纯化牛跟腱胶原蛋白的方法及其海绵的制备
技术领域
本发明涉及以简易工艺达到高合格率的胶原海绵的制备方法。
背景技术
胶原蛋白是脊椎动物体内含量最多、分布较广的蛋白质。纤维状胶原蛋白形成所有哺乳动物结缔组织的结构基础,也是构成许多组织尤其结缔组织的主要成分,约占机体总蛋白的 25%。胶原蛋白独特的三股螺旋结构,赋予其良好的生物相容性、生物可降解性、无毒性使其在医药、生物组织工程等方面展现出极大潜力。
但是,市场上的胶原海绵的价格昂贵,柔韧性比较差,且用有潜在毒性的交联剂交联,其会严重影响海绵的生物相容性。一般的胶原蛋白海绵工艺复杂,工艺流程主要包括原料预处理--提取胶原蛋白--盐析--透析脱盐--交联--冷冻干燥。工艺流程中,一方面,在盐析过程中会引入氯离子杂质,需要采用透析进行脱盐纯化胶原过程中。由于透析袋的孔径比较小,大分子胶原溶液呈粘稠状,容易堵塞膜孔,限制胶原溶液中的小分子杂质如氯离子的排出,难以实现提高胶原的纯度目的。且透析耗时较长,操作比较麻烦,如中国发明专利公开说明书CN100444902C中用0.01%~0.1%醋酸作为透析外液透析2天,每天至少换液一次,再用磷酸氢二钠溶液透析至pH达到5以上。中国发明专利公开说明书 CN101569759A用NaCl为透析外液透析,每4小时换一次透析液,透析5天。透析过程中由于杂质离子和水离子发生置换,引起透析袋的膨胀,导致膜孔变大,胶原溶液会部分析出透析袋,且透析袋会因过度膨胀而涨破,这些因素均会导致胶原溶液的损失,降低胶原的产率。若用水洗胶原代替透析法,需要重复多次水洗才能洗至加硝酸银没有出现沉淀( 图1和图2),此操作较繁琐,且在洗涤过程中部分胶原溶液随水洗液流失,同样降低胶原的提取率。在研究过程中,我们发现将胶原提取液调节至中性可析出大量胶原(图3),而取其上清液盐析析出的胶原量很少,调节pH对胶原析出的影响程度远远大于盐析,故可选择直接调节 pH而不盐析,减少水洗胶原的次数,进而简化工艺流程。
另一方面,若胶原溶液交联程度控制不好,会导致在去除交联剂过程中胶原海绵出现裂缝,且难以去除交联剂,如中国发明专利公开说明CN101005865A 中胶原溶液与戊二醛交联,但是要从高亲水性胶原海绵中完全清除戊二醛比较困难,需要重复多次水洗至无戊二醛,该工艺不仅复杂,而且难以彻底清除戊二醛,残留的少量戊二醛对周围细胞有害,严重影响生物相容性,造成胶原蛋白海绵的合格率降低,市场价格昂贵。
为此,本研究重点在于充分粉碎牛跟腱以提高胶原提取率,不盐析直接调节pH来纯化胶原蛋白来简化工艺,避免使用有毒的化学交联剂来提高胶原蛋白的性能,简化工艺,降低成本,提高牛跟腱的经济价值。
发明内容
本发明鉴于上述现状,目的是提供简易工艺得到高纯度,其止血效果好,修复效果好,价格低的医用胶原蛋白海绵。
解决问题的技术方案
本发明涉及采用切片机和组织搅碎机依次充分绞碎速冻的牛跟腱,再用 0.1mol/L~0.2mol/L的氢氧化钠溶液去除杂蛋白,10%~12%的异丙醇或70%~75%的乙醇溶液脱脂,使产品的脂肪含量降到最低。
本发明涉及将提取的胶原溶液的pH调节至中性,使胶原充分析出来,代替盐析胶原的方法,避免引入氯离子,再采用直接水洗的方法纯化胶原蛋白。
本发明涉及不添加交联剂,冷冻干燥得到胶原海绵的制造方法。
本发明生产工艺简单,生产成本较低,具有广泛的推广价值。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
图1是加硝酸银检测胶原溶液中氯离子浓度的脱盐工艺图;图2是胶原蛋白水洗液的紫外扫描图;图3是胶原等电点析出图;图4是牛跟腱胶原蛋白紫外扫描图 (A:I型胶原蛋白标准品;B:牛跟腱胶原蛋白);图5是牛跟腱胶原蛋白的SDS-PAGE电泳图谱图;图6是胶原海绵表面形貌图;图7是胶原海绵受力后形貌图。
具体实施方式
实施例1纯化胶原蛋白及其海绵制备的具体步骤如下:
1)用刀片将置于-20℃速冻的牛跟腱去除筋膜,肌肉和脂肪等杂质,用切片机切成0.3mm厚,再用搅碎机充分粉碎;
2)用0.1mol/L~0.2mol/L的氢氧化钠溶液除去杂蛋白6~8小时,用蒸馏水洗至中性,再用10%~12%的异丙醇或70%~75%的乙醇溶液脱脂,用蒸馏水洗至中性且无异味;
3)溶解在1%~3%的醋酸溶液中;
4)向上述溶液中加入胃蛋白酶,胶原蛋白与胃蛋白酶的重量比为 25∶1,4℃下搅拌48小时;
5)将提取液离心,收集上清液,用10mol/L氢氧化钠将胶原溶液调至中性,收集得到的胶原沉淀,先加入0.5mol/L的醋酸溶解胶原沉淀,再加入胶原溶液两倍体积的超纯水充分搅拌水洗,离心取沉淀,继续加两倍体积的超纯水洗涤,如此重复操作,洗涤至胶原溶液为中性,即可得到高纯度的胶原蛋白。
6)将胶原溶液搅拌均匀,分装于培养皿中,在-20℃下预冻6小时,用冷冻干燥机冻干得到胶原海绵。
7)用Co60照射灭菌,包装,入库。
实施例2纯化胶原蛋白及其海绵制备的具体步骤如下:
1)用刀片将置于-20℃速冻的牛跟腱去除筋膜,肌肉和脂肪等杂质,用切片机切成0.3mm厚,再用搅碎机充分粉碎;
2)用0.1mol/L~0.2mol/L的氢氧化钠溶液除去杂蛋白6~8小时,用蒸馏水洗至中性,再用10%~12%的异丙醇或70%~75%的乙醇溶液脱脂,用蒸馏水洗至中性且无异味;
3)溶解在1%~3%的醋酸溶液中;
4)向上述溶液中加入胃蛋白酶,胶原蛋白与胃蛋白酶的重量比为 50∶1,4℃下搅拌60小时;
5)将提取液离心,收集上清液,用10mol/L氢氧化钠将胶原溶液调至中性,收集得到的胶原沉淀,先加入0.5mol/L的醋酸溶解胶原沉淀,再加入胶原溶液两倍体积的超纯水充分搅拌水洗,离心取沉淀,继续加两倍体积的超纯水洗涤,如此重复操作,洗涤至胶原溶液为中性,即可得到高纯度的胶原蛋白。
6)将胶原溶液搅拌均匀,分装于培养皿中,在-20℃下预冻7小时,用冷冻干燥机冻干得到胶原海绵。
7)用Co60照射灭菌,包装,入库。
实施例3纯化胶原蛋白及其海绵制备的具体步骤如下:
1)用刀片将置于-20℃速冻的牛跟腱去除筋膜,肌肉和脂肪等杂质,用切片机切成0.3mm厚,再用搅碎机充分粉碎;
2)用0.1mol/L~0.2mol/L的氢氧化钠溶液除去杂蛋白6~8小时,用蒸馏水洗至中性,再用10%~12%的异丙醇或70%~75%的乙醇溶液脱脂,用蒸馏水洗至中性且无异味;
3)溶解在1%~3%的醋酸溶液中;
4)向上述溶液中加入胃蛋白酶,胶原蛋白与胃蛋白酶的重量比为100∶1,4℃下搅拌 72 小时;
5)将提取液离心,收集上清液,用10mol/L氢氧化钠将胶原溶液调至中性,收集得到的胶原沉淀,先加入0.5mol/L的醋酸溶解胶原沉淀,再加入胶原溶液两倍体积的超纯水充分搅拌水洗,离心取沉淀,继续加两倍体积的超纯水洗涤,如此重复操作,洗涤至胶原溶液为中性,即可得到高纯度的胶原蛋白。
6)将胶原溶液搅拌均匀,分装于培养皿中,在-20℃下预冻8小时,用冷冻干燥机冻干得到胶原海绵。
7)用Co60照射灭菌,包装,入库。
本发明通过对牛跟腱的预处理,加酶量,提取时间,胶原溶液预冻时间的工艺参数的控制,得到的胶原蛋白通过紫外扫描表明牛跟腱胶原蛋白在235nm 处有明显的吸收峰,与I型胶原蛋白的特征性吸收峰基本重叠,可判定提取的为 I型胶原蛋白( 图4)。另外,I型胶原蛋白为由三条多肽链互相缠绕形成的三螺旋结构,包括α1(2 条)、α2(1 条)链两种。SDS-PAGE凝胶电泳图中的胶原蛋白条带电泳迁移的位置与I型胶原蛋白标准品相同,表明提取的胶原蛋白提取物符合I型胶原蛋白特征,此外SDS-PAGE电泳图上几乎无杂带,表明提取物的纯度比较高(图5)。未交联的胶原蛋白溶液冷冻干燥后,形成疏松多孔的海绵结构,其色泽洁白并带有一定的韧性(图6和图7)。