CN104117098B - 一种具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/高分子三维多孔支架材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/高分子三维多孔支架及其制备方法。该支架材料含有相互贯通的三维多孔结构，孔径为60～400μm、孔隙率为30％～90％，并具备磁场强度可调的取向磁场。本发明的制备方法包含以下步骤：首先，生物活性高分子材料溶于溶剂中，配置成高分子溶液；然后，将永磁铁氧体粉末和羟基磷灰石粉末置于高分子溶液中，搅拌均匀，并将混合液转入模具中，在外加磁场下冷冻干燥成型；最后，经过溶液浸泡、切割和充磁，得到三维多孔支架。本发明方法简单，操作方便，重复率高，合成三维多孔支架具备通透性好、孔隙率较高、以及良好的生物相容性、骨传导性和骨诱导性，在骨修复材料领域具有广阔的应用前景。

Description

一种具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/高分子三维多孔支架材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医用材料领域的人工骨修复材料的制备技术，具体为一种具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/高分子三维多孔支架材料及其制备方法。

背景技术

创伤、骨髓炎、骨肿瘤、骨囊肿等手术切除引起的大段骨缺损，严重影响了人体骨组织的生理功能，是目前骨科临床最常见、最棘手的问题之一。当前对于合适的骨替代物的需求正与日俱增，骨修复再生材料及其相关医疗领域在全球市场从2000年的200亿美元上升至2011年的600亿美元，并逐年增加。自体骨是骨缺损治疗的金标准，具有良好的组织相容性、骨诱导和骨传导性能，但是容易出现供骨区疼痛、感染、创伤增加，获取量受限制。异体骨移植存在免疫排斥反应，并且可能携带有潜在的病原体，如HIV病毒、肝炎病毒等。设计和开发新型人工骨修复材料具有重要的应用价值和社会意义。

骨修复材料的生物学性能不仅与化学组成有关，而且还取决于孔结构、孔径大小和孔隙率。研究表明，相互贯通的大孔结构有利于骨细胞及骨组织的生长，以及营养物质的输送。当孔径小于5μm时，无骨组织长入多孔支架中；当孔径大于25μm时，纤维管状组织开始渗透到多孔支架中；当孔径大于50μm时，可以观察到组织矿化；当孔径大于75μm时，矿化组织会深入到孔深处500μm；当孔径大于100μm时，生物骨矿化深入到孔深1000μm处，骨被确认重建。孔隙率在40wt％～60wt％及以上，力学性能在10MPa或更高比较有利于密质组织生长。

自然骨是复杂的生物矿化系统之一，无机成分主要是羟基磷灰石，约占总质量的65％；有机成分主要是I型胶原纤维，约占总质量的34％，其余为水。羟基磷灰石属于P6₃/m空间群，具有优良的生物活性、生物相容性和生物降解性等优点，在骨修复、药物载体等领域中具有广阔的应用前景。植入体内后，羟基磷灰石能在短时间内与人体的软硬组织形成紧密结合。然而，单纯的羟基磷灰石多孔支架的力学强度低、脆性大，不适用于承重部位的骨缺损修复。模仿自然骨的化学组成和孔结构制备羟基磷灰石/高分子多孔支架。羟基磷灰石多孔支架中填充壳聚糖、胶原蛋白、胶原蛋白及聚乳酸等生物活性高分子材料不仅可以提高生物学性能，而且还可以改善力学性能。

羟基磷灰石/高分子复合多孔支架材料虽然具有良好的生物相容性、生物活性和骨引导性，但是缺乏骨诱导性。最新研究发现：外加强磁场能够对周围组织产生力的作用，从而促进骨生长。然而，外加磁场需要大型设备，不适合直接应用于临床。在骨修复材料中填充磁性粉末构建出磁性生物骨修复材料将是一种可行途径。最近，王德平等(专利号200810041740)通过静电自组装和毛细作用将以有序排布的SiO₂为模板制备的有序多孔羟基磷灰石与液相法合成的磁性纳米粒子结合形成具有核壳结构的有序多孔磁性羟基磷灰石；龚继来等(专利号200910310387)以纳米羟基磷灰石Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂为基体和在基体中均匀分散磁性粉末Fe₂O₃，制备出磁性纳米羟基磷灰石材料；许海燕等(专利号200910211585)以一种高分子材料为模板，表面均匀包覆羟基磷灰石及Fe₂O₃磁性颗粒制备出磁性复合骨修复材料；张志琪等(专利号201110199551)以溶剂浇注-粒子沥滤技术为基础，结合挤压法，采用粒径均一、表面多孔的高纯度SiO₂微球为致孔剂，通过改变SiO₂微球的尺寸来调节多孔支架材料的孔隙大小，制备出不同孔径的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架；魏坤等(专利号201210034763)以PLGA和壳聚糖为混合支架，羟基磷灰石为骨修复材料填充物，通过冷冻干燥法制备了羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖三维多孔支架。但是，上述磁性骨修复材料不具备大孔结构，而且使用的主要是Fe₂O₃、Fe₃O₄等弱磁性材料，磁性骨修复材料不具有取向磁场或者弱磁性，因此骨诱导性不理想。

本发明以M型永磁铁氧体粉末作为磁源，采用冷冻干燥法制备出具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/高分子三维多孔支架。该材料不仅具有良好的生物活性、生物相容性、骨引导性，而且还具有优良的骨诱导性能。本发明制备的具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/高分子三维多孔支架材料在人工骨修复领域具有重要的临床应用价值和社会效益。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/高分子三维多孔支架材料。该材料不仅拥有三维贯通的大孔结构并促进细胞黏附和骨组织生长，而且多孔支架中取向排列的M型永磁铁氧体产生磁场，并显著提高生物活性和骨诱导性。

本发明的另一个目的是提供上述具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/高分子三维多孔支架材料的制备方法，该制备工艺不仅简单而且制备周期短，生产成本低。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明以良好生物活性的高分子为支架材料和以良好磁性能的永磁性铁氧体及羟基磷灰石为骨修复填充材料制备而成，其制备过程包括以下三个步骤：(1)配置生物活性高分子溶液；(2)将永磁铁氧体粉末和羟基磷灰石粉末置于高分子溶液中，搅拌均匀，并将混合液转入模具中，在外加磁场作用下冷冻干燥成型；(3)经过溶液浸泡、切割和充磁，得到具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/高分子三维多孔支架。

实施的具体技术方案如下：

步骤一：将生物活性高分子材料溶解到去离子水、乙酸、乙醇、丙酮、甲苯、乙醚等一种或者一种以上的溶剂中，得到高分子溶液；

步骤二：按照质量比为30:1～1:200的M型永磁铁氧体粉末与羟基磷灰石粉末置于高分子溶液中，混合均匀后置于模具中，先在磁场下冷冻，然后冷冻干燥成型即可得到磁性羟基磷灰石/高分子三维多孔支架；

步骤三：磁性羟基磷灰石/高分子三维多孔支架依次经过溶液浸泡、清洗、切割和充磁后，最终得到具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/高分子三维多孔支架材料。

所述材料是一种具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/高分子三维多孔支架材料，其特征在于，所述材料主要包含生物活性高分子、永磁铁氧体和羟基磷灰石，具有三维贯通的孔结构，孔径为60～400μm，孔隙率为30～90％，而且具有磁场强度可调的取向磁场，其表观磁场强度为0.5～200mT。

所述材料中的生物活性高分子材料包括天然高分子材料和人工合成高分子材料，具体可以为壳聚糖、胶原蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚羟基丁酸酯、聚乳酸、聚己内酯等，优选壳聚糖、胶原蛋白、聚乳酸等。步骤一所述的高分子浓度为0.001M～饱和浓度。

所述材料中的磁性粉末为M型永磁性铁氧体，并具有以下特征的分子式：R_xFe_nM_zO₁₉，其中，R为Ca、Ba、Sr、La、Nd、Bi，且必须含有Ca、Sr、Ba中的至少一种；M为Co、Ni、Zn；x、n、z表示摩尔比，并且x为0.7～1.3，n为8.0～13.0，z为0～0.5。

所述材料合成步骤二中磁场强度为100～10000Gs，可以为均匀磁场、非均匀磁场；磁场下冷冻时间为30min～48h，冷冻温度为-80～0℃。

所述材料合成步骤二所述的冷冻干燥成型，冷冻干燥温度为-80～0℃，冷冻干燥时间为16h～7天。

所述材料合成步骤三所述溶液浸泡使用的溶液为碱性溶液或戊二醛，碱性溶液包括NaOH、KOH、Na₂CO₃等，浓度为0.001M～饱和浓度，戊二醛浓度为0.02～20wt/v％，浸泡时间为30min～3天。

所述材料合成步骤三所述的充磁，其磁场强度为4000～14000Gs。

本发明提供的优点如下：(1)具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/高分子三维多孔支架材料该材料结合了生物活性高分子、M型永磁铁氧体和羟基磷灰石三者的优势，同时具有良好的力学性能、生物活性、生物相容性和骨传导性；(2)该材料拥有取向磁场，能够显著提高骨诱导性，促进新骨的形成；(3)该材料具有相互贯通的三维多孔结构，孔径为60～400μm，能够促进骨细胞和组织长入骨支架材料中，提高骨整合性能；(4)本发明的制备工艺简单、成本投入低、可操作性强、重复率高、周期短，几乎无废弃物产生，是一种既经济又具有环境友好型的合成方法。

附图说明

图1为实施例1中具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架的SEM图。

图2为实施例1中多孔支架中羟基磷灰石粉末的XRD图。

图3为实施例1中多孔支架粉末的FTIR图。

图4为实施例1中M型铁氧体及磁性羟基磷灰石的磁滞回线：其中，(a)M型铁氧体和(b)磁性羟基磷灰石。

图5为实施例2中具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架SBF中浸泡2天后的SEM图。

图6为实施例3中具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架的细胞增殖图。

图7为实施例4中具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架的SEM图。

图8为实施例5中具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架的SEM图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

实施例1

(1)壳聚糖溶液的制备：1g壳聚糖溶解于25mL乙酸溶液(2vol％)中，磁力搅拌12h至完全溶解，超声1h去除气泡；

(2)称取4.5g羟基磷灰石与4.5gM型铁氧体(SrFe₁₂O₁₉)，置于壳聚糖溶液中，在450rpm下搅拌20h至分散均匀，超声30min去除气泡；

(3)将含有壳聚糖、铁氧体和羟基磷灰石的混合液转移至12mm×18mm(直径×高度)模具中，-20℃，1000Gs匀强磁场下冷冻10h，然后转移至冷冻干燥器中-80℃，冷冻干燥30h，即可得到磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架；

(4)室温下，将磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架在100mL10wt％NaOH中浸泡24h，先用去离子水洗6～8次至中性，再用无水乙醇洗2～3次，然后在-80℃，再次冷冻干燥30h，最后液氮脆断切割成10×5mm(直径×高度)的圆片状，12000Gs磁场下充磁，即可得到壳聚糖、羟基磷灰石和M型铁氧体质量比为1:1:1的具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架。

对实施例1所制得的具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架进行形貌表征，得到的扫描电镜图如图1所示。由图1知，所得到的支架为相互贯通的多孔结构，断面孔径大小为60～150μm，贯通的孔径大小为20～50μm。图2、图3为实施例1中多孔支架粉末的XRD图及FTIR图。图4为实施例1中使用的M型铁氧体及磁性羟基磷灰石的磁滞回线。由图4知，M型铁氧体和磁性羟基磷灰石的比饱和磁化强度分别为50.12emu/g及15.30emu/g。

对本实施例中制得的具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架进行孔隙率、表观磁场强度的测试，结果如下：多孔支架的孔隙率为85％；表观磁场强度为10mT。

实施例2

对实施例1所得的具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架进行体外生物活性测试。

(1)模拟体液的配制：保持塑料容器中去离子水温度为37℃，按先后顺序，向搅拌的去离子水中先后加入8.035gNaCl、0.355gNaHCO₃、0.225gKCl、0.231gK₂HPO₄·3H₂O、0.311gMgCl₂·6H₂O、39mL1.0mol/LHCl、0.292gCaCl₂、0.072gNa₂SO₄，再用6.118g(CH₂OH)₃CNH₂、1.0mol/LHCl调节溶液的PH为7.4，定容至1000mL，转移至塑料器皿中，37℃保存、备用。

(2)按照50mL/片的用量比例，量取模拟体液于烧杯中，37℃浸泡转化2d，冷却、清洗、干燥即可。

对实施例2所得到的三维多孔支架进行形貌表征，得到的扫描电镜图如图5所示。由图5知，实施例1制得的具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架在SBF中37℃浸泡转化2天后，支架表面生成一层羟基磷灰石，表明该支架材料具有良好的生物活性。

实施例3

CCK-8法研究人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)在实施例1得到的具有取向磁场磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架(Magneticscallfolds)

和羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架(Normalscallfolds)材料表面的生长情况：

(1)在24孔板中放入各组材料(材料为圆片状，直径10mm)；

(2)按1×10⁴细胞/样品的密度将hBMSCs接种于各组材料上；

(3)在各个时间点(1d，3d，5d，7d)加入100μl5μg/mLCCK-8反应液，37℃恒温培养箱中孵育2小时；

(4)吸取CCK-8溶液，200μl/孔，加入96孔板。酶标仪在450nm波长测定OD值。

图6为CCK-8法评价人骨髓间充质干细胞在实施例1中所得三维多孔支架材料表面的粘附、增值图。由图6分析可知，羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架和具有取向磁场磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架材料均具有良好的生物相容性。从第一天到第七天，细胞呈现明显的增长趋势：第七天时的细胞数量是第一天的三倍多，但第七天时具有取向磁场磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架表面细胞数量明显多于羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架表面细胞数量，表明细胞在具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架上能够很好的粘附、增殖，说明具有取向磁场磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架更具有良好生物相容性。

实施例4

(1)壳聚糖溶液的制备：1g壳聚糖溶解于25mL乙酸溶液(2vol％)中，磁力搅拌12h至完全溶解，超声1h去除气泡；

(2)称取6.0g羟基磷灰石与3.0gM型铁氧体(Ca_0.42Sr_0.05La_0.46Ba_0.06Fe_9.39CO_0.28O₁₉)，置于上述壳聚糖溶液中，450rpm下搅拌20h至分散均匀，超声分散30min去除气泡；

(3)将含有壳聚糖、铁氧体和羟基磷灰石的混合液转移至12mm×18mm(直径×高度)模具中，-20℃，1000Gs匀强磁场下冷冻24h，然后转移至冷冻干燥器中-80℃，冷冻干燥30h，即可得到磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架；

(4)室温下，将磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架在100mL10wt％NaOH中浸泡24h，先用去离子水洗6～8次至中性，再用无水乙醇洗2～3次，然后在-80℃，1～2Pa再次冷冻干燥30h，最后液氮脆断切割成10×5mm(直径×高度)的圆片状，12000Gs磁场下充磁，即可得到壳聚糖、羟基磷灰石和M型铁氧体质量比为1:1:3的具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架。

对实施例4所制得的具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架进行形貌表征，得到的扫描电镜图如图7所示。由图7知，所得到的支架为相互贯通的多孔结构，断面孔径大小为70～200μm，贯通的孔径大小为30～60μm。

对本实施例中制得的具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架进行孔隙率、表观磁场强度的测试，结果如下：多孔支架的孔隙率为90％；表观磁场强度为200mT。

实施例5

(1)壳聚糖溶液的制备：3g壳聚糖溶解于75mL乙酸溶液(2vol％)中，磁力搅拌12h至完全溶解，超声1h去除气泡；

(2)称取3.0g羟基磷灰石与1.0gM型铁氧体(Sr_0.82La_0.18Fe_11.82Co_0.18Zn_0.02O₁₉)，然后置于壳聚糖溶液中，450rpm下搅拌20h分散均匀，超声分散30min去除气泡；

(3)将含有壳聚糖、铁氧体和羟基磷灰石的混合液转移至12mm×18mm(直径×高度)模具中，-20℃，1000Gs匀强磁场下冷冻24h，然后转移至冷冻干燥器中-80℃，冷冻干燥48h，即可得到磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架；

(4)室温下，将磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架在100mL10wt％NaOH中浸泡24h，先用去离子水洗6～8次至中性，再用无水乙醇洗2～3次，然后在-80℃冷冻干燥30h，最后液氮脆断切割成10mm×5mm(直径×高度)的圆片状，14000Gs磁场下充磁，即可得到壳聚糖、羟基磷灰石和M型铁氧体质量比为3:3:1的具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架。

对本实施例中所制备的具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架的形貌结构进行表征，其扫描电镜图如图8所示。由图8知，所得到的三维多孔支架为相互贯通的多孔结构，断面孔径大小为60～400μm，贯通的孔径大小为20～70μm。

对本实施例中制得的具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/壳聚糖三维多孔支架进行孔隙率、表观磁场强度的测试，结果如下：多孔支架的孔隙率为80％；表观磁场强度为23mT。

实施例7

(1)胶原蛋白溶液的配制：称取3.0g胶原蛋白粉末在40℃水浴下，450rpm搅拌1h，溶解于33.3mL去离子水中；

(2)称取1.0g羟基磷灰石与1.0gM型铁氧体(BaFe₁₂O₁₉)，置于胶原蛋白溶液中，450rpm搅拌1h，混合均匀；

(3)将含有胶原蛋白、M型铁氧体和羟基磷灰石的混合液转移至12mm×18mm(直径×高度)模具中，-20℃，2000Gs匀强磁场下冷冻10h，然后转移至冷冻干燥器中-80℃，冷冻干燥42h，即可得到磁性羟基磷灰石/胶原蛋白三维多孔支架；

(4)室温下，将磁性羟基磷灰石/胶原蛋白三维多孔支架在1％(w/v)戊二醛溶液中浸泡1天，用去离子水洗6～8次至中性，再用无水乙醇洗2～3次，然后在-80℃冷冻干燥42h，最后液氮脆断切割成10mm×5mm(直径×高度)的圆片状，14000Gs磁场下充磁。最后，胶原蛋白、羟基磷灰石和M型铁氧体质量比为3:1:1的磁性羟基磷灰石/胶原蛋白三维多孔支架。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。本发明中出现的术语用于对本发明技术方案的阐述和理解，并不构成对本发明的限制。

Claims (8)

1.一种具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/高分子三维多孔支架材料，其特征在于，所述材料主要包含生物活性高分子、永磁铁氧体和羟基磷灰石，具有三维贯通的孔结构，孔径为60～400μm，孔隙率为30～90％，而且具有磁场强度可调的取向磁场，其表观磁场强度为0.5～200mT；所述永磁铁氧体为M型永磁性铁氧体，并具有以下特征的分子式：R_xFe_nM_zO₁₉，其中，R为Ca、Ba、Sr、La、Nd、Bi，且必须含有Ca、Sr、Ba中的至少一种；M为Co、Ni、Zn；x、n、z表示摩尔比，并且x为0.7～1.3，n为8.0～13.0，z为0～0.5。

2.根据权利要求1所述的具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/高分子三维多孔支架材料，其特征在于，所述的生物活性高分子包括壳聚糖、胶原蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚羟基丁酸酯、聚乳酸和聚己内酯。

3.根据权利要求1所述的具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/高分子三维多孔支架材料的制备方法，其特征在于，制备过程包括以下三个步骤：

步骤一：将生物活性高分子材料溶解到去离子水、乙酸、乙醇、丙酮、甲苯和乙醚中的一种或者一种以上的溶剂中，得到高分子溶液；

步骤二：将质量比为30:1～1:200的M型永磁铁氧体粉末与羟基磷灰石粉末置于高分子溶液中，混合均匀后置于模具中，先在磁场下冷冻，然后冷冻干燥成型即可得到磁性羟基磷灰石/高分子三维多孔支架；

步骤三：磁性羟基磷灰石/高分子三维多孔支架依次经过溶液浸泡、清洗、切割和充磁后，最终得到具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/高分子三维多孔支架材料。

4.根据权利要求3所述的具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/高分子三维多孔支架材料制备方法，其特征在于，步骤一所述的高分子浓度为0.001M～饱和浓度。

5.根据权利要求3所述的具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/高分子三维多孔支架材料制备方法，其特征在于，步骤二中所述磁场下冷冻，其磁场强度为100～10000Gs，可以为均匀磁场、非均匀磁场，磁场下冷冻时间为30min～48h，冷冻温度为-80～0℃。

6.根据权利求3所述的具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/高分子三维多孔支架材料制备方法，其特征在于，步骤二所述的冷冻干燥成型，其冷冻干燥温度为-80～0℃，冷冻干燥时间为16h～7天。

7.根据权利求3所述的具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/高分子三维多孔支架材料制备方法，其特征在于，步骤三所述溶液浸泡使用的溶液为碱性溶液，碱性溶液包括NaOH、KOH、Na₂CO₃溶液，浓度为0.001M～饱和浓度，浸泡时间为30min～3天。

8.根据权利要求3所述的具有取向磁场的磁性羟基磷灰石/高分子三维多孔支架材料制备方法，其特征在于，步骤三所述的充磁，其磁场强度为4000～14000Gs。