CN1423929A - 菲牛蛭的养殖方法及水蛭素的提取技术 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种菲牛蛭的养殖方法及水蛭素的提取方法，是通过引进优良种源或野外捕捉到健壮的菲牛蛭，进行人工分级分段驯、喂养，进行人工繁殖，待饲养到一定程度，采用化学物质刺激鲜活菲牛蛭使其分泌出唾液，然后对其唾液进一步分离过滤得到水蛭素粗品，再将水蛭素粗品进行深加工得到符合医用的水蛭素，该菲牛蛭含抗凝血物质比其它品种菲牛蛭含量高，药用效果好，提取水蛭素方法简单，提取水蛭素后将菲牛蛭放回水池养殖，相隔一周或10天又可以再提取，每条鲜活菲牛蛭可以反复提取6－7次，每次能提取水蛭素粗品6－7毫升左右，产品质量好，又节约资源，提高了菲牛蛭的利用价值。
Description
技术领域
本发明涉及医用水蛭的养殖及水蛭素的提取方法，特别是菲牛蛭的养殖及水蛭素的提取方法。
背景技术
水蛭素是从吸血水蛭(蚂蟥)中提取的一种抗凝血物质。水蛭，首载于我国《神农本草经》，后在《本草纲目》和《中国动物药》等专著中均有收载。1884年，Haycraft发现水蛭提取物有抗凝血作用，1955年，MarkwMdt指出这种抗凝血物质为蛋白质，定名为水蛭素，1986年后基因重组水蛭素问世，为水蛭素的深入研究和临床应用开辟了广阔前景。根据文献记载，天然水蛭素是由65个氨基酸组成的多肽，其作用有以下几个方面：1、具有抗凝血作用。不同来源和结构的水蛭素，其抗凝血机制不尽相同。因此天然水蛭素可从多个环节影响血液凝固和血栓形成。2、抗凝血酶作用。水蛭素的抗凝血酶作用见于欧洲医用水蛭(hiNmedic5nalis)Llj、亚洲水牛蛭(菲牛蛭)和印度水蛭等。由这些水蛭中提取的水蛭素含6个分布相似的半胱氨酸残基，具有相似的三维结构：其N端由二硫键形成紧密结构，且与凝血酶活性位点结合；其C端富含酸性氨基酸残基，则与凝血酶的纤维蛋白原结合位点结合；中间区的氨基酸残基协调作用。这种结构可以达到水蛭素与凝血酶呈1∶1的比例形成稳定的复合物，从而对凝血酶有高度特异的抑制作用，起到抑制凝血酶的抗凝血作用。3、抗血小板作用。1992年，Como等从墨西哥水蛭中提取出一种称为菲牛蛭抗血小板蛋白质，具有特异性抑制胶原诱导血小板聚集的作用，而对其他诱导剂(如血、凝血酶等)诱导血小板聚集无抑制作用。1994年，Kmel等从北美水蛭中提取一种含39个氨基酸残基的多肽，其三维构象与水蛭素很相似，C端的RGD序列与血小板膜GPIIb/IIIa相识别，从而抑制了纤维蛋白原介导的血小板聚集作用。4、降解纤维蛋白(原)作用。1984年，Malin-conlco等从亚马逊巨型水蛭中提取一种称为hementin的物质。这种物质可以降解纤维蛋白(原)的特定肋链，具有抗凝血酶活性并能显著抑制ADP诱导的血小板聚集，对于预防血栓性疾病的发生有明显的作用。
水蛭素的临床应用，目前，由于重组水蛭素的问世，临床上多用于治疗不稳定性心绞痛(USA)、急性心肌梗死(AMI)、血管成形术、术后血栓形成、血液透析、体外循环、弥散性血管内凝血(DIC)，以及用于抗肿瘤等。
水蛭素干燥状态下较稳定.室温下在水中可稳定存在6个月，80℃下加热15分钟不被破坏。pH值升高则稳定性下降，在0.1moL HCl或0.1mol NaOH中可稳定15min。康蛋白酶钠和蛋白酶不破坏水蛭素的活性，而番木瓜蛋白酶胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶A则可使之失去活性。
在水蛭养殖方面，目前为了获得水蛭素，各地都在养殖水蛭，水蛭的物种有多种，如宽体金线蛭、欧洲医蛭、日本医蛭、菲牛蛭、亚马逊巨型水蛭等，我国养殖的物种大多为宽体金线蛭，主要是因为宽体金线蛭体形大容易饲养，经过科技文献检索了解到，目前我国内有不少地方办起了水蛭养殖场，如北京、江苏吴江、郑州市、山东曹县等，但他们养殖的物种大多为宽体金线蛭，饲养宽体金线蛭是以投喂活螺狮为主，辅以蚯蚓，昆虫的幼虫等。
菲牛蛭(金边蚂蟥)是我国华南尤其是广西、广东、海南等地区和一些东南亚国家特有的水蛭物种，品质最优，在广西分布较为广泛，该物种所含水蛭素抗凝血物质比其它品种水蛭特别是比目前文献报道的宽体金线蛭含抗凝血物质含量高得多，药用效果好，宽体金线蛭不含水蛭素。由于菲牛蛭在天气寒冷的地区不容易生长，饲养也很不容易，目前未见有养殖菲牛蛭的文献记载。
在水蛭素的提取方面，目前水蛭素有许多方法，国内的水蛭素提取，主要采用将水蛭养殖到一定程度后将其绞碎或者干燥后用化学药剂将其提取，这种方法浪费资源，而且提取工艺复杂。
《水生生物学报》1997年第2期报道，1955年德国的Markwardt首次从医蛭中分离出较纯的水蛭素，此后水蛭素的纯化和标准化技术日趋完善。迄今已有不少有关的研究报道和专利，绝大多数工作是利用欧洲医蛭的头部甚至整个身体做原料，经乙醇脱水，然后加丙酮沉淀等一系列步骤而得到水蛭素粗制品的。1970年Markwardt采用乙醇分级沉淀、阳离子交换、凝胶过滤以及阴离子交换等步骤获得了水蛭素纯品。1985年WdsmaM和Marhyardt改进了纯化方法，采用离子交换与亲合色谱相结合而获得了高纯度的水蛭素。1986年Johmnes等人报道了一种五步纯化法，其中使用了高效液相色谱新技术。
中国专利也公开了一些水蛭素的提取方法，中国专利<申请号>92107076<发明名称>医用天然水蛭素的提取方法，是将将水蛭洗净去除泥土等杂质后，整体捣碎成泥浆状，再把水蛭浆加温至60-80℃，并维持2-3分钟，在加温后的水蛭浆中加入10％的冰醋酸调整PH值在4.4-4.6，随即冷却至25-30℃，再加10％Na2CO3调整PH值在6-7，水蛭浆经离心收集母液，残渣加入0.9％的生理盐水先后浸提2-3次，收集全部浸提液，然后把母液透析36小时，每隔12小时换水一次，透析液用95％以上乙醇沉淀，先加95％乙醇使其含量为61％，放置12小时，倾去上清液，再加同样浓度的乙醇使其含量为85％，放置24小时，得到水蛭素沉淀，(7)将沉淀低温干燥得粗制品，(8)粗制品用适量二次蒸馏水溶解。
<申请号>95105650<发明名称>动物血水蛭水解法及其水蛭水解血，是关于动物血的新的利用方法，使食血水蛭充分吸取动物血，数分钟至数小时后用物理或化学方法使血液从水蛭体内流出，收集流出的橙红色血液体，再从血中提取水蛭素。该法获得的水蛭水解血有含中小分子量蛋白质或肽的动物血，还含有水蛭素、消化血液的纤维蛋白酶(原)、透明质酸酶及其它目前难以测定的有用的水蛭分泌物。本法能有效降解动物血并使之含有医用价值的水蛭素、透明质酸酶等水蛭分泌物，水蛭还可多次使用，提高其利用率。
技术内容
本发明人在经过几年的研究和探索，了解到菲牛蛭(金边蚂蟥)所含水蛭素抗凝血物质比其它物种水蛭特别是比目前文献报道的宽体金线蛭含抗凝血物质含量高，药用效果好的优点后，经历多次试验后，终于摸索出人工饲养菲牛蛭和从菲牛蛭中提取水蛭素的方法，取得了较好的经济效益。
本发明的技术方案如下：
1、菲牛蛭的人工饲养
通过引进优良种源或野外捕捉到健壮的菲牛蛭、放在水体干净的水池或池塘中进行人工分级分段驯化、喂养，并维持适宜的温度，进行人工繁殖，待饲养到一定程度，即可提取水蛭素。
以上所述的人工分级分段驯化、喂养的方法是把繁育种苗和饲养小苗放在小水池中，这样由于面积比较小，可以比较细致的喂养和料理，可以提高繁育和生长率。等到生长比较大，菲牛蛭可以自己觅食时再放到大面积的池塘里养殖。也可以继续把它们分类放在小池里，进行工厂化养殖，一般每立方米水可放成品600-1500条左右，如果要增加在饲养过程中可以采用流动的水和通过加氧措施，冬天要注意保温。
以上所述的人工分级分段驯、喂养的方法还包括喂食，包括用0.05-0.2％钠盐处理得到的新鲜牛血、猪血、羊血等，所述的钠盐包括乙酸钠、磷酸钠、柠檬酸钠、精氨酸钠、赖氨酸钠、抗坏血酸钠、胱氨酸钠，主要使血液不凝固，在喂食过程中将不凝固的血液放到盛有海棉的碟子上，然后将碟子放到浮在养殖池水中的泡沫板上，同时一边搅动池水，让菲牛蛭吸引过来觅食。也可将已经加有药品的腥畜血液用牛小肠、猪小肠或人工肠衣装好，然后用细线将小肠捆成每节2-3厘米的节状直接防入养殖水中喂养。
以上所述的人工繁殖包括到一定时候需要加入野生的优良品种交配，使之不产生近亲繁殖，规模化养殖以及水蛭素提取等步骤完成。在野外捕捉到的菲牛蛭经过鉴定后，将它放在小水池里，使其适应新的环境，然后通过人工分级分段饲养。
2、从菲牛蛭中提取水蛭素
上述提到，目前提取水蛭素的方法大多采用将水蛭整体打浆或晒干然后用溶剂提取，虽然文献介绍了使食血水蛭充分吸取动物血，数分钟至数小时后用物理或化学方法使血液从水蛭体内流出，收集流出的橙红色血液体，再从血中提取水质素，这种方法仍然复杂，成本也较高。
本发明提取水蛭素的方法包括菲牛蛭原料选择和清洗，采用化学物质刺激鲜活菲牛蛭使其分泌出唾液，然后对其唾液过滤，再将水蛭素粗品进行深加工得到符合医用的水蛭素。
以上所述的菲牛蛭原料选择和清洗是从饲养池内捞出成熟、健康的菲牛蛭放到盛有清水的池子中，每隔2天换水清洗一次，不喂食，如此保持10-30天，最后用蒸馏水浸泡10-30分钟。
以上所述的菲牛蛭喂饱诱导物质和挤压的方法是将清洗干净的菲牛蛭用诱导物质充分喂饱菲牛蛭，然后对菲牛蛭进行挤压使其分泌出唾液(水蛭素粗品)，所采用的所采用的诱导物质包括无机盐、有机酸和浓度较低的无机酸，包括乙酸、盐酸、磷酸、柠檬酸、精氨酸、赖氨酸、抗坏血酸、胱氨酸、氯化钠、氯化钾、碳酸钠、磷酸钠、磷酸二氢钾的一种或两种、两种以上的混合物，其浓度为0.1-3％，使水溶液的PH在4.5-6.8之间。具体方法是先配置好纯净的混合水溶液，让菲牛蛭充分吃饱，然后对其进行挤压，使其分泌出唾液，每条鲜活菲牛蛭可以反复提取6-7次，每次能提取水蛭素粗品6-7毫升左右。
将水蛭素粗品进行深加工包括分离和纯化和阴离子交换柱层析、凝胶过滤柱层析；
分离和纯化的方法是：将从上述菲牛蛭体内提取出的唾液腺分泌物提取液中加4倍置冰箱中预冷的含水15％的丙酮，搅拌后置冰箱中过夜，吸出上清丙酮并离心，在沉淀中加入预冷的三氯乙酸使其溶解，离心除去残渣，待上样进行柱层析。
阴离子交换柱层析的方法是：取适量DEAE-C加蒸馏水使其膨胀，按常规方法依次用NaoH-NaCl混合液、HCl及NaOH-NaCl混合液各浸泡30分后用蒸馏水洗涤至中性。装柱至所需高度，用柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液平衡，5ml的唾液腺分泌物浓缩液或上述三氯乙酸溶液上样进行梯度洗脱并用记录仪绘出洗脱曲线，分段收集洗脱液，经检测，将有活力部分集中于透析袋中用甘油浓缩，再用双缩腮法测总蛋白含量，继续以下的柱层析。
凝胶过滤柱层析的方法是：取适量的加蒸馏水浸泡2-4h，按常规方法用NaoH-NaCl混合液浸泡0.5h，抽滤除去碱液并用蒸馏水洗涤至中性，加热煮沸除去气泡。装柱至所需高度，用TRIS-HCl-NaCl缓冲液平衡，将上述有活力洗脱液的浓缩液上样、洗脱并用记录仪绘出洗脱曲线，分段收集洗脱液，分别检测活力，将有活力部分集中于透析袋中用甘油浓缩。再测活力后，待用分光光度计在200nm至400nm波长范围内扫描。
与现有的技术相比，本发明的突出实质性特点和显著的进步是：
1、菲牛蛭(金边蚂蟥)含抗凝血物质比其它品种水蛭特别是比目前文献报道的宽体金线蛭含抗凝血物质含量高，也比日本医蛭的药用效果好。
2、饲养技术先进，特别是采用不凝固的血液既能保证血液不腐变，又使菲牛蛭能吸到新鲜血液，保证了菲牛蛭的健康。
3、采用人工分级分段驯养、喂养的方法能保证菲牛蛭生长状态良好不会发生小菲牛蛭无法抢食而生长缓慢的现象。
4、加入野生的优良品种交配，使之不产生近亲繁殖的方法能保障菲牛蛭不发生退化。
5、最重要的一点是本发明采用广西特有的菲牛蛭活体提取水蛭素的方法，使每条鲜活菲牛蛭可以反复提取6-7次，每次能提取6-7毫升左右，经离心分离、离子交换等措施得到液体的水蛭素、或者经干燥得到固体水蛭素。每周可以提取1次，这样不但方法简单容易操作，产品质量好，又节约资源，提高菲牛蛭利用价值。菲牛蛭养殖1年可提取，菲牛蛭的生命周期为5年左右。
具体实施方式
一、菲牛蛭饲养实施例
实施例1，野外捕捉到健壮的菲牛蛭，按大小放在小水池(一般每个4-8平方米为好)中进行细致的喂养和料理，每立方米水可放成品600-1500条左右，在饲养过程中可以采用流动的水和通过加氧措施，喂食的食物包括加入钠盐的新鲜牛血、猪血、羊血等，所述的钠盐包括乙酸钠、磷酸钠、柠檬酸钠、精氨酸钠、赖氨酸钠、抗坏血酸钠、胱氨酸钠，主要使血液不凝固，在喂食过程中将不凝固的血液放到盛有海棉的碟子上，然后将碟子放到浮在养殖池水中的泡沫板上，同时一边搅动池水，让菲牛蛭吸引过来觅食。在繁殖时用引进优良种源健壮的菲牛蛭与之交配。
实施例2，引进优良种源健壮的菲牛蛭，按大小放在小水池(一般每个4-8平方米为好)中进行细致的喂养和料理，每立方米水可放成品600-1500条左右，在饲养过程中可以采用流动的水和通过加氧措施，喂食的食物包括用0.05-0.2％钠盐处理得到的新鲜牛血、猪血、羊血等，所述的钠盐包括乙酸钠、磷酸钠、柠檬酸钠、精氨酸钠、赖氨酸钠、抗坏血酸钠、胱氨酸钠，主要使血液不凝固，用牛小肠、猪小肠或人工肠衣装好，然后用细线将小肠捆成每节2-3厘米的节状直接防入养殖水中喂养。在繁殖时用野外捕捉到健壮的菲牛蛭与之交配。
二、菲牛蛭提取水蛭素实施例
实施例1，从饲养池内捞出成熟、健康的菲牛蛭放到盛有清水的池子中，每隔2天换水清洗一次，不喂食，如此保持10-30天，最后用蒸馏水浸泡10-30分钟，将清洗干净的菲牛蛭用乙酸、柠檬酸、氯化钠、碳酸钠混合物的水溶液，其浓度为0.1％，PH在4.5，溶解于蒸馏水后充分喂饱菲牛蛭，然后对菲牛蛭进行挤压使其分泌出唾液(水蛭素粗品)，和加入酸的浓度使水溶液的PH在5-6.5之间。具体方法是先配置好纯净的酸溶液，让菲牛蛭充分吃饱，然后对其进行挤压，使其分泌出唾液得到水蛭素粗品，然后对其唾液经离心除杂，再进行分离和纯化。
分离和纯化唾液腺分泌物的制备是将250-300ml从上述菲牛蛭体内提取出的唾液腺分泌物提取液中加4倍置冰箱中预冷的含水15％的丙酮，搅拌后置冰箱中过夜，吸出上清丙酮并离心，在沉淀中加入预冷的三氯乙酸(约25ml)使其溶解，离心除去残渣，待上样进行柱层析。
阴离子交换柱层析取适量DEAE加蒸馏水使其膨胀，按常规方法依次用0.5MOL/L NaOH-NaCl混合液、0.5mol/L HCl及0.5mol/L NaOH-NaCl混合液各浸泡30分后用蒸馏水洗涤至中性。装柱(2cm×60cm)至所需高度，用pH4.6的0.1mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液平衡，5ml的唾液腺分泌物浓缩液或上述三氯乙酸溶液上样进行梯度洗脱并用记录仪绘出洗脱曲线，分段收集洗脱液。经检测，将有活力部分集中于透析袋中用甘油浓缩，再用双缩腮法测总蛋白含量，继续以下的柱层析。
阴离子交换柱层析取适量DEAE-C加蒸馏水使其膨胀，按常规方法依次用0.5MOL/LNaOH-NaCl混合液、0.5mol/L HCl及0.5mol/L NaOH-NaCl混合液各浸泡30分后用蒸馏水洗涤至中性。装柱(2cm×60cm)至所需高度，用pH4.6的0.1mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液平衡，5ml的唾液腺分泌物浓缩液或上述三氯乙酸溶液上样进行梯度洗脱并用记录仪绘出洗脱曲线，分段收集洗脱液。经检测，将有活力部分集中于透析袋中用甘油浓缩，再测总蛋白含量，继续以下的柱层析。
实施例2，从饲养池内捞出成熟、健康的菲牛蛭放到盛有清水的池子中，每隔2天换水清洗一次，不喂食，如此保持10-30天，最后用蒸馏水浸泡10-30分钟，将清洗干净的菲牛蛭用精氨酸、胱氨酸、磷酸钠混合物的水溶液，其浓度为0.5％，PH在4.5-6.8之间，溶解于蒸馏水后充分喂饱菲牛蛭，然后对菲牛蛭进行挤压使其分泌出唾液(水蛭素粗品)然后对其唾液经离心除杂，再按实施例1的方法进行分离和纯化。
实施例3，从饲养池内捞出成熟、健康的菲牛蛭放到盛有清水的池子中，每隔2天换水清洗一次，不喂食，如此保持10-30天，最后用蒸馏水浸泡10-30分钟，将清洗干净的菲牛蛭用盐酸、碳酸钠、磷酸二氢钾混合物的水溶液，其浓度为3％，PH在6，溶解于蒸馏水后充分喂饱菲牛蛭，然后对菲牛蛭进行挤压使其分泌出唾液(水蛭素粗品)，将这些水蛭素粗品再按常规方法提纯。
实施例4，从饲养池内捞出成熟、健康的菲牛蛭放到盛有清水的池子中，每隔2天换水清洗一次，不喂食，如此保持10-30天，最后用蒸馏水浸泡10-30分钟，将清洗干净的菲牛蛭用抗坏血酸、胱氨酸、氯化钠混合物的水溶液，其浓度为0.5％，PH在5.5之间，溶解于蒸馏水后充分喂饱菲牛蛭，然后对菲牛蛭进行挤压使其分泌出唾液(水蛭素粗品)，然后对其唾液经离心除杂，再按实施例1的方法进行分离和纯化。
实施例5，从饲养池内捞出成熟、健康的菲牛蛭放到盛有清水的池子中，每隔2天换水清洗一次，不喂食，如此保持10-30天，最后用蒸馏水浸泡10-30分钟，将清洗干净的菲牛蛭用磷酸、赖氨酸、碳酸钠、氯化钠、氯化钾混合物的水溶液，其浓度为1.5％，PH在5.0之间，溶解于蒸馏水后充分喂饱菲牛蛭，然后对菲牛蛭进行挤压使其分泌出唾液(水蛭素粗品)，然后对其唾液经离心除杂，再按实施例1的方法进行分离和纯化。
Claims (8)
1、一种菲牛蛭的养殖方法及水蛭素的提取技术，其特征在于：通过引进优良种源或野外捕捉到健壮的菲牛蛭、放在水体干净的水池或池塘，人工分级分段驯化、喂养、维持适宜的温度，进行人工繁殖，待饲养到一定程度，采用诱导物质刺激鲜活菲牛蛭使其分泌出唾液，然后对其唾液经过进一步的纯化分离便可以得到天然水蛭素，再将水蛭素粗品进行深加工得到符合医用的水蛭素。
2、根据权利要求1所述的菲牛蛭的养殖方法及水蛭素的提取方法，其特征在于：菲牛蛭的养殖方法是人工分级分段驯化、喂养的方法是把繁育种苗和饲养小苗放在小水池中，喂食，所喂食的食物包括用0.05-0.2％钠盐处理得到的新鲜牛血、猪血、羊血等，使血液不凝固，在喂食过程中将不凝固的血液放到盛有海棉的碟子上，然后将碟子放到浮在养殖池水中的泡沫板上，同时一边搅动池水，让菲牛蛭吸引过来觅食，或者将已经加有药品的腥畜血液用牛小肠、猪小肠或人工肠衣装好，然后用细线将小肠捆成每节2-3厘米的节状直接防入养殖水中喂养。
3、根据权利要求1所述的菲牛蛭的养殖方法及水蛭素的提取方法，其特征在于：所述的人工繁殖包括到一定时候在野外捕捉到的菲牛蛭经过鉴定后，将它放在小水池里，使其适应新的环境，然后通过人工分级分段饲养，再进行育种和繁殖。
4、根据权利要求1和2所述的菲牛蛭的养殖方法及水蛭素的提取方法，其特征在于：使血液不凝固的处理新鲜牛血、猪血、羊血0.05-0.2％钠盐包括乙酸钠、磷酸钠、柠檬酸钠、精氨酸钠、赖氨酸钠、抗坏血酸钠、胱氨酸钠。
5、根据权利要求1所述的菲牛蛭的养殖方法及水蛭素的提取方法，其特征在于：提取水蛭素的方法包括菲牛蛭原料选择和清洗，采用化学物质刺激鲜活菲牛蛭使其分泌出唾液，然后对其唾液过滤，再将水蛭素粗品进行深加工得到符合医用的水蛭素。
6、根据权利要求1和5所述的菲牛蛭原料选择和清洗是从饲养池内捞出成熟、健康的菲牛蛭放到盛有清水的池子中，每隔2天换水清洗一次，不喂食，如此保持10-30天，最后用蒸馏水浸泡10-30分钟。
7、根据权利要求1和5所述的菲牛蛭的养殖方法及水蛭素的提取方法，其特征在于：所述的刺激鲜活菲牛蛭使其分泌出唾液的化学物质包括无机盐、有机酸和浓度较低的无机酸：乙酸、盐酸、磷酸、柠檬酸、精氨酸、赖氨酸、抗坏血酸、胱氨酸、氯化钠、氯化钾、碳酸钠、磷酸钠、磷酸二氢钾的其中一种或两种、两种以上的混合物，其水溶液浓度为0.1-3％，PH在4.5-6.8之间。
8、根据权利要求1和5所述的菲牛蛭的养殖方法及水蛭素的提取方法，其特征在于：将水蛭素粗品进行深加工包括分离和纯化和阴离子交换柱层析、凝胶过滤柱层析；
分离和纯化的方法是：将从上述菲牛蛭体内提取出的唾液腺分泌物提取液中加4倍置冰箱中预冷的含水15％的丙酮，搅拌后置冰箱中过夜，吸出上清丙酮并离心，在沉淀中加入预冷的三氯乙酸使其溶解，离心除去残渣，待上样进行柱层析。
阴离子交换柱层析的方法是：取适量DEAE加蒸馏水使其膨胀，按常规方法依次用NaOH-NaCl混合液、HCl及NaoH-NaCl混合液各浸泡30分后用蒸馏水洗涤至中性，装柱至所需高度，用柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液平衡，5ml的唾液腺分泌物浓缩液或上述三氯乙酸溶液上样进行梯度洗脱并用记录仪绘出洗脱曲线，分段收集洗脱液，经检测，将有活力部分集中于透析袋中用甘油浓缩，再测总蛋白含量，继续以下的柱层析。
凝胶过滤柱层析的方法是：取适量的加蒸馏水浸泡2-4h，按常规方法用NaOH-NaCl混合液浸泡0.5h，抽滤除去碱液并用蒸馏水洗涤至中性，加热煮沸除去气泡。装柱至所需高度，用TRIS-HCl-NaCl缓冲液平衡，将上述有活力洗脱液的浓缩液上样、洗脱并用记录仪绘出洗脱曲线，分段收集洗脱液，分别检测活力，将有活力部分集中于透析袋中用甘油浓缩，再测活力后，待用分光光度计在波长范围内扫描。
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Address after: 530007 office building 16, 12 floor, block B, Chengdu Plaza, No. 17 Xinyuan Road, Nanning new high tech Zone, the Guangxi Zhuang Autonomous Region. Patentee after: GUANGXI KEKANG SCIENCE AND TECHNOLOGY GROUP Co.,Ltd. Address before: 530007 office building 16, 12 floor, block B, Chengdu Plaza, No. 17 Xinyuan Road, Nanning new high tech Zone, the Guangxi Zhuang Autonomous Region. Patentee before: Nanning Jin Kang Haike Biological Medicine Technology Co.,Ltd. |
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Effective date of registration: 20201229 Address after: 1301b, bike technology building, No.9, scientific research road, Maling community, Yuehai street, Nanshan District, Shenzhen, Guangdong 518118 Patentee after: Shenzhen Jinkang doff Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 530007 office building 16, 12 floor, block B, Chengdu Plaza, No. 17 Xinyuan Road, Nanning new high tech Zone, the Guangxi Zhuang Autonomous Region. Patentee before: GUANGXI KEKANG SCIENCE AND TECHNOLOGY GROUP Co.,Ltd. |
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Granted publication date: 20060906 |
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