CN103382228A

CN103382228A - 一种高活性黄芪多糖的制备方法

Info

Publication number: CN103382228A
Application number: CN2013103315719A
Authority: CN
Inventors: 彭江宁; 叶玉琴; 刘拓
Original assignee: Tianjin Ringpu Bio Technology Co Ltd
Current assignee: Tianjin Ringpu Bio Technology Co Ltd
Priority date: 2013-07-31
Filing date: 2013-07-31
Publication date: 2013-11-06

Abstract

本发明公开了一种高活性黄芪多糖的制备方法。由下述步骤组成：取黄芪药材，加水浸泡，经回流提取，酶解，灭活，离心，醇沉，真空干燥，即得黄芪多糖。利用本发明提取的黄芪多糖免疫活性高、纯度高、产率高、杂质少，而且本发明的工艺简单，具有省时、节能、高效、简便等优点，利于推广、开发和应用。

Description

一种高活性黄芪多糖的制备方法

技术领域

本发明属于天然药物领域，特别涉及一种从天然植物黄芪中分离制备高活性黄芪多糖的方法。

背景技术

黄芪(Radix Astragalus)是豆科植物，蒙古黄芪(Astragalus membranaceus(Fisch)Bge Varmongholicus(Bge)Hsiao)或膜荚黄芪(Astragalus membranaceus(Fisch)Bge)的干燥根，性甘，微温，归脾、肺经，中医古籍大多把它归为补益药中的补气药，具有补气升阳、益卫固表、利水消肿、托疮生肌之功效。

现代研究表明黄芪中含有多种有效成分，包括：多糖、皂甙、黄酮、氨基酸及多种微量元素等，其中黄芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)是含量最多的一种。其主要生物活性表现为增强免疫功能、脾脏增大、抗流感、抗肿瘤、防衰老及抗辐射，对急梗犬心有改善心肌收缩性能、缩小梗塞面积、减轻心肌损伤等作用。由于黄芪多糖的多种生物活性及良好的临床效果，多年来在国内外已成为中药提取及中草药现代化研究的焦点之一。

黄芪多糖是由各种各样的杂多糖、均多糖组合成的混合物。据相关资料报道，黄芪多糖的分子量最小的不到1500，最大的达130多万（杨金兰，武正簧.应用150-C ALC/GPC色谱仪测试黄芪多糖的分子量及其分布.太原工业大学学报[J]，1994,25(4):77-84），分子量分布非常广。其中小分子量的多糖几乎没有药用效果（闫巧娟等.黄芪多糖的分子量分布.食品科学，2004,25(8)：27-29。吴瑕等.不同分子量段黄芪多糖对整体及粘膜免疫功能的影响.中国实验方剂学，2011,17(18):169-172。）。黄芪多糖的提取方法对其活性影响较大。虽然涉及黄芪多糖的提取分离方法的报道很多，但是方法对设备及环境要求很高，方法较复杂，成本高，不利于推广、开发和应用。现报道较多是通过超滤、微滤法截取黄芪多糖中某一段分子量范围的多糖，该法虽然简易，但是超滤、微滤法只是粗分离技术，其分离度不够精确，导致质量的不稳定性，严重的影响了黄芪多糖的药用效果。黄芪多糖的溶解度与分子量密切相关，同条件下一定分子量的多糖在水的溶解度是一定的，采用乙醇醇沉的方法，调醇浓至5～15%，将不溶于低浓度醇的纤维素及鞣质除去，再调醇浓至70～80%（绝大多数低分子量多糖还溶于该浓度下的乙醇溶液中）收集沉淀，干燥后得到质量稳定、高效的黄芪多糖。

发明内容

本发明提供一种高活性黄芪多糖的制备方法，由下述步骤组成：

（1）以黄芪药材为原料，按质量比，加入8～10倍量的水浸泡30～60min后回流提取2～3h，收集滤液和药渣，药渣中加入6～8倍量的水回流提取1～2h，收集滤液；

（2）待滤液冷却至室温后合并滤液，加入6～9%酶活为1500u/mg的中性胰蛋白酶，37℃水解2h后，煮沸10～20min灭活，离心，弃去沉淀，收集上层清液，浓缩至药材质量的2倍体积；

（3）往浓缩液中加入乙醇，调乙醇浓度至5～15%，4℃静置2h，抽滤，收集续滤液；

（4）往续滤液中加入乙醇，调乙醇浓度至70～80%，4℃静置2h，抽滤，收集沉淀物，真空干燥，得黄芪多糖。

所述步骤（3）中往浓缩液中加入乙醇，调乙醇浓度优选至10%。

所述步骤（4）中往续滤液中加入乙醇，调乙醇浓度优选至75%。

所述制备方法得到的黄芪多糖1～5%的水溶液应澄清；不含蛋白质及鞣质；分子量小于1400的糖占总糖的量为0～5%。

本发明的有益效果是：

利用本发明公开的制备方法，将传统方法制备的黄芪多糖中水溶性差的纤维素、鞣质及无药理作用的小分子量糖去除，利用中性胰蛋白酶将黄芪多糖中的蛋白质水解，得到溶水性好、无蛋白质及鞣质残留、安全可靠的高活性黄芪多糖。且本发明的方法对设备及环境要求低、步骤简单、选择性高、人力消耗及能耗低，成本低廉，利于推广、开发和应用。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

其中，下列实施例中选取的黄芪药材为山西产，所得黄芪多糖纯度采用苯酚-硫酸法测得。

实施例1：黄芪多糖的提取分离试验

1.1 称取10kg黄芪药材，按质量比，加入80L水浸泡30min后回流提取2h，收集滤液和药渣，药渣中加入60L水回流提取1h，收集滤液；待滤液冷却至室温后合并滤液，加入6%酶活为1500u/mg的中性胰蛋白酶，37℃水解2h后，煮沸10min灭活，离心，弃去沉淀，收集上层清液，浓缩至20L；浓缩液中加入乙醇，调乙醇浓度至5%，4℃静置2h，抽滤，收集续滤液；往续滤液中加入乙醇，调乙醇浓度至70%，4℃静置2h，抽滤，收集沉淀物，真空干燥，得630.4g，含量为70.2%的黄芪多糖1。

1.2 称取10kg黄芪药材，按质量比，加入100L水浸泡60min后回流提取3h，收集滤液和药渣，药渣中加入80L水回流提取2h，收集滤液；待滤液冷却至室温后合并滤液，加入9%酶活为1500u/mg的中性胰蛋白酶，37℃水解2h后，煮沸20min灭活，离心，弃去沉淀，收集上层清液，浓缩至20L；浓缩液中加入乙醇，调乙醇浓度至15%，4℃静置2h，抽滤，收集续滤液；往续滤液中加入乙醇，调乙醇浓度至80%，4℃静置2h，抽滤，收集沉淀物，真空干燥，得645.3g，含量为72.2%的黄芪多糖2。

1.3 称取10kg黄芪药材，按质量比，加入80L水浸泡30min后回流提取2h，收集滤液和药渣，药渣中加入60L水回流提取1h，收集滤液；待滤液冷却至室温后合并滤液，加入8%酶活为1500u/mg的中性胰蛋白酶，37℃水解2h后，煮沸10min灭活，离心，弃去沉淀，收集上层清液，浓缩至20L；浓缩液中加入乙醇，调乙醇浓度至10%，4℃静置2h，抽滤，收集续滤液；往续滤液中加入乙醇，调乙醇浓度至75%，4℃静置2h，抽滤，收集沉淀物，真空干燥，得620.7g，含量为73%的黄芪多糖3。

1.4 称取10kg黄芪药材，按质量比，加入100L水浸泡60min后回流提取3h，收集滤液和药渣，药渣中加入80L水回流提取2h，收集滤液；待滤液冷却至室温后合并滤液，加入9%酶活为1500u/mg的中性胰蛋白酶，37℃水解2h后，煮沸20min灭活，离心，弃去沉淀，收集上层清液，浓缩至20L；浓缩液中加入乙醇，调乙醇浓度至10%，4℃静置2h，抽滤，收集续滤液；往续滤液中加入乙醇，调乙醇浓度至75%，4℃静置2h，抽滤，收集沉淀物，真空干燥，得663.4g，含量为71.8%的黄芪多糖4。

1.5 称取10kg黄芪药材，按质量比，加入80L水浸泡30min后回流提取2h，收集滤液和药渣，药渣中加入60L水回流提取1h，收集滤液，合并，浓缩至20L，喷雾干燥后，得1304g含量为42.2%的黄芪多糖5。

实施例2：各黄芪多糖的溶水性及低分子量多糖占总多糖的百分比

将实施例1中所得的黄芪多糖1、2、3、4、5均配成1%、3%、5%系列浓度的溶液，比较各溶液的澄明度；分子量测定采用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC），以右旋糖酐为标准品，以标准品的分子量的对数值为纵坐标，以相应色谱峰的保留时间为横坐标，采用GPC专用分析软件绘制标准曲线得线性回归方程。采用面积归一化法计算分子量小于1400的多糖占总糖的百分比。结果见表1。

表1不同制备方法的黄芪多糖溶水性小分子量多糖对比表

由表1可看出采用本发明制备的黄芪多糖较传统方法制备的黄芪多糖，溶水性好且小分子量多糖含量均在2%以下。

实施例3：各黄芪多糖对正常小鼠的脾指数影响试验

1.实验材料：

动物：昆明种小白鼠，雌雄各半，体重为18-22g，购于天津医科大学实验动物中心。

药物：将实施例1中的黄芪多糖1、黄芪多糖2、黄芪多糖3、黄芪多糖4制备成含量为1%（以葡萄糖计，采用硫酸-苯酚法测定）的注射液，将实施例1中黄芪多糖5制备成含量为2%（以葡萄糖计，采用硫酸-苯酚法测定）的注射液。生理盐水做空白对照给药。

2.试验方法：

取健康小白鼠，按随机数字表法随机分成6组，每组10只，均为雌雄各半，给药组每鼠腹腔注射同等剂量的供试品0.5ml，对照组每鼠腹腔注射生理盐水，连续注射7日，每日1次，于最后一次注射24h后，将动物处死，称体重，取脾脏称重，计算脾指数（脾指数=脾重（mg）/体重（g）），实验结果见表2.

3.实验结果：

黄芪多糖1、2、3、4及黄芪多糖5均能促进免疫器官-脾的生长，且黄芪多糖1、2、3、4（P<0.01）比黄芪多糖5（P<0.05）的作用强。

表2 黄芪多糖各组分对小鼠脾指数的影响（

，n=10）

组别	脾指数
		黄芪多糖1组	6.46±1.22**
黄芪多糖2组	6.56±1.01**
		黄芪多糖3组	6.51±0.85**
黄芪多糖4组	6.49±0.95**
		黄芪多糖5组	5.60±1.10*
生理盐水对照组	3.96+0.64

注：与生理盐水对照组比较*P<0.05，**P<0.01

实施例4：黄芪多糖各部位对免疫低下小鼠血清中免疫因子及脾指数的影响试验

1.实验材料：

药物：将实施例1中的黄芪多糖1、黄芪多糖2、黄芪多糖3、黄芪多糖4制备成含量为1%（以葡萄糖计，采用硫酸-苯酚法测定）的注射液；将实施例1中黄芪多糖5制备成含量为2%（以葡萄糖计，采用硫酸-苯酚法测定）的注射液；生理盐水和环磷酰胺。

2.实验方法：

取健康小白鼠，按随机数字表法随机分成7组，雌雄各半每组10只，分别为：黄芪多糖1组、黄芪多糖2组、黄芪多糖3组、黄芪多糖4组、黄芪多糖5组、生理盐水空白对照组和模型空白对照组。生理盐水空白对照组、模型空白对照组腹腔注射生理盐水0.5ml，其余组分别注射相对应的药物0.5ml，每日1次，连续14d。除生理盐水空白对照组外，给药第8,10,12天给予环磷酰胺，造免疫低下模型。于最后一次注射24h后，取血，分离血清，测定血清中白细胞介素2(IL-2)及免疫球蛋白G（IgG）的浓度；同时处死动物，称体重，取脾脏称重，计算脾指数。实验结果见表3。

3.实验结果：

黄芪多糖5与黄芪多糖1、2、3、4均能显著提高低免小鼠脾指数及血清中IL-2、IgG的浓度至正常水平，且黄芪多糖1、2、3、4的作用效果比黄芪多糖5更强（P<0.01），不仅将低免小鼠的免疫指标恢复至正常水平，还远远高于正常水平。

表3. 黄芪多糖各组分对低免小鼠免疫因子及脾指数的影响（

，n=10）

组别	IL-2（ng/L）	IgG(mg/ml)	脾指数
				黄芪多糖1组	6938.2±1107.1**	12.1±3.01**	5.98±1.12**
黄芪多糖2组	6889.9±775.7**	12.7±2.41**	6.01±0.97**
				黄芪多糖3组	6900.3±995.5**	11.8±2.85**	5.88±0.77**
黄芪多糖4组	7012.1±821.4**	12.4±2.21**	5.85±0.89**
				黄芪多糖5组	5945.6±764.9*	10.21±3.16*	3.89±1.01*
生理盐水空白对照组	6005.6±834.7*	10.11±2.66*	4.01±0.89*
				模型空白对照组	4489.8±901.2	6.55±1.89	1.98±0.97

注：与模型空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01

总结实施例2、3、4实验结果，可以得出以下结论：黄芪多糖5对正常小鼠及低免小鼠的影响均弱与黄芪多糖1、2、3、4，且黄芪多糖5的水溶性差，其中小分子量多糖占总多糖的比例远高于5%。应用本发明公布的高活性黄芪多糖制备方法，得到的产物活性非常高，对正常及低免机体都能起到免疫增强的作用。

Claims

1.一种高活性黄芪多糖的制备方法，由下述步骤组成：

2.如权利要求1所述的一种高活性黄芪多糖的制备方法，其特征是步骤（3）中往浓缩液中加入乙醇，调乙醇浓度至10%。

3.如权利要求1所述的一种高活性黄芪多糖的制备方法，其特征是步骤（4）中往续滤液中加入乙醇，调乙醇浓度至75%。

4.一种高活性黄芪多糖，其特征是：该黄芪多糖1～5%的水溶液应澄清；不含蛋白质及鞣质；分子量小于1400的糖占总糖的量为0～5%。