CN104311689B - 一种黄芪多糖的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于多糖提取技术领域，具体涉及一种黄芪多糖的提取方法。一种黄芪多糖的提取方法，包括下述的步骤：选择晒干的黄芪，粉碎后过40‑80目筛，得黄芪粉，在黄芪粉中加水并搅拌均匀，黄芪粉与水的重量比例为1：5‑10，在水中浸泡8‑16小时，加入纤维素酶酶解，再加入碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶，在微波条件下酶解，酶解后浓缩并脱色，离心，取上清液浓缩醇沉，再离心，采用乙醇清洗沉淀，冷冻干燥后并粉碎，得黄芪多糖。采用本发明的方法从黄芪中提取多糖，采用酶作用条件温和，采用各种不同的酶将黄芪中的脂肪、纤维素酶解，将其中的多糖提取出来，提高了黄芪的利用率，采用本发明的方法得到多糖不仅得率高，而且纯度也高。
Description
技术领域
本发明属于多糖提取技术领域，具体涉及一种黄芪多糖的提取方法。
背景技术
大量抗生素的使用导致人体免疫力下降，免疫疗法这一安全绿色的治疗方法已成为了世界范围的业内人士共同寻求的目标，因许多中草药具有提高自身免疫力的功效，因此，安全高效低毒的中草药提取物日益被人们所关注。
科学家们不断发现多糖以及糖复合物在生物体中不但作为能源及构成生物体的材料存在，而且它还存在于一切细胞膜结构中，参与各类细胞的生命运动，具有多样化的生物功能。
黄芪具有补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌的功效。用于气虚乏力，食少便溏，中气下陷，久泻脱肛，便血崩漏，表虚自汗，痈疽难溃，久溃不敛，血虚萎黄，内热消渴。《本经》记载：“主痈疽，久败疮，排脓止痛。补虚，小儿百病。”《日华子本草》记载：“助气壮筋骨，长肉补血。”
黄芪多糖可显著增强非特异性免疫功能和体液免疫功能，显著增强小鼠巨噬细胞的吞噬功能，促进血清溶血素形成，提高空斑形成细胞的溶血功能和明显的碳离廓清作用和明显增加脾重量。
黄芪多糖对多种实验型肿瘤油明显的抑制作用。动物实验表明，黄芪多糖与IL-2/LAK抗肿瘤作用相似，并对IL-2/LAK有抗肿瘤效应有明显的增强作用。二者配伍应用可明显提高LAK细胞对靶细胞的杀伤力。二者合并进行动态细胞免疫功能观察，提示二者均具有抵抗鼠脾NK细胞活性和IL-2产生能力下降的作用。说明黄芪多糖的抗肿瘤作用与增强机体免疫功能的作用有关。可改善机体肿瘤而致的免疫功能低下，促进免疫细胞活化释放内源因子，防止过氧化作用从而造成对肿瘤细胞的杀伤和抑制作用，用于治疗鸡马立克氏病。
张艳等人发现黄芪多糖对实验性肝损伤又明显的保护作用，可明显对抗四氯化碳和扑热息痛引起的小鼠血清谷丙转氨酶，对二者引起的小鼠病理组织改变又明显的保护作用。
APs具有双向调节作用。它能是葡萄糖负荷的小鼠血糖明显降低，也能明显对抗肾上腺素引起的小鼠血糖升高反应，而且它还能明显对抗苯乙双胍引起的小鼠实验性低血糖。但是它对胰岛素性低血糖无明显影响。
黄芪多糖是一种干扰素诱导剂，其抗病毒原理：刺激巨噬细胞和T细胞的功能，使E环形成细胞数增加，诱生细胞因子，促进白细胞介素诱生，而使动物机体产生内源性干扰素，从而达到抗病毒的目的。
抗菌作用机制是多方面的，一方面是药物对细菌及其毒性产物的直接抑杀和解毒作用。另一方面更主要的是通过调动机体免疫防御功能而发挥扶正祛邪抑菌，杀菌作用。对志贺氏痢疾杆菌，炭疽杆菌，a 、b型溶链球菌肺炎双球菌，金黄色球菌，大肠杆菌、沙门氏菌均有抗菌作用。
黄芪多糖是一种结构相当复杂的高分子化合物，它所具有的复杂的多途径多环境，多靶点的生物活性与功能，在国际学术界被称为生物应答疚物，多糖的成分中以葡聚糖为主，是由β-1，3葡萄糖苷键结合的直链和β-1，3葡萄糖苷键结合的支链形成一个特殊的空间结构，使其具有了很好的生理活性。
现有的黄芪多糖的提取方法主要有水提发和微波法，水提法提取率低，且步骤复杂，耗时长，有效成分损失较多。
CN101830999披露了一种黄芪多糖的提取方法，其特征在于包括以下步骤：
1) 往黄芪根粉中加入乙醇，静置30min ～
60min，乙醇的加入量为黄芪根粉重量的
1.5 ～ 3 倍；
2) 以黄芪根粉重量3 ～ 5 倍的量，加入温度为60 ～ 100℃的水，保温、回流15min
～
30min，冷却，过滤，用水反复清洗，滤液与清洗液合并，滤饼备用；
3) 往上述滤饼加入1 ～ 10 倍重量的水，加入酶制剂，控制温度为40 ～ 60℃，调节pH为中性，酶解1 ～ 8h 后加热升温灭酶，冷却至室温，过滤，清洗，滤饼弃去，合并滤液与清洗液；
4) 合并2、3 步骤所得滤液与清洗液，减压浓缩至原体积的10％～ 50％，加入95％乙醇进行醇沉，过滤固体，干燥，得黄芪多糖产品。
上述的方法中黄芪多糖的得率为16-17%，其得率并不高。
因此需针对上述的方法进行改进，设计一种高得率的黄芪多糖的提取方法。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种得率较高的黄芪多糖的提取方法。
本发明黄芪多糖的提取方法是通过下述的技术方案来实现的：
一种黄芪多糖的提取方法，包括下述的步骤：
选择晒干的黄芪，粉碎后过40-80目筛，得黄芪粉，在黄芪粉中加水并搅拌均匀，黄芪粉与水的重量比例为1：5-10，在水中浸泡8-16小时，加入纤维素酶，纤维素酶的添加量为0.5-0.9％、酶解温度45℃、pH值5，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为400-600W，频率为800MHZ，酶解0.1-0.5h；
再加入碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶，碱性蛋白酶的加入量为0.2-0.6%，菠萝蛋白酶的加入量为0.2-0.5%，酶解温度50℃、pH值6.8-7.5，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为400-600W，频率为800MHZ，酶解0.1-0.5h，酶解后在100-105℃下灭酶5-10min，得酶解液；
将上述的酶解液置于真空浓缩器中浓缩，减压低温浓缩至酶解液至原体积的1/3，得黄芪粗多糖浓缩液；
在黄芪粗多糖的浓缩液中加入活性炭，所述的活性炭占黄芪粗多糖浓缩液重量的2-6%，搅拌0.2-0.5h，过滤滤出活性炭；
离心10-20 min ，离心转速为4500 rpm，将上清液与沉淀分别收集；
取上清液过滤去渣，过滤后得到的滤液在60-70℃下浓缩，浓缩至其浓度为60-70%，浓缩液按1：4比例加入95%乙醇沉淀静置10-20小时、离心10-20 min ，离心转速为4500 rpm，收集沉淀并用乙醇反复清洗2-3次，冷冻干燥至水分含量为4-6%后，再在-1-4℃下进行粉碎，得可溶性多糖；
上述的加酶量均为酶占超微粉碎后的黄芪的重量百分比。
优选的，黄芪与水的重量比例为1：9；
优选的，碱性蛋白酶的用量是0.45%；
菠萝蛋白酶的添加量为0.4%。
优选的，一种黄芪多糖的提取方法，该方法包括下述的步骤：
选择晒干的黄芪，粉碎后过60目筛，得黄芪粉，在黄芪粉中加水并搅拌均匀，黄芪粉与水的重量比例为1：7，在水中浸泡10小时，加入纤维素酶，纤维素酶的添加量为0.75％、酶解温度45℃、pH值5，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为400-600W，频率为800MHZ，酶解0.1-0.5h；
再加入碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶，碱性蛋白酶的加入量为0.45%，菠萝蛋白酶的加入量为0.4%，酶解温度45℃、pH值6.0，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为500W，频率为800MHZ，酶解0.3h，酶解后在100℃下灭酶6min，得酶解液；
将上述的酶解液置于真空浓缩器中浓缩，减压低温浓缩至酶解液至原体积的1/3，得黄芪粗多糖浓缩液；
在黄芪粗多糖的浓缩液中加入活性炭，所述的活性炭占黄芪粗多糖浓缩液重量的4%，搅拌0.3h，过滤滤出活性炭；
离心15 min ，离心转速为4500 rpm，将上清液与沉淀分别收集；
取上清液过滤去渣，过滤后得到的滤液在65℃下浓缩，浓缩至其浓度为65%，浓缩液按1：4比例加入95%乙醇沉淀静置10-20小时、离心15 min ，离心转速为4500 rpm，收集沉淀并用乙醇反复清洗2-3次，冷冻干燥至水分含量为5%后，再在-1-4℃下进行粉碎，得可溶性多糖；
上述的加酶量均为酶占超微粉碎后的黄芪的重量百分比。
本发明的有益效果在于，采用酶作用条件温和，采用各种不同的酶将黄芪中的脂肪、纤维素酶解，同时从黄芪中提取多糖，最大限度的利用黄芪，而且采用本发明的方法得到的多糖，其得率和纯度高。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。
以下的检测方法，如无特殊说明，采用苯酚-硫酸法测多糖的含量。
实施例1
一种黄芪多糖的提取方法，该方法包括下述的步骤：
选择晒干的黄芪，粉碎后过60目筛，得黄芪粉，在黄芪粉中加水并搅拌均匀，黄芪粉与水的重量比例为1：7，在水中浸泡10小时，加入纤维素酶，纤维素酶的添加量为0.75％、酶解温度45℃、pH值5，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为400-600W，频率为800MHZ，酶解0.1-0.5h；
再加入碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶，碱性蛋白酶的加入量为0.45%，菠萝蛋白酶的加入量为0.4%，酶解温度50℃、pH值7.2，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为500W，频率为800MHZ，酶解0.3h，酶解后在100℃下灭酶6min，得酶解液；
将上述的酶解液置于真空浓缩器中浓缩，减压低温浓缩至酶解液至原体积的1/3，得黄芪粗多糖浓缩液；
在黄芪粗多糖的浓缩液中加入活性炭，活性炭占黄芪粗多糖浓缩液重量的4%，搅拌0.3h，过滤滤出活性炭；
离心15 min ，离心转速为4500 rpm，将上清液与沉淀分别收集；
取上清液过滤去渣，过滤后得到的滤液在65℃下浓缩，浓缩至其浓度为65%，浓缩液按1：4比例加入95%乙醇沉淀静置10-20小时、离心15 min ，离心转速为4500 rpm，收集沉淀并用乙醇反复清洗2-3次，冷冻干燥至水分含量为5%后，再在-1-4℃下进行粉碎，得可溶性多糖；
上述的加酶量均为酶占超微粉碎后的黄芪的重量百分比。
多糖的得率为：19.87%，纯度为93.21%。
实施例2
一种黄芪多糖的提取方法，该方法包括下述的步骤：
选择晒干的黄芪，粉碎后过40目筛，得黄芪粉，在黄芪粉中加水并搅拌均匀，黄芪粉与水的重量比例为1：5，在水中浸泡8小时，加入纤维素酶，纤维素酶的添加量为0.5％、酶解温度45℃、pH值5，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为400-600W，频率为800MHZ，酶解0.1h；
再加入碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶，碱性蛋白酶的加入量为0.2%，菠萝蛋白酶的加入量为0.2%，酶解温度50℃、pH值6.8，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为400W，频率为800MHZ，酶解0.3h，酶解后在100℃下灭酶5min，得酶解液；
将上述的酶解液置于真空浓缩器中浓缩，减压低温浓缩至酶解液至原体积的1/3，得黄芪粗多糖浓缩液；
在黄芪粗多糖的浓缩液中加入活性炭，活性炭占黄芪粗多糖浓缩液重量的4%，搅拌0.3h，过滤滤出活性炭；
离心15 min ，离心转速为4500 rpm，将上清液与沉淀分别收集；
取上清液过滤去渣，过滤后得到的滤液在65℃下浓缩，浓缩至其浓度为65%，浓缩液按1：4比例加入95%乙醇沉淀静置10小时、离心15 min ，离心转速为4500 rpm，收集沉淀并用乙醇反复清洗2-3次，冷冻干燥至水分含量为5%后，再在-1-4℃下进行粉碎，得可溶性多糖；
上述的加酶量均为酶占超微粉碎后的黄芪的重量百分比。
多糖的提取率为：19.01%，纯度为93.22%。
实施例3
一种黄芪多糖的提取方法，该方法包括下述的步骤：
选择晒干的黄芪，粉碎后过80目筛，得黄芪粉，在黄芪粉中加水并搅拌均匀，黄芪粉与水的重量比例为1： 10，在水中浸泡16小时，加入纤维素酶，纤维素酶的添加量为0.9％、酶解温度45℃、pH值5，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为400-600W，频率为800MHZ，酶解0.1-0.5h；
再加入碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶，碱性蛋白酶的加入量为0.6%，菠萝蛋白酶的加入量为0.5%，酶解温度50℃、pH值7.5，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为500W，频率为800MHZ，酶解0.3h，酶解后在100℃下灭酶6min，得酶解液；
将上述的酶解液置于真空浓缩器中浓缩，减压低温浓缩至酶解液至原体积的1/3，得黄芪粗多糖浓缩液；
在黄芪粗多糖的浓缩液中加入活性炭，活性炭占黄芪粗多糖浓缩液重量的4%，搅拌0.3h，过滤滤出活性炭；
离心15 min ，离心转速为4500 rpm，将上清液与沉淀分别收集；
取上清液过滤去渣，过滤后得到的滤液在65℃下浓缩，浓缩至其浓度为65%，浓缩液按1：4比例加入95%乙醇沉淀静置20小时、离心15 min ，离心转速为4500 rpm，收集沉淀并用乙醇反复清洗2-3次，冷冻干燥至水分含量为5%左右后，再在-1-4℃下进行粉碎，得可溶性多糖；
上述的加酶量均为酶占超微粉碎后的黄芪的重量百分比。
多糖的提取率为：19.46%，纯度为93. 36%。
Claims (4)
1.一种黄芪多糖的提取方法，包括下述的步骤：
选择晒干的黄芪，粉碎后过40-80目筛，得黄芪粉，在黄芪粉中加水并搅拌均匀，黄芪粉与水的重量比例为1：5-10，在水中浸泡8-16小时，加入纤维素酶，纤维素酶的添加量为0.5-0.9％、酶解温度45℃、pH值5，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为400-600W，频率为800MHz，酶解0.1-0.5h；
再加入碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶，碱性蛋白酶的加入量为0.2-0.6%，菠萝蛋白酶的加入量为0.2-0.5%，酶解温度50℃、pH值6.8-7.5，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为400-600W，频率为800MHz，酶解0.1-0.5h，酶解后在100-105℃下灭酶5-10min，得酶解液；
将上述的酶解液置于真空浓缩器中浓缩，减压低温浓缩酶解液至原体积的1/3，得黄芪粗多糖浓缩液；
在黄芪粗多糖的浓缩液中加入活性炭，所述的活性炭占黄芪粗多糖浓缩液重量的2-6%，搅拌0.2-0.5h，过滤滤出活性炭；
离心10-20 min ，离心转速为4500 rpm，将上清液与沉淀分别收集；
取上清液过滤去渣，过滤后得到的滤液在60-70℃下浓缩，浓缩至其浓度为60-70%，浓缩液按1：4比例加入95%乙醇沉淀静置10-20小时、离心10-20 min ，离心转速为4500 rpm，收集沉淀并用乙醇反复清洗2-3次，冷冻干燥至水分含量为4-6%后，再在-1-4℃下进行粉碎，得可溶性多糖；
上述的加酶量均为酶占粉碎后的黄芪的重量百分比。
2.如权利要求1所述的一种黄芪多糖的提取方法，其特征在于，所述的碱性蛋白酶的用量是0.45%。
3.如权利要求1所述的一种黄芪多糖的提取方法，其特征在于，所述的菠萝蛋白酶的添加量为0.4%。
4.如权利要求1-3中任一项所述的一种黄芪多糖的提取方法，其特征在于，所述的方法包括下述的步骤：
选择晒干的黄芪，粉碎后过60目筛，得黄芪粉，在黄芪粉中加水并搅拌均匀，黄芪粉与水的重量比例为1：7，在水中浸泡10小时，加入纤维素酶，纤维素酶的添加量为0.75％、酶解温度45℃、pH值5，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为400-600W，频率为800MHz，酶解0.1-0.5h；
再加入碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶，碱性蛋白酶的加入量为0.45%，菠萝蛋白酶的加入量为0.4%，酶解温度50℃、pH值7.2，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为500W，频率为800MHz，酶解0.3h，酶解后在100℃下灭酶6min，得酶解液；
将上述的酶解液置于真空浓缩器中浓缩，减压低温浓缩酶解液至原体积的1/3，得黄芪粗多糖浓缩液；
在黄芪粗多糖的浓缩液中加入活性炭，所述的活性炭占黄芪粗多糖浓缩液重量的4%，搅拌0.3h，过滤滤出活性炭；
离心15 min ，离心转速为4500 rpm，将上清液与沉淀分别收集；
取上清液过滤去渣，过滤后得到的滤液在65℃下浓缩，浓缩至其浓度为65%，浓缩液按1：4比例加入95%乙醇沉淀静置10-20小时、离心15 min ，离心转速为4500 rpm，收集沉淀并用乙醇反复清洗2-3次，冷冻干燥至水分含量为5%后，再在-1-4℃下进行粉碎，得可溶性多糖；
上述的加酶量均为酶占粉碎后的黄芪的重量百分比。
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