CN103046225A

CN103046225A - 一种胶原蛋白膜的制备方法

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Publication number: CN103046225A
Application number: CN2013100175571A
Authority: CN
Inventors: 孙莉嫚; 彭红卫; 陈春会; 李好雨; 刘富俊; 张风豪; 朱小舟
Original assignee: SUZHOU DAPU BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI JINGZE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2012-01-19
Filing date: 2013-01-17
Publication date: 2013-04-17
Anticipated expiration: 2033-01-17
Also published as: CN103046225B

Abstract

本发明公开了一种纳米胶原蛋白膜的制备方法，包括如下步骤：（1）取胶原蛋白溶于六氟异丙醇中，得80~120mg/ml胶原蛋白六氟异丙醇溶液；（2）取步骤（1）的胶原蛋白六氟异丙醇溶液进行静电纺丝，电压为15~19KV，接收距离12.5~15cm，推进速度为0.5~1.2ml/h，挥去六氟异丙醇，即得纳米胶原蛋白膜。本发明还公开了双层胶原蛋白膜的制备方法与制备得到的胶原蛋白膜及其用途。本发明胶原蛋白膜力学性能优良，无细胞毒性，溶血性和抗原性低，生物活性高。

Description

一种胶原蛋白膜的制备方法

技术领域

本发明涉及一种胶原蛋白膜的制备方法和用途。

背景技术

胶原是一种天然蛋白质，广泛存在于动物的皮肤、骨、软骨、牙齿、肌腱韧带和血管中，是结缔组织极重要的结构蛋白质，起着支撑器官、保护肌体的功能。胶原一般是白色透明、无分支的原纤维，主要存在于生皮中，其次存在于骨头中。胶原蛋白家庭包括19种胶原蛋白及10种以上胶原样蛋白，它们由三条左手螺旋的多肽链缠绕、右旋、形成绳索样右手超螺旋结构，其I级结构的共同特点为：每间隔两个氨基酸存在一个甘氨酸，Y—Gly—X-Y—序列中，X及Y位置分别为脯氨酸及羟脯氨酸，以限制多肽链旋转，三螺旋结构常有4-羟脯氨酸，产生氢键及氧桥，使结构相对牢固，通常还有球状序列插入，使胶原分子更有弹性。胶原具有很强的生物活性及生物功能，能参与细胞的迁移、分化和增殖，使骨、腰、软骨和皮肤具有一定的机械强度，胶原因其弱的抗原性和良好的生物相容性，在烧伤、创伤、眼角膜疾病、美容、矫形、硬组织修复、创面止血等医药卫生领域用途广泛。

胶原蛋白的制备方法众多，如，吹膜技术、冻干技术、电流体动力学技术等。随着纳米技术的迅速发展，采用电流体动力学(Electrohydrodynamics)射流技术成为研究热点之一，电流体动力学射流过程中，在喷头与接收装置之间建立一个高压静电场，当电场强度超过临界值时，喷头处流出的聚合物溶液或熔体在电场力作用下克服自身的表面张力形成一股带电喷射细流。由于静电排斥作用，带电细流发生高速弯曲或鞭动，随着溶剂挥发或熔体冷却，最终落在接收装置上形成纤维膜或粒子簇。根据产物形貌的区别，可将静电射流分为静电纺丝(简称电纺，Electrospinning)和静电喷雾(简称电喷，Electrospraying)两种形式。

Jamil A.Matthews et al.,“Electrospinning of Collagen Nanofibers”,Biomacromolecules,2002,3(2):232~238公开了一种利用静电纺丝制备胶原膜的方法：取I型胶原，采用六氟异丙醇溶解，得浓度为83mg/ml的胶原六氟异丙醇溶液；再取1ml玻璃注射器连接针头，并将其固定在微量注射泵上，将针头与高压直流电源相连，推进速度为5.0ml/h，取20(宽)×30（长）大小的铝箔固定在平板接收器，将其接地，设置其与针头的距离为12.5cm；设置电压为25.0KV，进行静电纺丝，制备得到了胶原蛋白膜。但是，该方法制备的胶原蛋白膜力学性能差，制备的胶原蛋白厚度仅为187μm，难以满足实际应用的需要。

很多研究者为提高胶原蛋白纤维的强度和模量，对胶原蛋白进行改性或加入其它材料，增加其力学性能，如在胶原的酸性溶液中加入了聚环氧乙烷（PEO），利用静电纺丝制备了胶原/PEO共混纳米纤维，纤维直径在100～150nm之间。由于PEO与胶原之间的相互作用，纤维具有较好的力学性能；然而引入其他高分子材料，使其在应用方面会有诸多限制，同时也大大降低了胶原膜使用的安全性；另外，申请号：200910209509.6，发明名称：“胶原超细纤维膜材料的制备方法”的专利申请文件中报道利用磷酸盐和无水乙醇混合液作为胶原电纺液，尽管从技术上能实现胶原的可纺性，但是后期不容易脱盐，不仅增加了生产成本，同时在应用方面也会受限。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种用静电纺丝技术制备纳米胶原蛋白膜的新方法，还提供了一种双层纳米胶原蛋白膜的制备方法，以及前述方法制备的胶原蛋白膜及其用途。

本发明纳米胶原蛋白膜的制备方法，包括如下步骤：

（1）取胶原蛋白溶于六氟异丙醇中，得80~120mg/ml胶原蛋白六氟异丙醇溶液；

（2）取步骤（1）的胶原蛋白六氟异丙醇溶液进行静电纺丝，电压为15~19KV，接收距离12.5~15cm，推进速度为0.5~1.2ml/h，挥去六氟异丙醇，即得纳米胶原蛋白膜。

优选地，步骤（1）所述胶原蛋白六氟异丙醇溶液的浓度为110mg/m；步骤（2）所述电压为16KV，接收距离12.5cm，推进速度为1.2ml/h。

进一步优选地，包括如下步骤：

（1）取胶原蛋白，加入六氟异丙醇，25℃搅拌至溶液澄清透明，配制浓度为110mg/ml的胶原蛋白六氟异丙醇溶液；

（2）取玻璃注射器分次吸取步骤（1）的胶原蛋白六氟异丙醇溶液，并将其固定在微量注射泵上，将针头与高压直流电源相连，推进速度为1.2ml/h，取铝箔固定在平板接收器，将其接地，设置其与针头的距离为12.5cm；设置电压为16.0KV，进行静电纺丝，在25℃真空干燥，将电纺膜从铝箔上取下，即得纳米胶原蛋白膜。

本发明双层胶原蛋白膜的制备方法，包括如下步骤：

①按照前述方法制备纳米胶原蛋白膜；

②取胶原蛋白，采用吹膜技术或者静电喷雾技术在步骤①的胶原蛋白膜表面制备另一层胶原蛋白膜，得双层胶原蛋白膜。

其中，所述静电喷雾技术包括如下步骤：

a、取胶原蛋白，溶于六氟异丙醇中，得50~120mg/ml胶原蛋白六氟异丙醇溶液；

b、取步骤a的胶原蛋白六氟异丙醇溶液进行静电喷雾，喷于步骤①的纳米胶原蛋白膜表面，电压为15~19KV，接收距离12.5~15cm，推进速度为0.5~1.2ml/h，挥去六氟异丙醇，即得双层胶原蛋白膜。

其中，步骤a所述胶原蛋白六氟异丙醇溶液的浓度为50mg/ml；步骤b所述电压为16KV，接收距离12.5cm，推进速度为1.2ml/h。

所述吹膜技术是制备胶原蛋白膜的常规技术，如张焰等，“重建胶原纤维对细胞的影响”，中国组织工程研究与临床修复，

12(41).8095-8098.2008公开的方法；也可以采用如下方法：

取胶原蛋白溶于六氟异丙醇中，得0.01-80mg/ml胶原蛋白六氟异丙醇溶液，置于前述方法制备的胶原蛋白膜表面，干燥，干燥温度为4℃~37℃，干燥时间为4~48h，即得双层胶原蛋白膜。优选地，胶原蛋白溶液的浓度为0.01-80mg/ml；干燥温度为20℃~26℃，干燥时间为8~24h。

其中，所述胶原蛋白是I型或III型胶原蛋白。

其中，所述胶原蛋白来源于天然活性胶原或重建活性胶原。

其中，所述胶原蛋白来源于水生物或其他哺乳类动物。

其中，所述胶原蛋白来源于牛或者猪。

本发明还提供了前述方法制备的胶原蛋白膜。

本发明还提供了上述的胶原蛋白膜在制备修复创面、止血的药物或保健品中的用途。

本发明还提供了上述的胶原蛋白膜在制备组织工程体内植入胶原膜中的用途。

本发明以六氟异丙醇为溶剂，通过对静电纺丝工艺的改进，制备得到单层纳米胶原蛋白膜和双层胶原蛋白膜，其力学性能显著优于现有胶原蛋白膜，厚度最高可达2000μm，是现有纳米胶原蛋白厚度的10.7倍，显著优于现有方法制备的纳米胶原蛋白膜，无细胞毒性，溶血性和抗原性低，能促进细胞增殖，可用于牙科、骨科、皮肤科等多个医学领域。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1胶原电纺膜照片

图2扫描电镜下的胶原纳米纤维

图3胶原电纺+电喷双层膜照片

图4细胞增殖试验结果

图5豚鼠致敏试验局部注射点

图6豚鼠致敏试验结果（生理盐水）

图7豚鼠致敏试验（实施例2胶原膜浸提液）

具体实施方式

静电纺丝设备：型号NS LAB200，市售。

静电喷雾设备：型号SS-1332Ucalery，市售。

实施例1本发明纳米胶原蛋白膜的制备方法

1、制备方法

（1）精确称量胶原海绵1.3531g，放入小烧杯中,吸取12.3ml六氟异丙醇溶液加入到小烧杯中，25℃在磁力搅拌器上搅拌约6小时至溶液澄清透明，配制浓度为110mg/ml的胶原六氟异丙醇溶液；

（2）取5ml玻璃注射器分次吸取12ml六氟异丙醇溶液，连接针头，并将其固定在微量注射泵上，将针头与高压直流电源相连，推进速度为1.2ml/h，取20(宽)×30（长）大小的铝箔固定在平板接收器，将其接地，设置其与针头的距离为12.5cm；设置电压为16.0KV，进行静电纺丝，在25℃真空干燥箱干燥2小时，将胶原纤维电纺膜从铝箔上取下，即得纳米胶原蛋白膜。

用千分尺测量所得胶原蛋白膜，厚度达到163μｍ；如图1所示，质地柔软，韧性好，易剪裁，能满足不同的临床需求；如图2所示，扫描电镜测定其纳米直径约为200nm。

本发明中的原料胶原蛋白来源较为广泛，可以来源于水生物或牛、猪等或其他哺乳类动物，也可以是重建胶原，其重建胶原是通过生物化学反应去掉两边端肽，重建纤维的可溶性胶原如ZL200810045663.1中提到的。

实施例2本发明双层胶原蛋白膜的制备方法

将实施例1所获得的纳米胶原电纺膜，固定在平板接收器上；

配置浓度为50mg/ml的胶原六氟异丙醇溶液，取5ml玻璃注射器分次吸取六氟异丙醇溶液胶原溶液，连接针头，并将其固定在微量注射泵上，将针头与高压直流电源相连，推进速度为1.2ml/h，取20(宽)×30（长）大小的铝箔固定在平板接收器，将其接地，设置其与针头的距离为12.5cm；设置电压为16.0KV，利用电喷工艺喷涂胶原六氟异丙醇溶液，使其在胶原电纺膜上形成一层纳米颗粒，在25℃真空干燥箱干燥2小时，即可；

在电镜下可见其胶原膜为双层膜，并且电喷形成的胶原颗粒填补了电纺形成的胶原膜空隙，减小了电纺胶原膜的孔隙率，使该双层胶原膜具有一面粗糙，一面光滑的效果，从而更有利于引导单侧细胞再生。

测定发现，该双层胶原膜厚度为164.5um。

实施例3本发明双层胶原蛋白膜的制备方法

将实施例1所获得的纳米胶原电纺膜，固定在平板接收器上；

配置浓度为80mg/ml的胶原六氟异丙醇溶液，取5ml玻璃注射器分次吸取六氟异丙醇溶液胶原溶液，连接针头，并将其固定在微量注射泵上，将针头与高压直流电源相连，推进速度为0.5ml/h，取20(宽)×30（长）大小的铝箔固定在平板接收器，将其接地，设置其与针头的距离为12.5cm；设置电压为15.0KV，利用电喷工艺喷涂胶原六氟异丙醇溶液，使其在胶原电纺膜上形成一层纳米颗粒，在25℃真空干燥箱干燥2小时，即可。

实施例4本发明双层胶原蛋白膜的制备方法

将实施例1所获得的纳米胶原电纺膜，固定在平板接收器上；

配置浓度为120mg/ml的胶原六氟异丙醇溶液，取5ml玻璃注射器分次吸取六氟异丙醇溶液胶原溶液，连接针头，并将其固定在微量注射泵上，将针头与高压直流电源相连，推进速度为0.8ml/h，取20(宽)×30（长）大小的铝箔固定在平板接收器，将其接地，设置其与针头的距离为15cm；设置电压为19.0KV，利用电喷工艺喷涂胶原六氟异丙醇溶液，使其在胶原电纺膜上形成一层纳米颗粒，在25℃真空干燥箱干燥2小时，即可。

实施例5本发明双层胶原蛋白膜的制备方法

将实施例1所获得的胶原蛋白膜，放置于洁净台上；

配置浓度为50mg/ml的胶原六氟异丙醇溶液，置于前述方法制备的胶原蛋白膜表面，干燥，干燥温度为4℃℃，干燥时间为48h，在胶原蛋白膜上形成一层胶原膜，挥干六氟异丙醇，形成胶原双层膜。

测定发现，该双层胶原膜厚度为230um。

实施例6本发明单层纳米胶原蛋白膜制备方法的参数筛选试验

1、实验方法

按照实施例1所述方法制备胶原蛋白膜，其中，胶原蛋白六氟异丙醇溶液浓度、静电纺丝方法的电压、接收距离和推进速度如表1所示：

表1参数筛选

2、实验结果

由表1可以看出，在本发明工艺范围内，即胶原浓度为80~120mg/ml，静电纺丝电压为15~19KV，接收距离12.5~15cm，推进速度为0.5~1.2ml/h，可以制备得到胶原蛋白膜，在本发明参数范围外，不能制备得到胶原蛋白膜。

以下以实验例的方式说明本发明的有益效果：

实验例1本发明方法与现有方法制备的胶原蛋白膜的力学性能对比

本发明胶原蛋白膜：按照实施例1、2、5的方法制备；

现有胶原蛋白膜：按照Jamil A.Matthews et al.,“Electrospinning ofCollagen Nanofibers”,Biomacromolecules,2002,3(2):232~238的方法（对比实验例）制备。

（1）取胶原蛋白膜制成长度为25mm、宽度为10mm的试样，在万能材料试验机（AG-5000G，Shimadzu，Japan）上测定其拉伸性能，测定方法参考GB/T1040.1和GB/T1040.3，其中试验机的拉伸速度为10mm/min。

（2）将本发明胶原蛋白膜和Bio-Gide的膜分别制成长度为20mm，宽度为10mm的试样，在距离试样上边缘2mm处用5-0尼龙线穿过试样，在万能材料试验机上测定试样的缝合强度。

试验结果如表2所示：

表2本发明胶原蛋白膜和Bio-Gide膜的拉伸强度和缝合强度

由表2可以看出，本发明单层纳米胶原蛋白膜（实施例1）的拉伸强度和缝合强度显著优于现有单层纳米胶原蛋白膜，力学性能优良。

在单层纳米胶原蛋白膜表面附加一层胶原蛋白膜制得的双层胶原蛋白膜（实施例2和实施例5）力学性能也显著优于现有市售双层胶原蛋白膜Bio-Gide，且与单层纳米胶原蛋白膜相当，性能也非常优良。

实验例2本发明方法与现有方法制备的胶原蛋白膜的厚度对比

本发明方法：按照实施例1的方法，取20ml、40ml、80ml、100ml、200ml和240ml胶原蛋白六氟异丙醇制备胶原蛋白膜。

现有技术的方法：按照Jamil A.Matthews et al.,“Electrospinning ofCollagen Nanofibers”,Biomacromolecules,2002,3(2):232~238的方法制备。

实验结果：

表3本发明纳米胶原蛋白膜厚度

由表3可以看出，本发明胶原蛋白的厚度可大可小，最后可达2000μm，而现有技术的方法只能制备得到187μm的胶原蛋白，本发明胶原蛋白膜厚度是现有胶原蛋白膜的10.7倍，优势显著。

实验例3生物学性能检测

1、溶血试验

实验组：实施例1，2，5制备的胶原蛋白膜剪裁为12mm×12mm的小片，加入2.25ml生理盐水浸泡；

阳性对照：2.25ml生理盐水；

阴性对照：2.25ml蒸馏水。

按照GBT16886.4-2003医疗器械生物学评价第4部分与血液相互作用试验选择进行，在耳缘静脉抽取兔血5ml，立即加入到含有0.5ml抗凝剂的干净容器中，混合抗凝。然后,加入生理盐水5ml，稀释备用。

将全部样品装入试管中，加入37℃水浴中预温30min后取出，各加稀释的抗凝兔血0.045ml，再放入37℃水浴中继续保温60min，将各管的溶液离心5min(1000r/min>，自每管取上清液在分光光度仪上，波长545nm，测取各自的光密度(OD)值，按照溶血率=（试验材料组吸光度-阴性对照组吸光度）／（阳性对照组吸光度一阴性对照组吸光度）×100%计算，其结果如下：

表4溶血试验结果

实施例1	实施例2	实施例3	阳性对照	阴性对照
					1.385%	1.191%	1.576%	100%	0%

由上述结果可见：实施例1,2,3溶血率均小于2%低于标准值5%，其三种胶原膜均符合安全要求。

2、MC3T3-E1细胞增殖试验

实验组：实施例1，2制备的胶原蛋白膜剪裁为12mm×12mm的小片，加入2.25ml生理盐水浸泡；

对照：Bio-gid膜。

取第五代MC3T3-E1细胞离心后制成细胞密度为1*10⁶/ml的细胞悬液，分别吸取100ul细胞悬液接种于上述样品的24孔板的实验组中，37℃孵育使细胞粘附，4h后加入a-MEM完全培养基500μl，每天换液体，并在2、4、6、8和10天时进行CCK-8增殖试验检测细胞数量和活性，利用SPSS软件分析方差，绘制细胞增殖曲线。

结果如图4所示，实验组1，2与BIa-gid膜与细胞组相比均能有效的促使细胞增殖（P<0.05）,实验组1，2与BIa-gid相比，其促进细胞增殖效果更好；同时观察实验组2胶原膜电喷层细胞粘附少，且膜内部通过显微镜观察基本无细胞存在，而Bia-gid致密面细胞粘附也较少，但是该组内部有少量的细胞可见，由此可以看出实验组2电喷面能较Bia-gid致密面更为有效的防止细胞的进入。

实验结果说明，本发明胶原蛋白膜能有效促进细胞增殖。

3、细胞毒性实验MTT法

实验组：实施例1，2，5制备的胶原蛋白膜剪裁为12mm×12mm的小片，加入10生理盐水浸泡24小时，去浸提液备用。

阳性对照：8%苯酚

阴性对照：PBS

参照细胞培养手册培养L929细胞，并按照MTT操作方法按1x104细胞铺在96孔板内培养过夜，次日，吸净培养基后，加入100ul如上试验样品，设置实验组、阳性对照组，阴性对照组，孵育48小时测定细胞数，按照细胞毒性=（实验组-阴性组）/（阳性组-阴性组）×100%试验结果如下：

表5细胞毒性试验结果

	阴性	阳性	实验组1	实验组2	实验组3
						细胞毒性	100%	0%	99.8%	100.5%	99.2%

由表5可以看出，实验组1,2,3细胞毒性均在0级（》=80%），表明本发明胶原蛋白膜无细胞毒性。

4、豚鼠致敏试验

实验组：实施例2制备的胶原蛋白膜胶采用生理盐水浸提比例为6cm²/ml，于37℃恒温浸提72小时；

阴性对照：生理盐水；

皮内诱导阶段

豚鼠侧腹部剃毛，分别取0.5ml弗氏完全佐剂和0.5ml生理盐水混合、1ml浸提液、0.5ml弗氏完全佐剂和0.5ml浸提液，混合用去掉针头的注射器反复吹打直至混合均匀。在每只豚鼠皮下注射3针样品。从头部向尾部依次为：A弗氏完全佐剂与生理盐水混合液、B样品浸提液、C弗氏完全佐剂与浸提液混合液，注射完毕后小鼠饲养备用。如图5所示A BC是个局部注射点。

局部诱导阶段

七天后局部诱导，可以看到注射过弗氏完全佐剂的注射孔均出现伤疤。证明弗氏完全佐剂确实成功引起肌体炎症反应。采用面积约8cm²的滤纸（采用皮内诱导阶段使用的注射液浸泡的虑纸）局部贴敷于侧腹部位，覆盖诱导注射点。

激发阶段

15天以后，在豚鼠背部清理出一块约4cm²的区域用于敷贴激发，将滤纸片置于试验样品或介质对照中浸透，局部贴敷于背部剃毛区域。用封闭式包扎带固定，并于24h后除去包扎带和实验组胶原膜浸提液敷贴片，生理盐水敷贴片。

观察阶段

除去敷贴片后24h和48h观察试验组和对照组动物激发部位皮肤情况。

实验结果如图6~7所示，所有实验组动物的背部剃毛激发区域均无明显改变，证明本发明胶原蛋白膜无致敏反应。

综上，本发明方法制得的胶原蛋白膜力学性能和厚度均显著优于现有胶原蛋白膜，无细胞毒性，溶血性和抗原性低，能促进细胞增殖，制备方法简便，成本低廉，具有良好的临床应用前景。

Claims

1.一种纳米胶原蛋白膜的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）取胶原蛋白溶于六氟异丙醇中，制得80~120mg/ml胶原蛋白六氟异丙醇溶液；

（2）用步骤（1）的胶原蛋白六氟异丙醇溶液进行静电纺丝，电压为15~19KV，接收距离为12.5~15cm，推进速度为0.5~1.2ml/h，挥去六氟异丙醇，即得纳米胶原蛋白膜。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

步骤（1）所述胶原蛋白六氟异丙醇溶液的浓度为110mg/ml；

步骤（2）所述电压为16KV，接收距离12.5cm，推进速度为1.2ml/h。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）取胶原蛋白，加入六氟异丙醇中，25℃搅拌至溶液澄清透明，配制浓度为110mg/ml的胶原蛋白六氟异丙醇溶液；

（2）用玻璃注射器分次吸取步骤（1）的胶原蛋白六氟异丙醇溶液，并将其固定在微量注射泵上，将针头与高压直流电源相连，推进速度为1.2ml/h，取铝箔固定在平板接收器，将其接地，设置其与针头的距离为12.5cm；设置电压为16.0KV，进行静电纺丝，在25℃真空干燥，将电纺膜从铝箔上取下，即得纳米胶原蛋白膜。

4.一种双层胶原蛋白膜的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

①按照权利要求1~3任意一项所述方法制备纳米胶原蛋白膜；

②取胶原蛋白，采用吹膜技术或者静电喷雾技术在步骤①的纳米胶原蛋白膜表面制备另一层胶原蛋白膜，得双层胶原蛋白膜。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述静电喷雾技术包括如下步骤：

a、取胶原蛋白溶于六氟异丙醇中，制得50~120mg/ml胶原蛋白六氟异丙醇溶液；

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：

步骤a所述胶原蛋白六氟异丙醇溶液的浓度为50mg/ml；

步骤b所述电压为16KV，接收距离12.5cm，推进速度为1.2ml/h。

7.根据权利要求1~6任意一项所述的方法，其特征在于：

所述胶原蛋白是I型或III型胶原蛋白；

所述胶原蛋白来源于天然活性胶原或重建活性胶原；

所述胶原蛋白来源于水生物或其他哺乳类动物。

8.根据权利要求7所述的纳米胶原蛋白膜，其特征在于：所述胶原蛋白来源于牛或者猪。

9.权利要求1~8任意一项方法制备的胶原蛋白膜。

10.权利要求9所述的胶原蛋白膜在制备修复创面、止血的药物或保健品中的用途。

11.权利要求9所述的胶原蛋白膜在制备组织工程体内植入胶原膜中的用途。