CN101693123A - 含有不同细胞外基质的复合结构组织工程支架的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属高分子材料技术领域和生物医学工程技术领域，具体涉及一种含有不同细胞外基质的复合结构组织工程支架的构建方法。本发明通过静电纺丝法制备血管支架；通过热压-盐析法，采用聚乳酸和聚己内酯的共混物制备多孔支架部分，并将血管支架引入至多孔支架中。本发明构建的复合结构的组织工程支架实现了在同一支架中构建不同细胞外基质。

Description

含有不同细胞外基质的复合结构组织工程支架的构建方法
技术领域
本发明属高分子材料技术领域和生物医学工程技术领域，具体涉及一种含有不同细胞外基质的复合结构组织工程支架的构建方法。
背景技术
全球每年都有大量的患有骨缺损、骨肿瘤、骨髓炎等疾病的患者等待治疗。目前多采用自体骨移植和异体骨移植等方法，然而这些方法均有明显的不足。组织工程及组织工程骨概念的提出提供了一种骨疾病治疗的选择方案。体外构建理想的组织工程骨一直是组织工程领域研究的热点，目前已取得很大的进展；同时，组织工程骨对骨缺损的修复也得到了肯定，一些关键技术逐步得到解决。但是，组织工程骨血管化一直是制约大块组织工程骨的构建的关键问题。
组织工程材料的血管化包括微观血管网的建立和宏观血循环的建立。理想的血供应由一条内径大于1mm的主干动、静脉提供，这样才能有充足的养分和营养物质供给。由于细胞只有在200μm之内才能通过血液弥散得以存活，所以如果不能建立固有血循环，组织工程组织的制作只能被限制在薄、小的程度，难以实现大块组织工程骨的构建。
基于以上内容，本发明提供一种构建含有不同细胞外基质的复合支架的新方法，包括综合应用静电纺丝及热压-盐析制备包含血管支架的复合结构的组织工程支架，在同一支架中构建不同结构形态的细胞外基质，以期实现大块骨组织以及血管化、神经化肌肉、肝脏等组织工程的建立。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含有不同细胞外基质的复合结构组织工程支架的构建方法。
本发明构建的复合结构组织工程支架，包含通过静电纺丝所制备的血管支架以及孔径分布在300～340μm的多孔支架，不仅可为组织工程血管化提供新途径，同时也为组织工程的神经化提供了参考，可用于大块骨组织、人工肝脏、人工肌肉等的构建中。
本发明采用热压-盐析法制备组织工程支架，将可完全生物降解的熔点相对较高的聚乳酸和熔点相对较低的聚己内酯以一定比例混合，在无溶剂下，将加工温度从聚乳酸的熔点降低到聚己内酯熔点附近，这对保持血管支架的结构和形状意义重大。聚乳酸和聚己内酯可完全降解，最终降解产物为二氧化碳和水，可随新陈代谢排出体外，无需二次手术取出。
本发明提出的含有不同细胞外基质的复合结构组织工程支架的构建方法，采用静电纺丝制备血管支架，其结构如图1所示，该装置由计量泵1、高压发生器和马达2以及管状接收装置3构成，计量泵1用于确定静电纺丝溶液的流速，高压发生器和马达2用于产生电压，并且带动接收装置3旋转，管状接收装置3用于血管支架的接收；具体步骤如下：
(1)将聚合物溶于溶剂中，磁力搅拌溶解，溶液浓度8％～15％(g/ml)，将聚合物溶液在电压为8-20KV，电纺距离为8-20cm，流速为0.1-5ml/h的条件下进行静电纺丝，采用可在马达带动下进行转动的金属棒作为管状接收装置制备血管支架，金属棒直径为0.5～2mm；
(2)将步骤(1)中制备的血管支架从金属棒上脱下，真空干燥，采用直径比金属棒小0.1～0.2mm的棒穿入血管支架中支撑血管支架，以保证在热压过程中血管支架能保持其管状结构；
(3)用标准筛筛取粒径为224～300μm的氯化钠作为致孔剂；
(4)称取聚乳酸和聚己内酯溶解于可以溶解聚合物但不能溶解致孔剂、易挥发的溶剂，磁力搅拌使聚合物溶解，得到聚合物溶液；
(5)将步骤(3)所得致孔剂加入到步骤(4)所得的聚合物溶液中，用玻璃棒搅拌使致孔剂均匀分散在聚合物溶液中，形成含有致孔剂的具有一定流动性的糊状混合物；
(6)将步骤(5)所得糊状混合物分别倒入培养皿中，溶剂挥发后得到含有致孔剂的聚合物膜，所得聚合物膜放入真空烘箱中干燥，取出剪成适当大小；
(7)将步骤(6)中所得的聚合物膜铺于模具底层，将步骤(2)中做的穿有支撑棒的血管支架放入在底层已铺聚合物膜的模具中，然后再在模具中铺入步骤(6)中所得的聚合物膜；
(8)将模具放入热压机中热压，控制压力为6～10MPa，温度为60～80℃，热压时间为2.5～4min；
(9)将热压后的支架从模具中取出，放入到可以溶解致孔剂但是不能溶解聚合物的溶剂中洗盐，每2～4小时更换一次溶剂，用硝酸银溶液检测无白色沉淀产生后，将血管支架的支撑棒取出，干燥支架。
本发明中，步骤(1)中所述聚合物可以为聚乳酸、聚乳酸-己内酯共聚物以及聚乳酸、聚乳酸-己内酯共聚物与胶原、明胶的共混物；步骤(1)中所采用溶剂可以为六氟异丙醇或氯仿。
本发明中，步骤(2)中支撑棒可以为不锈钢棒或不锈钢针管等强度较高、在洗盐过程中不会生锈的棒状材料。
本发明中，步骤(4)中所述溶剂为三氯甲烷或二氯甲烷等中任一种，三氯甲烷或二氯甲烷是可以溶解聚合物但是不能溶解致孔剂的溶剂。
本发明中，步骤(9)中所述溶剂为去离子水。
利用本发明方法制备得到的复合结构组织工程支架，不仅为组织工程的血管化提供了新的参考，为大块骨的构建提供了可能，还在于它的应用前景不局限于骨组织的构建，还可用于肌肉、肝脏等软组织的构建；其不仅可用于组织工程的血管化，还为组织工程的神经化提供了新途径。
本发明具有以下特点：
1、在同一支架中构建了含有静电纺丝制备的血管支架和多孔支架，实现了在同一支架中构建不同细胞外基质的复合结构支架的构建。
2、采用热压-盐析法制备复合结构组织工程支架，通过高熔点聚合物与低熔点聚合物的混合，在获得高熔点聚合物的性能的同时，将热压温度降低到低熔点聚合物附近。
3、该复合结构的组织工程支架，不仅可以用于组织工程的血管化，还可以用于组织工程的神经化，可广泛应用在骨、肌肉、肝脏等组织中。
附图说明
图1为静电纺丝制备血管支架示意图。
图2为复合结构组织工程支架表面环境扫描电镜照片。
图1中标号：1为计量泵，2为高压发生器和马达，3为管状接收装置。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明的实施方式，但本发明并不限于这些实例。
实施例1
a.聚乳酸溶于氯仿中，浓度8％(g/ml)，用静电纺丝技术制备血管支架。电纺电压为20KV，电纺距离12cm，流速0.1ml/h，接收金属棒直径1mm。
b.将血管支架从金属棒上脱下，真空干燥。采用直径为0.8mm的不锈钢金属棒穿入血管支架中。
c.用标准筛筛取27g粒径为224～300μm的氯化钠作为致孔剂。
d.按质量比为7∶3称取聚乳酸和聚己内酯共3g溶解于40ml三氯甲烷中，磁力搅拌溶解。
e.将步骤c所得致孔剂加入到步骤d所得的聚合物溶液中，用玻璃棒搅拌使致孔剂均匀分散在聚合物溶液中，形成含有致孔剂的具有一定流动性的糊状混合物。
f.将步骤e所得糊状混合物分别倒入培养皿中，溶剂挥发后得到含有致孔剂的聚合物膜，所得聚合物膜放入真空烘箱中干燥，取出剪成5*5mm大小方块。
g.实验采用6×6×0.2cm的方形不锈钢模具。将步骤f中所得的聚合物膜铺于模具底层，将步骤b中做的穿有支撑棒的血管支架放入在底层已铺聚合物膜的模具中，然后再在模具中铺入步骤f中所得的聚合物膜。
h.将模具放入热压机中热压，压力6～10MPa，温度60～80℃，热压时间2.5～4min。
i.将热压后的支架从模具中取出，放入到去离子水中洗盐。每2～4小时更换一次溶剂，用硝酸银溶液检测无白色沉淀产生后，将血管支架的支撑棒取出，干燥支架。
从图2中可以看出，通过该构建方法，含有血管支架和多孔支架两种细胞外基质的复合结构支架已成功制备。图中管状物为静电纺丝制备的血管支架，血管支架四周为多孔支架，支架下面为环境扫描电镜样品台。
实施例2
a.聚乳酸-己内酯共聚物、明胶共同溶于氯仿中，浓度分别为8％、2％(g/ml)，用静电纺丝技术制备血管支架。电纺电压为20KV，电纺距离12cm，流速0.1ml/h，接收金属棒直径0.8mm。
b.将血管支架从金属棒上脱下，真空干燥。采用直径为0.6mm的不锈钢金属棒穿入血管支架中。
c.用标准筛筛取27g粒径为224～300μm的氯化钠作为致孔剂。
d.按质量比为6∶4称取聚乳酸和聚己内酯共3g溶解于40ml三氯甲烷中，磁力搅拌溶解。
e.将步骤c所得致孔剂加入到步骤d所得的聚合物溶液中，用玻璃棒搅拌使致孔剂均匀分散在聚合物溶液中，形成含有致孔剂的具有一定流动性的糊状混合物。
f.将步骤e所得糊状混合物分别倒入培养皿中，溶剂挥发后得到含有致孔剂的聚合物膜，所得聚合物膜放入真空烘箱中干燥，取出剪成5*5mm大小方块。
g.实验采用6×6×0.2cm的方形不锈钢模具。将步骤f中所得的聚合物膜铺于模具底层，将步骤b中做的穿有支撑棒的血管支架放入在底层已铺聚合物膜的模具中，然后再在模具中铺入步骤f中所得的聚合物膜。
h.将模具放入热压机中热压，压力6～10MPa，温度60～80℃，热压时间2.5～4min。
i.将热压后的支架从模具中取出，放入到去离子水中洗盐。每2～4小时更换一次溶剂，用硝酸银溶液检测无白色沉淀产生后，将血管支架的支撑棒取出，干燥支架。
实施例3
a.聚乳酸、胶原共同溶于六氟异丙醇中，浓度分别为8％、0.5％(g/ml)，用静电纺丝技术制备胶原血管支架。电纺电压为20KV，电纺距离12cm，流速0.1ml/h，接收金属棒直径1.5mm。
b.将血管支架从金属棒上脱下，真空干燥。采用直径为1.3mm的不锈钢金属棒穿入血管支架中。
c.用标准筛筛取27g粒径为224～300μm的氯化钠作为致孔剂。
d.按质量比为8∶2称取聚乳酸和聚己内酯共3g溶解于40ml三氯甲烷中，磁力搅拌溶解。
e.将步骤c所得致孔剂加入到步骤d所得的聚合物溶液中，用玻璃棒搅拌使致孔剂均匀分散在聚合物溶液中，形成含有致孔剂的具有一定流动性的糊状混合物。
f.将步骤e所得糊状混合物分别倒入培养皿中，溶剂挥发后得到含有致孔剂的聚合物膜，所得聚合物膜放入真空烘箱中干燥，取出剪成5*5mm大小方块。
g.实验采用6×6×0.2cm的方形不锈钢模具。将步骤f中所得的聚合物膜铺于模具底层，将步骤b中做的穿有支撑棒的血管支架放入在底层已铺聚合物膜的模具中，然后再在模具中铺入步骤f中所得的聚合物膜。
h.将模具放入热压机中热压，压力6～10MPa，温度60～80℃，热压时间2.5～4min。
i.将热压后的支架从模具中取出，放入到去离子水中洗盐。每2～4小时更换一次溶剂，用硝酸银溶液检测无白色沉淀产生后，将血管支架的支撑棒取出，干燥支架。

Claims (6)

1.一种含有不同细胞外基质的复合结构组织工程支架的构建方法，其特征在于采用静电纺丝制备血管支架，该装置由计量泵(1)、高压发生器和马达(2)以及管状接收装置(3)构成，计量泵(1)用于确定静电纺丝溶液的流速，高压发生器和马达(2)用于产生电压，并且带动接收装置(3)旋转，管状接收装置(3)用于血管支架的接收；具体步骤如下：
(1)将聚合物溶于溶剂中，磁力搅拌溶解，溶液浓度8％～15％(g/ml)，将聚合物溶液在电压为8-20KV，电纺距离为8-20cm，流速为0.1-5ml/h的条件下进行静电纺丝，采用可在马达带动下进行转动的金属棒作为管状接收装置制备血管支架，金属棒直径为0.5～2mm；
(2)将步骤(1)中制备的血管支架从金属棒上脱下，真空干燥，采用直径比金属棒小0.1～0.2mm的棒穿入血管支架中支撑血管支架，以保证在热压过程中血管支架能保持其管状结构；
(3)用标准筛筛取粒径为224～300μm的氯化钠作为致孔剂；
(4)称取聚乳酸和聚己内酯溶解于可以溶解聚合物但不能溶解致孔剂、易挥发的溶剂，磁力搅拌使聚合物溶解，得到聚合物溶液；
(5)将步骤(3)所得致孔剂加入到步骤(4)所得的聚合物溶液中，用玻璃棒搅拌使致孔剂均匀分散在聚合物溶液中，形成含有致孔剂的具有一定流动性的糊状混合物；
(6)将步骤(5)所得糊状混合物分别倒入培养皿中，溶剂挥发后得到含有致孔剂的聚合物膜，所得聚合物膜放入真空烘箱中干燥，取出剪成适当大小；
(7)将步骤(6)中所得的聚合物膜铺于模具底层，将步骤(2)中做的穿有支撑棒的血管支架放入在底层已铺聚合物膜的模具中，然后再在模具中铺入步骤(6)中所得的聚合物膜；
(8)将模具放入热压机中热压，控制压力为6～10MPa，温度为60～80℃，热压时间为2.5～4min；
(9)将热压后的支架从模具中取出，放入到可以溶解致孔剂但是不能溶解聚合物的溶剂中洗盐，每2～4小时更换一次溶剂，用硝酸银溶液检测无白色沉淀产生后，将血管支架的支撑棒取出，干燥支架。
2.根据权利要求1所述的含有不同细胞外基质的复合结构组织工程支架的构建方法，其特征在于步骤(1)中所述聚合物可以为聚乳酸、聚乳酸-己内酯共聚物以及聚乳酸、聚乳酸-己内酯共聚物与胶原、明胶的共混物；步骤(1)中所采用溶剂可以为六氟异丙醇或氯仿。
3.根据权利要求1所述的含有不同细胞外基质的复合结构组织工程支架的构建方法，其特征在于步骤(2)中支撑棒为不锈钢棒或不锈钢针管。
4.根据权利要求1所述的含有不同细胞外基质的复合结构组织工程支架的构建方法，其特征在于步骤(4)中所述溶剂为三氯甲烷或二氯甲烷中任一种。
5.根据权利要求1所述的含有不同细胞外基质的复合结构组织工程支架的构建方法，其特征在于步骤(4)中采用聚乳酸与聚己内酯的共混物，将热压温度从聚乳酸的熔点降到聚己内酯熔点附近。
6.一种如权利要求1所述制备方法得到的复合结构组织工程支架，在组织工程的血管化、神经化，大块骨等骨组织的构建、肌肉、肝脏软组织的构建方面的应用。
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