、已饥饿45天的菲牛蛭活体分散放在容器里，然后将上述制备好的含特异性诱导液肠管平铺在其内，让菲牛蛭自由吸吮小肠内的诱导液；在25分钟后菲牛蛭吸饱了诱导液，其总体重增加到8250g，净增重7250g，是其体重的7.25倍。

 （4）菲牛蛭唾液的收集：将吃饱诱导液后的菲牛蛭让其静置45分钟后再采用人工挤压法挤出菲牛蛭唾液，每条水蛭能够提取天然水蛭素粗品8~10ml，即得到天然水蛭素粗品5090ml。经测定，这些粗品含天然水蛭素34 AT-U／ml。

2、天然水蛭素粗品的分离纯化

 将上述得到的天然水蛭素粗品用200目筛网过滤，取其滤液放入容器内，置于45℃的恒温水浴中隔水加热60分钟，取出冷却至常温，接着用160目筛网过滤，取其滤液，用15000转/分钟的离心机进行离心15分钟，取其滤液，用分子量为7000D的超滤膜进行超滤，得浓缩液2011 ml（含天然水蛭素64 AT-U／ml），加入药用淀粉80g，经冷冻干燥后得到天然水蛭素粉末79g（含天然水蛭素1629AT-U／g）。提取率为 74.3％。

实施例2

本发明的方法包括天然水蛭素粗品的提取和天然水蛭素粗品的分离纯化。

1、天然水蛭素粗品提取按如下步骤进行：

 A、制备蚯蚓提取液：取新鲜冰冻的红色爱胜蚓6千克，解冻后加入18L的干净水、经用胶体磨匀浆3次、用200目筛网过滤后所得到的滤液即为蚯蚓提取液，备用。   

B、量取上述的蚯蚓提取液15L，称取壳聚糖2500g、黄芪多糖1000g、葡萄糖粉1500g；先用适量干净水溶解上述粉状物质后，接着加入蚯蚓提取液，再用干净水加至50L即成特异性诱导液，备用。

（2）含特异性诱导液肠管的制备：将上述制备好的特异性诱导液50L灌入充分去除内容物后的猪大肠内，按每隔10cm为一段，灌满后用线扎紧肠管两端使其充分膨胀，备用。

（3）含特异性诱导液肠管的投喂：选取已经提取过天然水蛭素粗品三次（每隔11~60天提取一次）、总重量为12500g，已饥饿15天的湖北牛蛭活体分散放在容器里，然后将上述制备好的特异性诱导液肠管平铺在其内，让湖北牛蛭自由吸吮肠衣内的诱导液；在40分钟后日本医蛭蛭吸饱了诱导液，其总体重增加到25252g，净增重12752g，是其体重的1.02倍。

（4）日本医蛭唾液的收集：将吃饱诱导液后的湖北牛蛭让其静置60分钟后再采用人工挤压法挤出日本医蛭唾液，每条水蛭能够提取天然水蛭素粗品8~9ml，即得到天然水蛭素粗品10236 ml。经测定，这些粗品含天然水蛭素50AT-U／ml。

2、天然水蛭素粗品的分离纯化

 将上述得到的天然水蛭素粗品用200目筛网过滤，取其滤液放入容器内，置于47℃的恒温水浴中隔水加热45分钟，取出冷却至常温，接着用200目筛网过滤，取其滤液，再用10000转/分钟的离心机进行离心25分钟，取其滤液，经凝胶层析后得浓缩液3176 ml（含天然水蛭素113AT-U／ml），加入甘露醇500g，经冷冻干燥后得到天然水蛭素粉末494g（含天然水蛭素727AT-U／g），提取率为 70.1％。

 

实施例3

本发明的方法包括天然水蛭素粗品的提取和天然水蛭素粗品的分离纯化。

1、天然水蛭素粗品提取按如下步骤进行：

（1）特异性诱导液的制备：

 A、制备蚯蚓提取液：取用水洗干净的通俗环毛蚓活体300克，加入600ml的干净水、经用胶体磨匀浆3次、用300目筛网过滤后所得到的滤液即为蚯蚓提取液，备用。   

B、量取上述的蚯蚓提取液450 ml，称取壳聚糖68g、黄芪多糖45g、葡萄糖粉780g；先用适量干净水溶解上述粉状物质后，加入蚯蚓提取液，再用干净水加至3L 即成特异性诱导液，备用。

（2）含特异性诱导液肠管的制备：将上述制备好的特异性诱导液3L灌入猪小肠肠衣内，按每隔75cm为一段，灌满后用线扎紧肠管两端使其充分膨胀，备用。

（3）含特异性诱导液肠管的投喂：选取已经提取过天然水蛭素粗品五次（每隔11~60天提取一次）、总重量为750克，已饥饿21天的菲牛蛭活体分散放在容器里，然后将上述制备好的含特异性诱导液肠管平铺在其内，让菲牛蛭自由吸吮肠衣内的诱导液；在50分钟后菲牛蛭吸饱了诱导液，其总体重增加到2927g，净增重2177g，是其体重的2.9倍。

（4）吸血水蛭磨浆，制得浆液：将喂养吸饱特异性诱导液后的吸血水蛭整条进行磨浆，先经30目筛过滤，后经过300目筛网过滤，去渣得滤液，制得浆液即天然水蛭素粗品2643ml（含天然水蛭素22AT-U／ml）。

2、天然水蛭素粗品的分离纯化

 将上述得到的天然水蛭素粗品用300目筛网过滤，取其滤液，置于49℃的恒温水浴中加热30分钟，取出冷却至常温，再用300目筛网过滤，取其滤液，再用3000转/分钟的离心机进行离心30分钟，取其滤液，经电泳后得浓缩液511ml（含天然水蛭素83AT-U／ml），加入甘露醇100g，经冷冻干燥后得到天然水蛭素粉末93g（含天然水蛭素456AT-U／g），提取率为 72.9％。

 

实施例4

本发明的方法包括天然水蛭素粗品的提取和天然水蛭素粗品的分离纯化。

1、天然水蛭素粗品提取按如下步骤进行：

（1）特异性诱导液的制备：

A、制备蚯蚓提取液：取干净的通俗环毛蚓活体3.5千克，加入9L的干净水、经用胶体磨匀浆2次用、100目筛网过滤后所得到的滤液即为蚯蚓提取液，备用。   

B、量取上述的蚯蚓提取液8 L，称取壳聚糖3000g、黄芪多糖600g、葡萄糖粉1500g；先用适量干净水溶解上述粉状物质后，接着加入蚯蚓提取液，再用干净水加至85 L 即成特异性诱导液，备用。

   （2）含特异性诱导液肠管的制备：将上述制备好的特异性诱导液85 L灌入充分去除内容物后的羊小肠内，按每隔20cm为一段，灌满后用线扎紧肠管两端使其充分膨胀，备用。

（3）含特异性诱导液肠管的投喂：选取未经提取过天然水蛭素粗品、总重量为7060g、已饥饿60天的棒纹牛蛭活体分散放在容器里，然后将上述制备好的含特异性诱导液肠管平铺在其内，让棒纹牛蛭自由吸吮肠内的诱导液；在32分钟后棒纹牛蛭吸饱了诱导液，其总体重增加到75542g，净增重68482g，是其体重9.7倍。

（4）棒纹牛蛭唾液的收集：将吃饱诱导液后的棒纹牛蛭让其静置120分钟后再采用人工挤压法挤出棒纹牛蛭唾液，每条水蛭能够提取天然水蛭素粗品10~12ml，即得到天然水蛭素粗品42740 ml（含天然水蛭素5 AT-U／ml）。

2、天然水蛭素粗品的分离纯化

 将上述得到的天然水蛭素粗品用300目筛网过滤，取其滤液，置于49℃的恒温水浴中加热30分钟，取出冷却至常温，再用300目筛网过滤，取其滤液，再用3000转/分钟的离心机进行离心30分钟，取其滤液，经电泳后得浓缩液1895ml（含天然水蛭素77AT-U／ml），加入甘露醇700g，经冷冻干燥后得到天然水蛭素粉末695g（含天然水蛭素210AT-U／g），提取率为 68.4％。

 

实施例5

本发明的方法包括天然水蛭素粗品的提取和天然水蛭素粗品的分离纯化。

   1、天然水蛭素粗品提取按如下步骤进行：

（1）特异性诱导液的制备：

 A、制备蚯蚓提取液：取新鲜冰冻的赤子爱胜蚓900g，解冻后加入1500ml的干净水、经用胶体磨匀浆2次、用100目筛网过滤后所得到的滤液即为蚯蚓提取液，备用。   

B、量取上述的蚯蚓提取液1300ml，称取壳聚糖125g、黄芪多糖75g、葡萄糖粉185g；先用适量干净水溶解上述粉状物质后，加入蚯蚓提取液，再用干净水加至7000 ml即成特异性诱导液，备用。

（2）含特异性诱导液肠管的制备：将上述制备好的特异性诱导液7000 ml灌入人工肠衣内，按每隔100cm为一段，两端用线扎紧使肠管膨胀，备用。

（3）含特异性诱导液肠管的投喂：选取未经提取过天然水蛭素粗品、总重量为1350g、已饥饿55天的海南山蛭活体分散放在容器里，然后将上述制备好的含特异性诱导液肠管平铺在其内，让海南山蛭自由吸吮肠衣内的诱导液；在27分钟后海南山蛭吸饱了诱导液，其总体重增加到5469g，净增重4119g，是其体重的3.05倍。

（4）海南山蛭唾液的收集：将吃饱诱导液后的海南山蛭让其静置90分钟后再采用人工挤压法挤出海南山蛭唾液即得到天然水蛭素粗品2843ml。经测定，这些粗品含天然水蛭素29AT-U／ml。

2、天然水蛭素粗品的分离纯化

 将上述得到的天然水蛭素粗品用250目筛网过滤，取其滤液，置于40℃的恒温水浴中加热90分钟，取出冷却至常温，接着用200目筛网过滤，取其滤液，用8000转/分钟的离心机进行离心20分钟，取其滤液，经透析后得浓缩液2246ml（含天然水蛭素52AT-U／ml），加入药用淀粉1500g，经冷冻干燥后得到天然水蛭素粉末1494g（含天然水蛭素79AT-U／g）。提取率为 78.9％。

 

实施例6

本发明的方法包括天然水蛭素粗品的提取和天然水蛭素粗品的分离纯化。

1、天然水蛭素粗品提取按如下步骤进行：

（1）特异性诱导液的制备：

 A、制备蚯蚓提取液：取用水清洗干净的红色爱胜蚓活体350g，加入600ml的干净水、经用胶体磨匀浆3次、用100目筛网过滤后所得到的滤液即为蚯蚓提取液，备用。

B、量取上述的蚯蚓提取液440ml，称取壳聚糖95g、黄芪多糖45g、葡萄糖粉105g；先用适量干净水溶解上述粉状物质后，加入蚯蚓提取液，再用干净水加至5500 ml即成特异性诱导液，备用。

   （2）含特异性诱导液肠管的制备：将上述制备好的特异性诱导液5500 ml灌入充分去除内容物后的猪小肠内，按每隔35cm为一段，两端用线扎紧使肠管膨胀，备用。

（3）含特异性诱导液肠管的投喂：选取已经提取过天然水蛭素粗品三次、重量为为850g、已饥饿49天的菲牛蛭活体分散放在容器里，然后将上述制备好的含特异性诱导液肠管平铺在其内，让菲牛蛭自由吸吮小肠内的诱导液；在34分钟后菲牛蛭吸饱了诱导液，其总体重增加到3521g，净增重2671g，是其体重的3.07倍。

（4）菲牛蛭唾液的收集：将吃饱诱导液后的菲牛蛭让其静置30分钟后再采用人工挤压法挤出菲牛蛭唾液即得到天然水蛭素粗品1837 ml。经测定，这些粗品含天然水蛭素17 AT-U／ml。

 2、天然水蛭素粗品的分离纯化

 将上述得到的天然水蛭素粗品用250目筛网过滤，取其滤液，置于47℃的恒温水浴中加热80分钟，取出冷却至常温，接着用200目筛网过滤，取其滤液，用3000转/分钟的离心机进行离心18分钟，取其滤液，用层析法对其进行分离纯化，得浓缩液399 ml（含天然水蛭素56AT-U／ml），加入食用玉米淀粉150g，经冷冻干燥后得到天然水蛭素粉末148g（含天然水蛭素151AT-U／g）。提取率为 71.3％。

 

实施例7

本发明的方法包括天然水蛭素粗品的提取和天然水蛭素粗品的分离纯化。

1、天然水蛭素粗品提取按如下步骤进行：

（1）特异性诱导液的制备：

A、制备蚯蚓提取液：取新鲜冰冻的通俗环毛蚓1.5千克，解冻后加入4L的干净水、经用胶体磨匀浆3次、用100目筛网过滤后所得到的滤液即为蚯蚓提取液，备用。   

B、量取上述的蚯蚓提取液3.3L，称取壳聚糖400g、黄芪多糖250g、葡萄糖粉50g；先用适量干净水溶解上述粉状物质后，接着加入蚯蚓提取液，再用干净水加至18L即成特异性诱导液，备用。

（2）含特异性诱导液肠管的制备：将制备好的含特异性诱导液肠管灌入充分去除内容物后的牛小肠内，按每隔15cm为一段，两端用线扎紧使肠管膨胀，备用。

（3）含特异性诱导液肠管的投喂：选取已经提取过天然水蛭素粗品三次、重量为3555g、已饥饿15天的菲牛蛭活体分散放在容器里，然后将上述制备好的肠管平铺在其内，让菲牛蛭自由吸吮小肠内的诱导液；在41分钟后菲牛蛭吸饱了诱导液，其总体重增加到8177g，净增重11732g，是其体重的2.3倍。

（4）菲牛蛭唾液的收集：将吃饱诱导液后的菲牛蛭让其静置50分钟后再采用人工挤压法挤出菲牛蛭唾液即得到天然水蛭素粗品9943 ml（含天然水蛭素28 AT-U／ml）。

  2、天然水蛭素粗品的分离纯化

 将上述得到的天然水蛭素粗品用300目筛网过滤，取其滤液，置于47℃的恒温水浴中加热40分钟，取出冷却至常温，接着用200目筛网过滤，取其滤液，用5000转/分钟的离心机进行离心10分钟，取其滤液，用层析法对其进行分离纯化，得浓缩液2234 ml（含天然水蛭素93AT-U／ml），加入食用木薯淀粉650g，经冷冻干燥后得到天然水蛭素粉末641g（含天然水蛭素324AT-U／g）。提取率为 74.6％。

 

实施例8

本发明的方法包括天然水蛭素粗品的提取和天然水蛭素粗品的分离纯化。

1、天然水蛭素粗品提取按如下步骤进行：

（1）特异性诱导液的制备：

A、制备蚯蚓提取液：取干净的参环毛蚓活体2.5千克，加入3L的干净水、经用胶体磨匀浆2次、用100目筛网过滤后所得到的滤液即为蚯蚓提取液，备用。   

B、量取上述的蚯蚓提取液2.5L，称取壳聚糖310g、黄芪多糖125g、葡萄糖粉600g；先用适量干净水溶解上述粉状物质后，接着加入蚯蚓提取液，再用干净水加至23L即成特异性诱导液，备用。

   （2）含特异性诱导液肠管的制备：将上述制备好的特异性诱导液23L灌入充分去除内容物后的猪小肠内，按每隔40cm为一段，两端用线扎紧使肠管膨胀，备用。

（3）含特异性诱导液肠管的投喂：选取未经提取过天然水蛭素粗品、重量为2000g、体重在2g以上、已饥饿83天的棒纹牛蛭活体分散放在容器里，然后将上述制备好的含特异性诱导液肠管平铺在其内，让棒纹牛蛭自由吸吮小肠内的诱导液；在32分钟后棒纹牛蛭吸饱了诱导液，其总体重增加到13616g，净增重11616g，是其体重5.8倍。

（4）棒纹牛蛭唾液的收集：将吃饱诱导液后的棒纹牛蛭让其静置95分钟后再采用人工挤压法挤出棒纹牛蛭唾液即得到天然水蛭素粗品8827 ml（含天然水蛭素37 AT-U／ml）。

2、天然水蛭素粗品的分离纯化

 将上述得到的天然水蛭素粗品用250目筛网过滤，取其滤液，置于45℃的恒温水浴中加热60分钟，取出冷却至常温，接着用250目筛网过滤，取其滤液，用8000转/分钟的离心机进行离心5分钟，取其滤液，用层析法对其进行分离纯化，得浓缩液3493 ml（含天然水蛭素69AT-U／ml），加入食用玉米淀粉2000g，经冷冻干燥后得到天然水蛭素粉末1991g（含天然水蛭素121AT-U／g）。提取率为 73.3％。

 

实施例9

本发明的方法包括天然水蛭素粗品的提取和天然水蛭素粗品的分离纯化。

1、天然水蛭素粗品提取按如下步骤进行：

（1）特异性诱导液的制备：

 A、制备蚯蚓提取液：取新鲜冰冻的参环毛蚓1.5千克，解冻后加入2L的干净水、经用胶体磨匀浆3次、用100目筛网过滤后所得到的滤液即为蚯蚓提取液，备用。   

B、量取上述的蚯蚓提取液1.8L，称取壳聚糖150g、黄芪多糖55g、葡萄糖粉285g；先用适量干净水溶解上述粉状物质后，接着加入蚯蚓提取液，再用干净水加至16L即成特异性诱导液，备用。

（2）含特异性诱导液肠管的制备：将上述制备好的特异性诱导液16L灌入人工肠衣内，按每隔55cm为一段，两端用线扎紧使其膨胀，备用。

（3）含特异性诱导液肠管的投喂：选取已经提取过天然水蛭素粗品一次、重量为1550g，已饥饿105天的日本医蛭活体分散放在容器里，然后将上述步骤（2）制备好的含特异性诱导液肠管平铺在其内，让日本医蛭自由吸吮肠衣内的诱导液；在25分钟后日本医蛭吸饱了诱导液，其总体重增加到8064g，净增重6514g，是其体重的4.2倍。

（4）日本医蛭唾液的收集：将吃饱诱导液后的日本医蛭让其静置100分钟后再采用人工挤压法挤出日本医蛭唾液即得到天然水蛭素粗品4886 ml。经测定，这些粗品含天然水蛭素28AT-U／ml。

2、天然水蛭素粗品的分离纯化

将上述得到的天然水蛭素粗品用300目筛网过滤，取其滤液，置于43℃的恒温水浴中加热85分钟，取出冷却至常温，接着用250目筛网过滤，取其滤液，用7000转/分钟的离心机进行离心18分钟，取其滤液，经膜分离后得浓缩液1207ml（含天然水蛭素77 AT-U／ml），加入食用木薯淀粉350g，经冷冻干燥后得到天然水蛭素粉末346g（含天然水蛭素269AT-U／g），提取率为 67.6％。

 

实施例10

本发明的方法包括天然水蛭素粗品的提取和天然水蛭素粗品的分离纯化。

1、天然水蛭素粗品提取按如下步骤进行：

1、特异性诱导液的制备：

 A、制备蚯蚓提取液：取干净的红色爱胜蚓活体500g，加入800ml的干净水、经用胶体磨匀浆2次、用100目筛网过滤后所得到的滤液即为蚯蚓提取液，备用。   

B、量取上述的蚯蚓提取液550ml，称取壳聚糖40g、黄芪多糖35g、葡萄糖粉75g；先用适量干净水溶解上述粉状物质后，接着加入蚯蚓提取液，再用干净水加至3000 ml即成特异性诱导液，备用。

（2）含特异性诱导液肠管的制备：将上述制备好的特异性诱导液3000 ml灌入猪小肠肠衣内，按每隔45cm为一段，两端用线扎紧使其膨胀，备用。

（3）含特异性诱导液肠管的投喂：选取已经提取过天然水蛭素粗品四次、重量为500g、已饥饿55天的湖北牛蛭活体分散放在容器里，然后将上述制备好的含特异性诱导液肠管平铺在其内，让湖北牛蛭自由吸吮肠衣内的诱导液；在45分钟后湖北牛蛭吸饱了诱导液，其总体重增加到1912g，净增重1412g，是其体重的2.82倍。接着对这些水蛭整条进行磨浆，制得浆液，先后经50目、200目筛网过滤，去渣得滤液即天然水蛭素粗品1703ml（含天然水蛭素41AT-U／ml）。

 2、天然水蛭素粗品的分离纯化

将上述得到的天然水蛭素粗品，置于46℃的恒温水浴中加热85分钟，取出冷却至常温，接着用300目筛网过滤，取其滤液，用12000转/分钟的离心机进行离心12分钟，取其滤液，经用分子量为7000D的超滤膜进行超滤后得浓缩液811ml（含天然水蛭素65 AT-U／ml），加入甘露醇50g，，经冷冻干燥后得到天然水蛭素粉末45g（含天然水蛭素1172AT-U／g），提取率为 75.4％。

 

实施例11 

本发明的方法包括天然水蛭素粗品的提取和天然水蛭素粗品的分离纯化。

1、天然水蛭素粗品提取按如下步骤进行：

（1）特异性诱导液的制备：

 A、制备蚯蚓提取液：取新鲜冰冻的红色爱胜蚓50g，解冻后加入50ml的干净水、经用胶体磨匀浆3次、用150目筛网过滤后所得到的滤液即为蚯蚓提取液，备用。   

B、先量取上述的蚯蚓提取液10ml，称取壳聚糖5g、黄芪多糖1g、葡萄糖粉1g；先用适量干净水溶解上述粉状物质后，接着加入蚯蚓提取液，再用干净水加至1000ml即成特异性诱导液，备用。

（2）含特异性诱导液肠管的制备：将上述制备好的特异性诱导液1000ml灌入充分去除内容物后的猪大肠内，按每隔15cm为一段，两端用线扎紧使其膨胀，备用。

（3）含特异性诱导液肠管的投喂：选取已经提取过天然水蛭素粗品一次、重量为100g，已饥饿20天的菲牛蛭活体分散放在容器里，然后将上述制备好的含特异性诱导液肠管平铺在其内，让菲牛蛭自由吸吮小肠内的诱导液；在10分钟后菲牛蛭蛭吸饱了诱导液，其总体重增加到373g，净增重273g，是其体重的2.7倍。

（4）菲牛蛭唾液的收集：将吃饱诱导液后的菲牛蛭让其静置35分钟后再采用人工挤压法挤出菲牛蛭唾液即得到天然水蛭素粗品202 ml。经测定，这些粗品含天然水蛭素44AT-U／ml。

2、天然水蛭素粗品的分离纯化

 将上述得到的天然水蛭素粗品用100目筛网过滤，取其滤液，置于43℃的恒温水浴中加热50分钟，取出冷却至常温，接着用100目筛网过滤，取其滤液，用7000转/分钟的离心机进行离心20分钟，取其滤液，经膜分离后得浓缩液96ml（含天然水蛭素68 AT-U／ml），加入药用淀粉25g，经冷冻干燥后得到天然水蛭素粉末23g（含天然水蛭素284AT-U／g），提取率为 72.8％。

Claims (9)

1.一种吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法，它包括先从吸血水蛭活体中提取天然水蛭素粗品，然后经过分离纯化得到天然水蛭素粉，其特征在于：所述天然水蛭素粗品的提取是先制备特异性诱导液，并将其灌入肠管中得到含特异性诱导液肠管；再将含特异性诱导液肠管投喂给吸血水蛭，然后提取吸血水蛭的唾液或将吸血水蛭磨浆，制成浆液，即得到天然水蛭素粗品；所述特异性诱导液的制备为：在每1000ml特异性诱导液中含有蚯蚓提取液10～300ml，壳聚糖5～50g，黄芪多糖1～20g，葡萄糖粉1～30g；先用适量水溶解上述粉状物质后，加入蚯蚓提取液，再用水加至1000ml，即得到特异性诱导液，备用。

2.根据权利要求1所述的吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法，其特征在于：所述吸血水蛭唾液的提取将吸饱特异性诱导液后的吸血水蛭静置30～120分钟，然后采用物理挤压的方法提取其体内的唾液即天然水蛭素粗品，待唾液提取完成之后继续按常规的方法对吸血水蛭进行养殖管理，以备供下一次提取天然水蛭素粗品用。

3.根据权利要求1或2所述的吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法，其特征在于：所述吸血水蛭唾液提取的时间间隔为11～60天进行一次，每条水蛭可反复提取天然水蛭素粗品3～5次，每次可得到天然水蛭素粗品8～12ml。

4.根据权利要求1所述的吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法，其特征在于：所述吸血水蛭磨浆制成浆液是指将经过3～5次提取水蛭素粗品之后的吸血水蛭在吸饱特异性诱导液后再进行整体磨浆制浆，并用20～300目的筛网过滤，取其滤液即为水蛭素粗品。

5.根据权利要求1所述的吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法，其特征在于：所述含特异性诱导液肠管的制备是将特异性诱导液灌入新鲜的动物大小肠、动物小肠肠衣或人工肠衣内，灌满后用线扎紧肠管两端使其膨胀，每段肠管长为10～100cm。

6.根据权利要求1或5所述的吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法，其特征在于：所述吸血水蛭的投喂是将饥饿15天以上的吸血水蛭分散放在容器中，然后投放含特异性诱导液肠管，让吸血水蛭吸吮，在10～60分种内吸饱，吸饱后的吸血水蛭其体重增加1～10倍。

7.根据权利要求2或4所述的吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法，其特征在于：所述天然水蛭素粗品中的抗凝血酶活性即水蛭素含量为5～50 AT-U（国际单位）/ml。

8.根据权利要求1所述的吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法，其特征在于：所述蚯蚓提取液，是指将蚯蚓活体或其新鲜冰冻尸体加水，磨浆、过滤得到的滤液。

9.根据权利要求2或4所述的吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法，其特征在于：所述天然水蛭素粗品分离纯化是指将天然水蛭素粗品装入容器内，置于40～49℃的恒温水浴中隔水加热30～90分钟，取出冷却至常温，然后用160～300目筛网过滤，取其滤液，接着用3000r/min～15000r/min的离心机离心5～30分钟，取其滤液，再用膜分离、透析法、电泳法或层析法常规的生化分离方法对其进行分离纯化得到浓缩液，再加入辅料后进行冷冻干燥后即得到天然水蛭素粉末。