CN106421903A - 蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜及其制备方法。所述的蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备方法，包括：制备蓝鲨鱼皮胶原，利用蓝鲨鱼皮胶原或蓝鲨鱼皮胶原以及壳聚糖和PEO中的至少一种进行静电纺丝，得到蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜。本发明所用的蓝鲨鱼皮胶原和壳聚糖均为天然可降解材料，具有优异的生物相容性，且来源广泛。本发明所采用的静电纺丝方法制得的蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜，能够很好的模拟天然细胞质基质的结构和功能。这种蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜用于牙周组织缺损的治疗，可有效的促进细胞的粘附、增殖和分化，促进牙周组织的引导再生。

Description

蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜及其制备方法
技术领域
本发明属于新型组织修复生物材料的加工领域，具体涉及蓝鲨鱼皮胶原的制备及蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备。
背景技术
人体健康容易受到各类疾病的威胁，而口腔疾病是其中的一类多发疾病。人的口腔由于手术和各种常见口腔疾病，极易造成口腔创伤和组织缺损，牙周病就是其中的一种。牙周病是指发生在牙支持组织(牙周组织)的疾病，它作为常见的口腔疾病，是引起成年人牙齿丧失的主要原因之一，也是危害人类牙齿和全身健康的主要口腔疾病。因此，牙周病的治疗一直是临床重点研究领域。目前，牙周组织引导再生技术(GTR)是当今先进的牙周治疗方法，牙周组织引导再生技术是利用一种组织引导再生膜放置于牙根和牙龈组织瓣之间，以达到物理性阻挡牙龈结缔组织细胞和上皮组织细胞与牙根先接触，保证由根方残余的牙周膜组织来源细胞和牙槽骨细胞优先占据根面并在其上伸长和向冠方爬行。目前，这种类型的膜材料主要包括不可降解材料和可降解材料两大类，不可降解材料由于不能被组织吸收，需要二次手术取出，增加了病人的痛苦。而可降解材料一般是自体或异体取材，取部分人体组织作为修复材料，移植到有缺损的口腔组织或创面上，但存在来源受限，增加手术风险，免疫原性等问题。因此，开发一种来源广泛的可降解牙周组织引导再生膜对于这类疾病的治疗具有重要意义，而目前市场上的牙周组织引导再生膜材料在设计和性能上均存在各种不足。
胶原蛋白主要可分为陆生胶原和水生胶原两种，大部分的陆生和水生胶原都属于I型胶原，胶原由于其结构组成，具有优良的细胞相容性、血液相容性，无免疫原性，可生物降解，能够促进细胞的增殖分化，促进组织再生。目前经常使用的胶原多为陆生胶原，提取自牛、猪等陆生哺乳动物的肌腱、皮、骨等部位，但是由于哺乳动物的传染病等因素，安全性受到威胁，部分国家已经开始限制陆生胶原的使用。而随着海洋资源的开发及工业化加工技术的发展，鱼皮资源日益丰富，从鱼皮中提取安全卫生的胶原蛋白逐渐受到广泛关注。这其中，蓝鲨鱼皮胶原与陆生胶原相比，具有很多的特异性优势，包括优异的细胞相容性和血液相容性，降解产物易被人体吸收利用，促进细胞的生长。
到目前为止，国内外的研究者报道了多种胶原蛋白的提取方法。总的来说，依据提取介质的不同，鱼类胶原蛋白的提取方法可分为五类：热水法、碱法、酸法、盐法以及酶法。不论哪种方法，其基本原理都是根据胶原蛋白的特性改变蛋白质所在的外界环境，把胶原蛋白从其他蛋白质或基质中分离出来。在很多情况下，单一的提取方法达不到预期目标，有很多缺点，不利于实际的工业化生产。例如：热水提取法：由于提取温度较高，胶原蛋白易于变性；碱提取法：提取速度快而且彻底，胶原蛋白的结构变异；酸提取法：可以最大程度地保持其三股螺旋结构，但产品得率较低、溶剂残留、提取时间较长、步骤繁琐，而且提取后的废液排放对环境会造成一定影响；盐析法：提取所得的胶原蛋白需透析去除盐份，工艺繁杂，得率较低；酶提取法：提取的溶出率高并且能降低胶原的抗原性，但水解不够彻底、成本较高，可能会引起胶原蛋白结构部分发生变化，易获得小分子肽，影响纯化产品的品质。本工艺采用新型的等电点提取法，可以高效简便的获得高纯度、大分子鱼皮胶原蛋白，便于工业化大规模生产。
壳聚糖是自然界中存在的天然碱性多糖，是甲壳素的脱乙酰基产物，甲壳素在自然界中含量仅次于纤维素，来源广泛。壳聚糖作为一种天然高分子材料，具有良好的生物相容性、可降解性、抗菌性、促愈性、无毒、对粘膜无刺激性，可以促进黏膜粘附，在生物医用材料领域具有广泛的应用。
静电纺丝技术是目前制备纳米纤维最简单有效的方法，在静电纺丝过程中，纺丝溶液置于针管当中，被微量推进控制装置推出至针头，在高压电场的作用下，纺丝溶液从针头喷出，经过电场的拉伸，溶剂挥发形成纤维，最后被收集在接地的收集装置上。不同的收集装置可以制备出不同类型的试样。采用平板接收装置可以制备出具有小孔径、高孔隙率的纳米纤维膜。通过静电纺丝制备的纳米纤维膜可以模拟细胞外基质的结构功能，有利于细胞的粘附、增殖和分化。
公开号CN 1562388 A公开了一种口腔组织补片，由人的异体或哺乳动物的膜状或片状组织经脱细胞处理而成的具有三维空间框架结构的细胞外基质。该种方法制备的组织补片材料由于脱除了抗原细胞，有效解决了异体排异问题。但该种方法存在取材复杂、来源受限，且存在哺乳动物的传染病等安全性威胁。公开号CN 101791431 A公开了一种以人工合成聚酯类聚合物或天然生物可降解高分子材料为原料，通过静电纺丝工艺制备了负载有生长因子的纳米结构薄膜材料，具有抑制炎症和促进组织再生的优势，但人工合成材料的降解产物会对组织的生长产生不良影响。实用新型专利授权号CN205073351 U公开了一种口腔补片，以脱细胞质基质作为基底层，通过物理吸附或蛋白胶粘合的方式固定一层蛋白质疏松层。该种方法制备的口腔补片具有组织相容性好，可逐步降解和厚度适宜等优点，但材料的柔顺性和贴合性较差，难以在复杂创面情况下进行有效贴合。公开号CN 1107742 A公开了一种组织引导再生胶原膜，通过酶消化法从哺乳动物结缔组织中提取胶原，再经冷冻干燥法成型。这种材料可降解吸收，不需要二次手术取出，具有良好的理化性能和生物相容性。公开号CN 103191085 A提供了一种双层复合再生膜的制备方法，由可降解高分子纤维网与冻干胶原膜复合而成，冻干胶原膜中复合有纳米银离子和抗生素药物。用于组织修复可促进伤口的愈合，提高引导膜的机械强度。公开号CN 103071189 A公开了将胶原经过溶解、离心、冻干、交联后制备成组织引导再生用胶原膜的方法。该方法具有工艺简单、成本低的优点，且制备的胶原膜具有良好的力学性能。公开号CN 105079877 A公开了将丝素蛋白经过冷冻干燥和氨基酸交联增塑制备牙周补片的方法，该种方法制备的牙周补片具有良好的柔韧性和机械强度，且制备工艺简单，适于规模化生产。以上专利采用冷冻干燥的方法制备组织引导再生材料虽然具有良好的生物相容性和机械性能，但都不能很好的模仿细胞外基质的结构和功能，且由于孔径较大，难以起到细胞屏蔽和引导细胞贴壁生长的作用。
目前关于对牙周组织引导再生膜材料的研究当中，以自体或异体的脱细胞质基质和各种可降解材料的冻干膜为主。使用脱细胞质基质制备组织引导再生材料会存在材料来源受限，取材和制备过程繁琐，容易受到哺乳动物的传染病及各种病毒性疾病的威胁。用天然材料如胶原等的冻干膜制备的组织引导再生材料由于孔径较大、孔的连通性差等问题，难以较好的模拟细胞质基质的结构功能，不利于细胞的粘附生长和组织间营养物质的运输。除了天然材料，使用合成可降解材料时会存在降解产物的炎症反应等问题。因此，在开发牙周组织引导再生材料时，除了要使用具有优良生物相容性的天然可降解材料之外，还应该要尽可能的模拟细胞质基质的结构和功能，以达到最佳的引导组织再生效果。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有材料和制备技术的不足，提出一种蓝鲨鱼皮胶原的制备提纯方法，并以制备的蓝鲨鱼皮胶原为原料复合壳聚糖、PEO其中的一种或多种制备具有仿细胞质基质的结构和功能的蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜。
为了达到上述目的，本发明提供了一种蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，包括：制备蓝鲨鱼皮胶原，利用蓝鲨鱼皮胶原或蓝鲨鱼皮胶原以及壳聚糖和PEO中的至少一种进行静电纺丝，得到蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜。
优选地，所述的蓝鲨鱼皮胶原的制备方法包括：
第一步：去除蓝鲨皮下肌肉和脂肪组织，在蒸馏水下清洗浸泡0.5-1h，将鱼皮剪成直径3-5mm碎片，过滤备用；
第二步：将鱼皮置于0.25-0.5mol/L NaOH溶液中脱脂处理，用磁力搅拌器搅拌4-12h，置于0-6℃的冰箱中冷藏8-16h，取出后用蒸馏水清洗过滤；
第三步：将鱼皮置于70％-90％的乙醇溶液中进行脱糖处理，用磁力搅拌器搅拌2-6h，取出后用蒸馏水清洗过滤；
第四步：将鱼皮用粉碎机粉碎，置于0.25-0.5mol/L冰醋酸溶液中水解处理，用磁力搅拌器搅拌4-12h，置于0-6℃的冰箱中冷藏2-8h，得到提取物；
第五步：采用等电点技术，将上述提取物，先经过纱网过滤，取滤液，在滤液中滴加0.25-0.5mol/LNaOH溶液至等电点时，可见白色棉絮状物析出，将其过滤取沉淀物，蒸馏水清洗后挤干封装，冷冻干燥保存，即为蓝鲨鱼皮胶原。
更优选地，经过SDS-PAGE凝胶电泳检测所得的蓝鲨鱼皮胶原为I型胶原，相对分子量为100-300KDa。
优选地，所述的利用蓝鲨鱼皮胶原进行静电纺丝的具体步骤包括：
步骤A：在溶剂中加入蓝鲨鱼皮胶原，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，得到纺丝液，所述溶剂为六氟异丙醇10-90vol％和余量的乙酸的混合溶液；
步骤B：在纺丝电压为4-30KV，纺丝液给进速率为0.5-1.5ml/h、接收距离为10-30cm、环境温度为15-40℃、相对湿度为10-60％的条件下进行静电纺丝，将得到的纳米纤维膜置于真空干燥箱中干燥后，得到蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜；
所述的利用蓝鲨鱼皮胶原以及PEO进行静电纺丝的具体步骤包括：
步骤a：在溶剂中加入蓝鲨鱼皮胶原，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解后加入PEO，再次搅拌至完全溶解，得到纺丝液，所述溶剂为六氟异丙醇0-90vol％、去离子水0-60vol％和余量的乙酸的混合溶液；
步骤b：在纺丝电压为4-30Kv，纺丝液给进速率为0.5-1.5ml/h、接收距离为10-30cm、环境温度为15-40℃、相对湿度为10-60％的条件下进行静电纺丝，将得到的纳米纤维膜置于真空干燥箱中干燥后，得到蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜；
所述的利用蓝鲨鱼皮胶原以及壳聚糖和PEO进行静电纺丝的具体步骤包括：
步骤1：在体积分数为10-90％的乙酸水溶液中加入壳聚糖，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，记为A液；在六氟异丙醇80-90vol％和余量乙酸的混合溶液中加入蓝鲨鱼皮胶原，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，记为B液；将A液和B液以0.8-1∶1的体积比混合，用磁力搅拌器搅拌均匀后再加入PEO，再次用磁力搅拌器搅拌均匀，得到纺丝液；或者，在体积分数为10-60％的乙酸水溶液中依次加入壳聚糖、蓝鲨鱼皮胶原和PEO，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，得到纺丝液；
步骤2：在纺丝电压为4-30Kv，纺丝液给进速率为0.5-1.5ml/h、接收距离为10-30cm、环境温度为15-40℃、相对湿度为10-60％的条件下进行静电纺丝，将得到的纳米纤维膜置于真空干燥箱中干燥后，得到蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜。
更优选地，所述的步骤A中的纺丝液中的蓝鲨鱼皮胶原的浓度为1-15wt％。
更优选地，所述的步骤a中的纺丝液中蓝鲨鱼皮胶原与PEO的总浓度为3-6wt％，蓝鲨鱼皮胶原与PEO的质量比为2-9∶1；所述的步骤a中的PEO为白色粉末，级别为医用级，分子量为400-1000KDa。
更优选地，所述的步骤1中的壳聚糖为白色粉末，脱乙酰度＞95％，级别为医用级，A液中壳聚糖的浓度为0.8-7.2wt％；B液中蓝鲨鱼皮胶原的浓度为0.8-7.2wt％；PEO为白色粉末，级别为医用级，分子量为400-1000KDa，纺丝液中PEO的浓度为0.4-2wt％。
更优选地，所述的步骤B、步骤b和步骤2中的真空干燥温度为20-140℃，真空干燥时间为12-48h。
更优选地，所述的蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜中纳米纤维直径在100-600nm，纳米纤维膜孔径在0.5-6um，孔隙率在60％-90％，厚度在0.2-1.2mm；纳米纤维膜的拉伸断裂强度在5-20MPa，拉伸断裂伸长率在5％-50％。
更优选地，所述的蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的细胞相容性测试结果表明细胞相容性良好，细胞毒性评级0级。
本发明还提供了上述制备方法所制备的蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明采用静电纺丝方法制得蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜，制备的材料具有小孔隙，高孔隙率，高连通性的优点，能够很好的模拟天然细胞质基质的结构和功能，在发挥阻隔作用的同时不影响组织间营养物质和生长因子的运输，细胞也能够很好的在膜上面粘附增殖和分化，促进组织的引导再生。采用静电纺丝的方式制备蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生膜，制备过程安全快捷高效。
2.本发明的原材料蓝鲨鱼皮胶原来源广泛，安全卫生。具有优良的细胞相容性和血液相容性，还可降解，且降解产物为细胞所必须的氨基酸，使用静电纺丝的方法加工成纳米纤维膜结构，能够促进细胞的粘附增殖和分化。
3.本发明的壳聚糖具有良好的生物相容性、可降解性、抗菌性、促愈性。采用壳聚糖与蓝鲨鱼皮胶原混纺，由于在混纺膜中与蓝鲨鱼皮胶原发生相互作用，可以增加混纺膜的稳定性，提高机械性能，还可以促进混纺膜与组织粘膜的粘附，PEO的加入进一步提高了纳米纤维膜的机械性能和稳定性。
4.本发明的蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜易与组织粘膜贴合，具有优异的柔顺性，可适应给种类型的牙周组织引导再生需求，壳聚糖和PEO的加入提高了材料的稳定性和机械性能。还可以通过交联等后处理方式调节膜的降解时间，以适应不同类型的牙周组织引导再生需求。
5.本发明所选材料来源广泛，价廉易得，生物相容性好。材料可降解，避免了二次手术取出的伤害。制备工艺简单高效，适宜大批量生产。
6.本发明方法制备的蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜，可用于临床口腔疾病如口腔溃疡、牙周组织缺损等的修复和治疗。
7.本发明所采用的等电点提取技术制备蓝鲨鱼皮胶原，可以高效简便的制备高纯度、结构完整的胶原蛋白，且制备过程污染小、效率高，便于工业化大规模生产。
8.本发明基于静电纺丝成膜技术，可以制备出具有仿细胞质基质结构和功能的膜材料，促进细胞的粘附增殖和分化，而且由于孔隙之间的连通性，不会影响组织之间的营养物质的运输。并且采用静电纺丝技术制备的纳米纤维膜具有优异的柔顺性，可适应各种类型创面，保证与创面组织的良好贴附。
附图说明
图1为实施例2中得到的蓝鲨鱼皮胶原/壳聚糖/PEO组织引导再生纳米纤维膜的扫描电镜图片
图2为实施例3中得到的蓝鲨鱼皮胶原/壳聚糖/PEO组织引导再生纳米纤维膜的扫描电镜图片；
图3为实施例4中得到的蓝鲨鱼皮胶原/PEO组织引导再生纳米纤维膜的扫描电镜图片；
图4为实施例5中得到的蓝鲨鱼皮胶原/PEO组织引导再生纳米纤维膜的扫描电镜图片；
图5为实施例6中得到的蓝鲨鱼皮胶原组织引导再生纳米纤维膜的扫描电镜图片；
图6为实施例2中得到的蓝鲨鱼皮胶原/壳聚糖/PEO组织引导再生纳米纤维膜覆盖子35％冰醋酸溶液诱发大鼠实验性口腔溃疡模型上12天后的透射电镜结果；
图7为实施例2中得到的蓝鲨鱼皮胶原/壳聚糖/PEO组织引导再生纳米纤维膜覆盖于35％冰醋酸溶液诱发大鼠实验性口腔溃疡模型上12天后的光镜病理组织学检查结果；
图8为实施例3中得到的蓝鲨鱼皮胶原/PEO组织引导再生纳米纤维膜覆盖于35％冰醋酸溶液诱发大鼠实验性口腔溃疡模型上12天后的透射电镜结果；
图9为实施例3中得到的蓝鲨鱼皮胶原/PEO组织引导再生纳米纤维膜覆盖于35％冰醋酸溶液诱发大鼠实验性口腔溃疡模型上12天后的光镜病理组织学检查结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
以下实施例中所用的壳聚糖为白色粉末，脱乙酰度＞95％，级别为医用级。所述的PEO为白色粉末，分子量为400-1000KDa。
实施例1
蓝鲨鱼皮胶原的制备方法：
第一步：去除蓝鲨皮下肌肉和脂肪组织，在蒸馏水下清洗浸泡0.5h。将鱼皮剪成直径3-5mm碎片，过滤备用；
第二步：将鱼皮置于0.35mol/L NaOH溶液中脱脂处理，用磁力搅拌器搅拌6h。置于4℃的冰箱中冷藏12h。取出后用蒸馏水清洗过滤；
第三步：将鱼皮置于体积分数为85％的乙醇溶液中进行脱糖处理，用磁力搅拌器搅拌2h，取出后用蒸馏水清洗过滤；
第四步：将鱼皮用粉碎机粉碎，置于0.35mol/L冰醋酸溶液中水解处理，用磁力搅拌器搅拌6h，置于4℃的冰箱中冷藏4h，得到提取物；
第五步：采用等电点技术，将上述提取物，先经过纱网过滤，取滤液，在滤液中滴加0.35mol/L NaOH溶液至等电点时(pH7.0)，可见大量白色棉絮状物析出，将其过滤取沉淀物，蒸馏水清洗后挤干封装，冷冻干燥保存。所得产物即为蓝鲨鱼皮胶原。
经过SDS-PAGE凝胶电泳检测所得的蓝鲨鱼皮胶原为I型胶原，相对分子量为130-200KDa。
实施例2
一种蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备方法，具体步骤为：
(1)采用实施例1中的方法制备蓝鲨鱼皮胶原；
(2)利用蓝鲨鱼皮胶原以及壳聚糖和PEO进行静电纺丝：
在体积分数为50％的乙酸水溶液中加入壳聚糖，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，溶液中壳聚糖的浓度为2wt％，记为A液；在90vol％的六氟异丙醇和10vol％乙酸的混合溶液中加入步骤(1)制备的蓝鲨鱼皮胶原，用磁力搅拌器搅拌24h至其完全溶解，溶液中蓝鲨鱼皮胶原的浓度为5.2wt％，记为B液。将A液、B液按照0.85∶1的体积比进行混合，用磁力搅拌器搅拌均匀后，加入PEO，再次用磁力搅拌器搅拌均匀使其完全溶解，得到纺丝液，其中PEO的浓度为1.1wt％。将此纺丝液加入到注射器当中并将注射器固定到推进装置上。设定纺丝电压为20Kv，纺丝液给进速率为1.1ml/h，接收距离为20cm。在环境温度为28℃，相对湿度为20％的条件下进行静电纺丝，可以得到纳米纤维膜，将此纳米纤维膜在37℃的真空干燥箱中干燥24h，即可得到蓝鲨鱼皮胶原/壳聚糖/PEO组织引导再生纳米纤维膜，如图1所示。
所制备的蓝鲨鱼皮胶原组织引导再生纳米纤维膜厚度为1.1mm，拉伸断裂强度15MPa，拉伸断裂伸长率28％。从图1可以看出所得的胶原/壳聚糖/PEO组织引导再生纳米纤维膜的纤维直径为454±30nm，孔径在3.4±1.1um之间，孔隙率为86±5％。
图6和图7为35vol％冰醋酸诱发大鼠实验性口腔溃疡的实验结果，给药12天后，取6只肉眼观察溃疡较轻的大鼠麻醉处死，取一小部分嘴唇溃疡及周围组织标本，切成1mm3大小组织，用4％多聚甲醛保存做透射电镜检查；另取一部分嘴唇溃疡及周围组织标本，用10％甲醛液固定，常规脱水、石蜡包埋切片、HE染色，光镜下观察溃疡组织的组织病理学变化。从图6可以看出：上皮细胞排列整齐，结构清楚，大部分较正常少数区域的上皮细胞间隙稍宽，上皮下结缔组织内梭形细胞较丰富，偶尔见嗜中性粒细胞及淋巴细胞，其他细胞内未见空泡结构；从图7可以看出，口腔溃疡部位组织基本痊愈，肉芽组织和纤维化形成较为明显。此实验可以证明静电纺丝膜可显著加速缩小口腔溃疡直径，减轻充血水肿程度，加速口腔溃疡愈合。
实施例3
一种蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备方法，具体步骤为：
(3)采用实施例1中的方法制备蓝鲨鱼皮胶原；
(4)利用蓝鲨鱼皮胶原以及壳聚糖和PEO进行静电纺丝：
在体积分数为40％的乙酸水溶液中依次加入壳聚糖、步骤(1)制备的蓝鲨鱼皮胶原、PEO，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，得到纺丝液。溶液中壳聚糖的浓度为1wt％，蓝鲨鱼皮胶原的浓度为3wt％，PEO的浓度为1wt％。将此纺丝液加入到注射器当中并将注射器固定到推进装置上。设定纺丝电压为16Kv，纺丝液给进速率为0.6ml/h，接收距离为20cm。在环境温度为28℃，相对湿度为20％的条件下进行静电纺丝，可以得到纳米纤维膜，将此纳米纤维膜在37℃的真空干燥箱中干燥24h，即可得到蓝鲨鱼皮胶原/壳聚糖/PEO组织引导再生纳米纤维膜，如图2所示。
所制备的蓝鲨鱼皮胶原组织引导再生纳米纤维膜厚度为0.6mm，拉伸断裂强度2MPa，拉伸断裂伸长率6％。从图2可以看出所得的胶原/壳聚糖/PEO组织引导再生纳米纤维膜的纤维直径为205±30nm，孔径在2.4±0.8um之间，孔隙率为76±6％。由于此实例与实例1获得的静电纺丝膜的组分相同，因此，可以认为其可显著加速缩小口腔溃疡直径，减轻充血水肿程度，加速口腔溃疡愈合。
实施例4
一种蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备方法，具体步骤为：
(1)采用实施例1中的方法制备蓝鲨鱼皮胶原；
(2)利用蓝鲨鱼皮胶原以及PEO进行静电纺丝：
以六氟异丙醇60vol％和余量的乙酸的混合溶液为溶剂，在溶剂中加入蓝鲨鱼皮胶原，用磁力搅拌器搅拌24h使其完全溶解后加入PEO，再次搅拌至完全溶解，得到纺丝液，溶液中蓝鲨鱼皮胶原与PEO的总浓度为4wt％，其中蓝鲨鱼皮胶原与PEO的质量比为4∶1。将此纺丝溶液加入到注射器当中并将注射器固定到推进装置上。设定纺丝电压为12Kv，纺丝液给进速率为1.3ml/h，接收距离为23cm。在环境温度为32℃，相对湿度为28％的条件下进行静电纺丝，可以得到纳米纤维膜，将此纳米纤维膜在30℃的真空干燥箱中干燥24h，即可得到蓝鲨鱼皮胶原/PEO组织引导再生纳米纤维膜，如图3所示。
所制备的蓝鲨鱼皮胶原组织引导再生纳米纤维膜厚度为0.9mm，拉伸断裂强度10MPa，拉伸断裂伸长率25％。从图3中可以看出所得的胶原/PEO组织引导再生纳米纤维膜的纤维直径为358±33nm，孔径为3.2±1um，孔隙率为(72±6％)。
图8和图9为35vol％冰醋酸诱发大鼠实验性口腔溃疡的实验结果，给药12天后，取6只肉眼观察溃疡较轻的大鼠麻醉处死，取一小部分嘴唇溃疡及周围组织标本，切成1mm3大小组织，用4％多聚甲醛保存做透射电镜检查；另取一部分嘴唇溃疡及周围组织标本，用10％甲醛液固定，常规脱水、石蜡包埋切片、HE染色，光镜下观察溃疡组织的组织病理学变化。从图8可以看出：上皮细胞排列整齐，结构清楚，大部分较正常少数区域的上皮细胞间隙稍宽，上皮下结缔组织内梭形细胞较丰富，偶尔见嗜中性粒细胞及淋巴细胞，其他细胞内未见空泡结构；其愈合程度比实例2的愈合程度略差。从图9可以看出，口腔溃疡部位组织基本痊愈，肉芽组织和纤维化形成较为明显。此实验可以证明静电纺丝膜可显著加速缩小口腔溃疡直径，减轻充血水肿程度，加速口腔溃疡愈合。
实施例5
一种蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备方法，具体步骤为：
(3)采用实施例1中的方法制备蓝鲨鱼皮胶原；
(4)利用蓝鲨鱼皮胶原以及PEO进行静电纺丝：
以乙酸60vol％和余量的去离子水的混合溶液为溶剂，在溶剂中加入蓝鲨鱼皮胶原，用磁力搅拌器搅拌24h使其完全溶解后加入PEO，再次搅拌至完全溶解，得到纺丝液，溶液中蓝鲨鱼皮胶原与PEO的总浓度为4wt％，其中蓝鲨鱼皮胶原与PEO的质量比为4∶1。将此纺丝溶液加入到注射器当中并将注射器固定到推进装置上。设定纺丝电压为14Kv，纺丝液给进速率为0.3ml/h，接收距离为25cm。在环境温度为32℃，相对湿度为28％的条件下进行静电纺丝，可以得到纳米纤维膜，将此纳米纤维膜在30℃的真空干燥箱中干燥24h，即可得到蓝鲨鱼皮胶原/PEO组织引导再生纳米纤维膜，如图4所示。
所制备的蓝鲨鱼皮胶原组织引导再生纳米纤维膜厚度为0.5mm，拉伸断裂强度1MPa，拉伸断裂伸长率12％。从图4中可以看出所得的胶原/PEO组织引导再生纳米纤维膜的纤维直径为198±37nm，孔径为2.2±1um，孔隙率为(74±4％)。由于此实例与实例3获得的静电纺丝膜的组分相同，因此，可以认为其可显著加速缩小口腔溃疡直径，减轻充血水肿程度，加速口腔溃疡愈合。
实施例6
一种蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备方法，具体步骤为：
(1)采用实施例1中的方法制备蓝鲨鱼皮胶原；
(2)利用蓝鲨鱼皮胶原进行静电纺丝：
以六氟异丙醇70vol％和余量的乙酸的混合溶液为溶剂，在溶剂中加入蓝鲨鱼皮胶原，用磁力搅拌器搅拌24h使其完全溶解，得到浓度为13wt％的纺丝溶液，将此纺丝溶液加入到注射器当中并将注射器固定到推进装置上。设定纺丝电压为10Kv，纺丝液给进速率为1.4ml/h，接收距离为25cm。在环境温度为30℃，相对湿度为30％的条件下进行静电纺丝，可以得到纳米纤维膜，将此纳米纤维膜在25℃的真空干燥箱中干燥24h，即可得到蓝鲨鱼皮胶原组织引导再生纳米纤维膜，如图3所示。
所制备的蓝鲨鱼皮胶原组织引导再生纳米纤维膜厚度为0.8mm，拉伸断裂强度7.3MPa，拉伸断裂伸长率22％。从图1中可以看出，所得的蓝鲨鱼皮胶原组织引导再生纳米纤维膜的纤维直径为363±35nm，孔径为3.7±1.2um，孔隙率为78±9％。其比实施例2和实施例3的胶原含量更高，因此可以认为其更加可以减小口腔溃疡的直径，减轻充血水肿程度，加速口腔溃疡的愈合。

Claims (10)

1.一种蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，包括：制备蓝鲨鱼皮胶原，利用蓝鲨鱼皮胶原或蓝鲨鱼皮胶原以及壳聚糖和PEO中的至少一种进行静电纺丝，得到蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜。
2.如权利要求1所述的蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，所述的蓝鲨鱼皮胶原的制备方法包括：
第一步：去除蓝鲨皮下肌肉和脂肪组织，在蒸馏水下清洗浸泡0.5-1h，将鱼皮剪成直径3-5mm碎片，过滤备用；
第二步：将鱼皮置于0.25-0.5mol/L NaOH溶液中脱脂处理，用磁力搅拌器搅拌4-12h，置于0-6℃的冰箱中冷藏8-16h，取出后用蒸馏水清洗过滤；
第三步：将鱼皮置于70％-90％的乙醇溶液中进行脱糖处理，用磁力搅拌器搅拌2-6h，取出后用蒸馏水清洗过滤；
第四步：将鱼皮用粉碎机粉碎，置于0.25-0.5mol/L冰醋酸溶液中水解处理，用磁力搅拌器搅拌4-12h，置于0-6℃的冰箱中冷藏2-8h，得到提取物；
第五步：采用等电点技术，将上述提取物，先经过纱网过滤，取滤液，在滤液中滴加0.25-0.5mol/LNaOH溶液至等电点时，可见白色棉絮状物析出，将其过滤取沉淀物，蒸馏水清洗后挤干封装，冷冻干燥保存，即为蓝鲨鱼皮胶原。
3.如权利要求2所述的蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，经过SDS-PAGE凝胶电泳检测所得的蓝鲨鱼皮胶原为I型胶原，相对分子量为100-300KDa。
4.如权利要求1所述的蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，利用蓝鲨鱼皮胶原进行静电纺丝的具体步骤包括：
步骤A：在溶剂中加入蓝鲨鱼皮胶原，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，得到纺丝液，所述溶剂为六氟异丙醇10-90vol％和余量的乙酸的混合溶液；
步骤B：在纺丝电压为4-30KV，纺丝液给进速率为0.5-1.5ml/h、接收距离为10-30cm、环境温度为15-40℃、相对湿度为10-60％的条件下进行静电纺丝，将得到的纳米纤维膜置于真空干燥箱中干燥后，得到蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜；
所述的利用蓝鲨鱼皮胶原以及PEO进行静电纺丝的具体步骤包括：
步骤a：在溶剂中加入蓝鲨鱼皮胶原，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解后加入PEO，再次搅拌至完全溶解，得到纺丝液，所述溶剂为六氟异丙醇0-90vol％、去离子水0-60vo1％和余量的乙酸的混合溶液；
步骤b：在纺丝电压为4-30Kv，纺丝液给进速率为0.5-1.5ml/h、接收距离为10-30cm、环境温度为15-40℃、相对湿度为10-60％的条件下进行静电纺丝，将得到的纳米纤维膜置于真空干燥箱中干燥后，得到蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜；
所述的利用蓝鲨鱼皮胶原以及壳聚糖和PEO进行静电纺丝的具体步骤包括：
步骤1：在体积分数为10-90％的乙酸水溶液中加入壳聚糖，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，记为A液；在六氟异丙醇80-90vol％和余量乙酸的混合溶液中加入蓝鲨鱼皮胶原，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，记为B液；将A液和B液以0.8-1∶1的体积比混合，用磁力搅拌器搅拌均匀后再加入PEO，再次用磁力搅拌器搅拌均匀，得到纺丝液；或者，在体积分数为10-60％的乙酸水溶液中依次加入壳聚糖、蓝鲨鱼皮胶原和PEO，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，得到纺丝液；
步骤2：在纺丝电压为4-30Kv，纺丝液给进速率为0.5-1.5ml/h、接收距离为10-30cm、环境温度为15-40℃、相对湿度为10-60％的条件下进行静电纺丝，将得到的纳米纤维膜置于真空干燥箱中干燥后，得到蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜。
5.如权利要求4所述的蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，所述的步骤A中的纺丝液中的蓝鲨鱼皮胶原的浓度为1-15wt％。
6.如权利要求4所述的蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，所述的步骤a中的纺丝液中蓝鲨鱼皮胶原与PEO的总浓度为3-6wt％，蓝鲨鱼皮胶原与PEO的质量比为2-9∶1；所述的步骤a中的PEO为白色粉末，级别为医用级，分子量为400-1000KDa。
7.如权利要求4所述的蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，所述的步骤1中的壳聚糖为白色粉末，脱乙酰度＞95％，级别为医用级，A液中壳聚糖的浓度为0.8-7.2wt％；B液中蓝鲨鱼皮胶原的浓度为0.8-7.2wt％；PEO为白色粉末，级别为医用级，分子量为400-1000KDa，纺丝液中PEO的浓度为0.4-2wt％。
8.如权利要求4所述的蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，所述的步骤B、步骤b和步骤2中的真空干燥温度为20-140℃，真空干燥时间为12-48h。
9.如权利要求4所述的蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，所述的蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜中纳米纤维直径在100-600nm，纳米纤维膜孔径在0.5-6um，孔隙率在60％-90％，厚度在0.2-1.2mm；纳米纤维膜的拉伸断裂强度在5-20MPa，拉伸断裂伸长率在5％-50％。
10.权利要求1-9中任一项所述的蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备方法所制备的蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜。
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