CN102146136B - 用电刺激活体水蛭提取水蛭素的方法 - Google Patents
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Abstract
用电刺激活体水蛭提取水蛭素的方法，利用电流对生物体腺体的刺激作用，直接使用直流弱电刺激活体水蛭批量提取高纯度水蛭素的方式，并保持水蛭的活体性状，以期简化水蛭素的生产工艺，提高产品纯度，保持野生水蛭资源的重复利用，降低生产成本，克服生产的季节性障碍问题。本发明提取的水蛭素经过纳滤除水，减压喷雾干燥，制成含抗凝血酶活性达800AT-U/g的粉状水蛭素，加入保护剂的抗凝血酶活性达1000AT-U/g液态水蛭素。
Description
技术领域
本发明涉及一种用电刺激活体水蛭提取水蛭素的方法，通过弱电刺激活体水蛭，使水蛭腺体释放腺液，同时确保水蛭保持活体状态，从而实现多次从活体水蛭的腺液中获得高纯度水蛭素的方法。
背景技术
水蛭素(hirudin)因最早从水蛭中分离得到而得名。天然水蛭素由65个氨基酸残基组成，分子量7000道尔顿。水蛭素能同凝血酶的催化中心及纤维蛋白原结合中心发生不可逆的结合，使凝血酶失活，为目前发现的最强有力的凝血酶抑制剂。此外还有很强的抗血栓作用，对多种实验性血栓模型有阻抑作用。水蛭素对于各种血栓疾病如静脉血栓、弥散性血管内凝血、脑凝血、血栓静脉炎及冠状动脉血栓都有预防和治疗效果，尤其是静脉血栓和弥漫性血管内凝血的治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管成形术后再栓塞；改善体外血液循环和血液透析过程，在显微外科手术中常因为吻合处血管栓塞而导致失败，采用水蛭素可促进伤口愈合。工业化生产水蛭素的方法多以对水蛭活体的破坏方法获得水蛭素，影响所得水蛭素的纯度，同时对水蛭资源的供应依赖过大，尤其难以避免水蛭素生产的季节性问题。利用电流对生物体腺体的刺激影响作用，直接使用直流弱电刺激活体水蛭批量提取高纯度水蛭素的方式并保持水蛭的活体性状的方法以期简化水蛭素的生产工艺，提高产品纯度，保持野生水蛭资源的重复利用，降低生产成本，克服生产的季节性障碍问题的方法，至今尚未有成功实现的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用电刺激活体水蛭提取水蛭素的方法，它能够简化水蛭素的生产工艺，同时保持水蛭的活体，多次提取高纯度水蛭素。
本发明是这样实现的：在室温下，先将活体水蛭从饲养槽中提取至贮藏槽，用去离子水漂洗除其表面杂质，滤出水分，再浸入生理盐水漂洗，添加电解质液层覆盖，通入直流电进行刺激，同时确保合适的电流强度，避免水蛭死亡，收集水蛭分泌的液体，后将活体水蛭从滤槽中放回饲养槽。
用电刺激活体水蛭提取水蛭素的方法，具体步骤如下：
1、采用弱电或直流电刺激活体水蛭，获得在电流刺激下水蛭产生的分泌物，
2、将分泌物经过800μm纳滤膜后续处理30～180分钟，除去80～90％的水份，添加8～15％医用淀粉赋形，减压至0.9大气压下，在进口温度为230～180℃，出口温度90～75℃下进行喷雾干燥，获得含800AT-U/g的高活性抗凝血酶活性水蛭素干粉。
还可以通过超滤膜除水后，加入0.05％海藻糖、0.02％乙酰半膀氨酸和0.05％枸杞酸钠配制成的稳定剂，制得含1000AT-U/g抗凝血酶液态水蛭素。
放回饲养槽的水蛭在24小时后可以用上述同样的方法重复提取水蛭素。
本发明与现有技术相比，其实质性特点与进步之处在于：
1、利用合适大小的直流弱电刺激生物活体导致腺体产生分泌的特点，连续刺激活体水蛭唾液腺分泌唾液，获得高纯度水蛭素；
2、弱电刺激后的水蛭活体保持活性，可以在隔段时间后继续进行水蛭素的提取；
3、纯的水蛭唾液可以得到较高纯度的水蛭素；
4、使用超滤膜除水提高有效成分浓度；
5、合适的赋形淀粉添加量和合适的温度设定喷雾干燥技术制粉；
6、海藻糖、乙酰半膀氨酸、枸杞酸钠的组合为保护剂，保护水蛭素混合液中抗凝血酶的生理活性的稳定性不发生变化。
用上述方法获得的产品经检测，产品中水蛭素中抗凝血酶的活性含量达到800(干粉)或1000(液体)AT-U/g。
具体实施方式
实施例1
在20～30℃室温下，先将活体水蛭从饲养槽中取至贮藏槽，用去离子水漂洗2分钟，除去活体水蛭表面的杂质，滤出水分，再浸入生理盐水漂洗20秒，使水蛭表面覆盖电解质，滤除盐水，平铺放入到200目长方形不锈钢滤槽内，滤槽与地面绝缘，滤网下为同面积已消毒洁净器皿，滤槽两端分别连接直流电的两极，先调整至最小的输出电流，然后打上电源开关，调整电流为1～6mA，40分钟后，断开电源，收取器皿中滤槽滴出的液体，后将水蛭从滤槽中放回贮藏槽，再放回饲养槽。
器皿中滤槽滴出的液体大部分为水蛭素有效成分，经过800μm纳滤膜后续处理30分钟可以除90％水，然后添加15％的医用淀粉，设定喷雾干燥进口210℃，出口温90℃，获得含800AT-U/g的高活性抗凝血酶活性水蛭素干粉。
实施例2
在20～30℃室温下，先将活体水蛭从饲养槽中取至贮藏槽，用去离子水漂洗2分钟出去活体水蛭表面的杂质，滤出水分，再浸入生理盐水漂洗20秒，使水蛭表面覆盖电解质，滤除盐水，平铺放入底部为200目滤网的长方形不锈钢滤槽内，滤槽与地面绝缘，滤网下为同面积已消毒洁净器皿，滤槽两端分别连接直流电的两极，先调整至最小的输出电流，打上电源开关，调整电流为5～12mA，进行电刺激20分钟后，断开电源，收取器皿中滤槽滴出的液体，然后将水蛭从滤槽中放回贮藏槽，再放回饲养槽。
器皿中滤槽滴出的液体大部分为水蛭素有效成分，经过800μm纳滤膜后续处理30分钟，除去90％的水，添加15％的医用淀粉，减压至0.9大气压下进行喷雾干燥，150℃下获得含800AT-U/g的高活性抗凝血酶活性水蛭素干粉。
实施例3
在20～30℃室温，先将活体水蛭从饲养槽中取至贮藏槽，用去离子水漂洗2分钟出去活体水蛭表面的杂质，滤出水分，再浸入生理盐水漂洗20秒，使水蛭表面覆盖电解质，滤除盐水，平铺放入底部为200目滤网的长方形不锈钢滤槽内，滤槽与地面绝缘，滤网下为同面积已消毒洁净器皿，滤槽两端分别连接直流电的两极，先调整至最小的输出电流，打上电源开关，调整电流为12～20mA，进行电刺激10分钟后，断开电源，收取器皿中滤槽滴出的液体，后将水蛭从滤槽中放回贮藏槽，再放回饲养槽。
器皿中滤槽滴出的液体大部分为水蛭素有效成分，经过800μm纳滤膜后续处理30分钟，除去90％水，加入0.05％海藻糖、0.02％乙酰半膀氨酸和0.05％枸杞酸钠配成的稳定剂，制得500～1000AT-U/g抗凝血酶液态水蛭素。
实施例4
在20～30℃室温，先将活体水蛭从饲养槽中取至贮藏槽，用去离子水漂洗2分钟出去活体水蛭表面的杂质，滤出水分，再浸入生理盐水漂洗20秒，放入不锈钢网的吊篮内，浸入装有0.5～1％浓度的盐水槽中，盐水槽内通入直流电，使得槽中盐水处于带电状态，先调整至最小的输出电流，打上电源开关，调整电流为3～12mA，进行电刺激5～20分钟后，移出，然后将水蛭从锈钢网的吊篮内倒回贮藏槽，再倒回饲养槽，同时重复将新装活体水蛭的另一个不锈钢网的吊篮浸入盐水槽中，实现活体水蛭提取水蛭素的连续生产。
盐水槽中滴出的液体大部分为水蛭素有效成分和盐水溶液混合物，经过800μm纳滤膜后续处理30分钟，除去90％水，添加0.05％海藻糖、0.02％乙酰半膀氨酸、0.05％枸杞酸钠配成的稳定剂，制得含1000AT-U/g抗凝血酶活性水蛭素含水混合物。可直接常温贮藏，也可以通过喷雾干燥得到水蛭素干粉。
实施例5
在20～30℃室温，先将活体水蛭从饲养槽中取至贮藏槽，用去离子水漂洗2分钟出去活体水蛭表面的杂质，滤出水分，置入50～200升塑料桶中，再倒入0.5～1％浓℃的盐水，盐水的量为水蛭量的体积与盐水体积比为1∶0.5～1.5，塑料桶内底部放置金属电极，塑料桶顶端的液面放置金属电极，分别连接直流电的两极，先调整至最小的输出电流，打上电源开关，缓慢调整电流为6～12mA，进行电刺激20分钟后，断开电源，将水蛭从塑料桶中倒回贮藏槽，后再倒回饲养槽。收集塑料桶中的液体，这部分液体大部分为水蛭素有效成分和盐水溶液混合物，经过800μm纳滤膜后续处理30分钟，除去90％水，加入0.05％海藻糖、0.02％乙酰半膀氨酸和0.05％枸杞酸钠配成的稳定剂，制得含1000AT-U/g抗凝血酶液态水蛭素。
Claims (1)
1.用电刺激活体水蛭提取水蛭素的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：在室温下，先将活体水蛭从饲养槽中提取至贮藏槽，用去离子水漂洗除其表面杂质，滤出水分，再浸入生理盐水漂洗，添加电解质液层覆盖，通入直流电进行刺激，同时确保合适的电流强度，避免水蛭死亡，收集水蛭分泌的液体，后将活体水蛭从滤槽中放回饲养槽，具体步骤和技术条件为：
1.1 采用直电流为3～12mA，进行电刺激活体水蛭5～20分钟后，获得在电流刺激下水蛭产生的分泌物，
1. 2将分泌物经过800μm纳滤膜后续处理30～180分钟，除去80～90%的水份，添加8～15%医用淀粉赋形，减压至0.9大气压下，在进口温度为230～180℃，出口温度90～75℃下进行喷雾干燥，获得含800AT-U/g的高活性抗凝血酶活性水蛭素干粉。
2、用电刺激活体水蛭提取水蛭素的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：在室温下，先将活体水蛭从饲养槽中提取至贮藏槽，用去离子水漂洗除其表面杂质，滤出水分，再浸入生理盐水漂洗，添加电解质液层覆盖，通入直流电进行刺激，同时确保合适的电流强度，避免水蛭死亡，收集水蛭分泌的液体，后将活体水蛭从滤槽中放回饲养槽，具体步骤和技术条件为：
1.1 采用直电流为3～12mA，进行电刺激活体水蛭5～20分钟后，获得在电流刺激下水蛭产生的分泌物，
1. 2将分泌物经过800μm纳滤膜后续处理30～180分钟，除去80～90%的水份，加入由0.05%海藻糖、0.02%乙酰半胱氨酸和0.05%枸杞酸钠配制成的稳定剂，制得含1000 AT-U/g抗凝血酶液态水蛭素。
3、根据权利要求1所述的用电刺激活体水蛭提取水蛭素的方法，其特征在于，所述用直流电刺激活体水蛭，直流电的电极使用不锈钢。
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