CN108165518A - 一种二维/三维细胞培养支架材料 - Google Patents

一种二维/三维细胞培养支架材料 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种二维/三维细胞培养支架材料，其特征在于以普通化学试剂制备，操作设备和制备工艺简单，生产成本低，容易制备成二维、三维结构，形态和机械性能可控，该支架材料在水溶液中降解且降解速度可调，对外加磁场具有智能响应，促进细胞生长等特性；其组分由重量百分比为1‑5%的纳米核壳结构四氧化三铁，1‑5%的纳米羟基磷灰石，70‑80%的2‑3二醛纤维素和余量的壳聚糖。该材料在再生医学、医学基础研究和药物研发等方面具有良好的应用前景。

Description

一种二维/三维细胞培养支架材料
技术领域
本发明涉及一种兼具二维（2D）、三维（3D）结构、磁性、降解速度可控和促进细胞生长的细胞培养材料，属于细胞和组织培养科学领域。
背景技术
支架是细胞和组织培养领域中重要的生物材料，在再生医学、医学基础研究和药物研发中应用越来越广泛。在细胞的体外培养中，支架材料对细胞形态、分化、细胞间以及细胞与基质间的相互作用均会产生显著的影响。
支架是实现细胞培养的重要手段，在细胞培养过程中种子细胞需要依靠支架材料和细胞维基质实现分裂和生长，所以选择合适的支架材料对于细胞培养尤为重要。细胞支架材料的主要作用是为细胞生长提供支撑、引导组织再生和控制组织。目前支架材料主要有天然生物材料和人工合成高分子材料，诸如纤维蛋白、胶原、硫酸软骨素、透明质酸、羟基磷灰石、藻酸盐、聚乳酸、聚己酸、聚羟基乙酸、内酯等。
目前有多种方法可以用于制备支架材料，例如：静电纺丝法、溶剂浇铸/粒子沥滤技术、相分离/冷冻干燥法、快速成型技术及气体发泡技术、3D打印、纳米自组装等。传统的支架制备技术形成的支架材料一般孔隙率较高，很难达到200微米以下的适宜细胞营养物质交换的微孔结构，而纳米自组织技术制备的支架材料存在制备工艺复杂、制作成本较高等不利因素。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种二维/三维细胞培养支架材料。该材料由普通化学试剂制备，操作设备和制备工艺简单，生产成本低，容易制备成二维/三维结构，形态和机械性能可控。该支架材料在水溶液中降解且降解速度可调，对外加磁场具有智能响应，促进细胞生长等特性。
本发明涉及的一种细胞培养支架材料，其组分由重量百分比为1-5%的纳米四氧化三铁，1-5%的纳米羟基磷灰石，70-80%的2-3二醛纤维素和余量的壳聚糖。其中纳米四氧化三铁呈纳米核壳结构，其表面包覆一层壳聚糖；纳米羟基磷灰石呈棒状直径为20-30nm，长度为80-120nm。该细胞培养支架材料呈薄纸片状，通过裁剪可制成所需形状的2D支架；依据欲培养组织的横截面形状对薄纸片状支架材料进行剪裁并编号，获得一系列截面形状的2D支架材料，然后将2D支架材料利用石蜡固定依次层叠组装成3D细胞培养支架。
本发明所述的一种二维/三维细胞培养支架材料，由下述步骤实现：
(1) 制备四氧化三铁纳米核壳结构颗粒，原料均选用市售分析纯试剂，分别将氯化铁(FeCl3·6H2O)和硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)配置成0.1M的水溶液，取上述两种溶液，使Fe3+/Fe2+摩尔比为0.8-1.2，在电磁搅拌下加入到3.0M的氢氧化钠(NaOH)溶液中，剧烈搅拌下于80-90℃水浴10-20分钟得到黑色沉淀，然后分别用无水乙醇和去离子水洗涤2-3次去除未反应的离子，得到直径为5-20nm的四氧化三铁纳米颗粒，将得到的四氧化三铁在超声振荡下分散到去离子水中得到四氧化三铁分散体系，称取乙酰度为80-95％壳聚糖0.1-0.5g，溶于0.2M的盐酸中，搅拌至混合均匀后，加入到四氧化三铁分散体系中，然后采用超声振荡至混合均匀得到壳聚糖-四氧化三铁溶液；称取1.0g β-甘油磷酸钠，溶解于1mL去离子水中形成澄清溶液，然后在搅拌条件下滴加到壳聚糖-四氧化三铁溶液中，滴加完成后再持续搅拌10-30分钟；将得到的溶液于37℃恒温6-10分钟后，移至真空干燥箱中37℃干燥至恒重，然后经过研磨过筛得到包覆壳聚糖的四氧化三铁纳米核壳结构颗粒；
(2) 称取8-12g α-纤维素、0.2-2g纳米羟基磷灰、15-25g氢氧化锂、24-34g尿素溶于150-250g去离子水中，搅拌均匀后，于-25℃冷冻15-20小时，解冻并机械搅拌，于2℃、9000转离心脱泡15分钟，然后将纤维素溶液流延形成纸片状，通过酸性硫酸钠固定成型，用去离子水反复冲洗去除残留的氢氧化锂、尿素和硫酸钠，得到纸片状纤维素；在避光条件下，将上述纸片状纤维素浸泡在0.04g/mL、pH为2的高碘酸钠溶液中1.5小时，之后浸泡在0.1mol/L的乙二醇溶液中直至除去过量的高碘酸钠，用去离子水清洗3次得后得到2-3二醛纤维素；
(3) 称取按质量百分含量5-20%四氧化三铁纳米核壳结构颗粒、80-95%的壳聚糖机械研磨至混合均匀后，在超声振荡下分散到50-100mL0.2M的盐酸中得到壳聚糖混合溶液；将步骤(2)中制备的2-3二醛纤维素浸泡在上述壳聚糖混合溶液中，37℃恒温20-50分钟后，去离子水清洗至成中性，移至真空干燥箱中37℃干燥至恒重，得到呈薄纸片状的细胞培养支架材料；
(4) 取步骤(3)中制备的细胞培养支架材料，通过裁剪可制成所需形状的2D支架；依据欲培养组织的横截面形状对薄纸片状支架材料进行剪裁并依序编号，获得一系列截面形状的2D支架材料，然后将上述2D支架材料利用石蜡固定并按序号依次层叠组装成3D细胞培养支架。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但本发明保护内容不仅限于所述实施例。
实施例1：
(1) 制备四氧化三铁纳米核壳结构颗粒，原料均选用市售分析纯试剂，分别将氯化铁(FeCl3·6H2O)和硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)配置成0.1M的水溶液，取上述两种溶液，使Fe3+/Fe2+摩尔比为0.8，在电磁搅拌下加入到3.0M的氢氧化钠(NaOH)溶液中，剧烈搅拌下于80℃水浴10分钟得到黑色沉淀，然后分别用无水乙醇和去离子水洗涤3次去除未反应的离子，得到直径为5-20nm的四氧化三铁纳米颗粒，将得到的四氧化三铁在超声振荡下分散到去离子水中得到四氧化三铁分散体系，然后称取乙酰度为85％壳聚糖0.2g，溶于0.2M的盐酸中，搅拌至混合均匀后，加入到四氧化三铁分散体系中，采用超声振荡至混合均匀得到壳聚糖-四氧化三铁溶液；称取1.0g β-甘油磷酸钠，溶解于1mL去离子水中形成澄清溶液，然后在搅拌条件下滴加到壳聚糖-四氧化三铁溶液中，滴加完成后再持续搅拌15分钟；将得到的溶液于37℃恒温6分钟后，移至真空干燥箱中37℃干燥至恒重，然后经过研磨过筛得到包覆壳聚糖的四氧化三铁纳米核壳结构颗粒；
(2) 称取8g α-纤维素、0.2g纳米羟基磷灰、15g氢氧化锂、24g尿素溶于150g去离子水中，搅拌均匀后于-25℃冷冻15小时，解冻并机械搅拌后，于2℃、9000转离心脱泡15分钟，然后将纤维素溶液流延形成纸片状，通过酸性硫酸钠固定成型，用去离子水反复冲洗去除残留的氢氧化锂、尿素和硫酸钠，得到纸片状纤维素；在避光条件下，将上述纸片状纤维素浸泡在0.04g/mL、pH为2的高碘酸钠溶液中1.5小时，之后浸泡在0.1mol/L的乙二醇溶液中直至除去过量的高碘酸钠，用去离子水清洗3次得后得到2-3二醛纤维素；
(3) 称取按质量百分含量5%的四氧化三铁纳米核壳结构颗粒、95%的壳聚糖机械研磨至混合均匀后，在超声振荡下分散到60mL0.2M的盐酸中得到壳聚糖混合溶液；将步骤(2)中制备的2-3二醛纤维素浸泡在上述壳聚糖混合溶液中，37℃恒温20分钟后，去离子水清洗至成中性，移至真空干燥箱中37℃干燥至恒重，得到呈薄纸片状的细胞培养支架材料；
(4) 取步骤(3)中制备的细胞培养支架材料，通过裁剪可制成所需形状的2D支架；依据欲培养组织的横截面形状对薄纸片状支架材料进行剪裁并依序编号，获得一系列截面形状的2D支架材料，然后将上述2D支架材料利用石蜡固定并按序号依次层叠组装成3D细胞培养支架。
实施例2：
(1) 制备四氧化三铁纳米颗粒，原料均选用市售分析纯试剂，分别将氯化铁(FeCl3·6H2O)和硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)配置成0.1M的水溶液，取上述两种溶液，使Fe3+/Fe2+摩尔比为1.0，在电磁搅拌下加入到3.0M的氢氧化钠(NaOH)溶液中，剧烈搅拌下于85℃水浴15分钟得到黑色沉淀，然后分别用无水乙醇和去离子水洗涤2-3次去除未反应的离子，得到直径为5-20nm的四氧化三铁纳米颗粒，将得到的四氧化三铁在超声振荡下分散到去离子水中得到四氧化三铁分散体系，称取乙酰度为90％壳聚糖0.2g，溶于0.2M的盐酸中，搅拌至混合均匀后，加入到四氧化三铁分散体系中，然后采用超声振荡至混合均匀得到壳聚糖-四氧化三铁溶液；称取1.0g β-甘油磷酸钠，溶解于1mL去离子水中形成澄清溶液，然后在搅拌条件下滴加至壳聚糖-四氧化三铁溶液中，滴加完成后再持续搅拌20分钟；将得到的溶液于37℃恒温8分钟后，移至真空干燥箱中37℃干燥至恒重，然后经过研磨过筛得到包覆壳聚糖的四氧化三铁纳米核壳结构颗粒；
(2) 称取10g α-纤维素、0.4g纳米羟基磷灰、20g氢氧化锂、28g尿素溶于200g去离子水中，搅拌均匀后于-25℃冷冻20小时，然后解冻并机械搅拌，于2℃、9000转离心脱泡15分钟，然后将纤维素溶液流延形成纸片状，通过酸性硫酸钠固定成型，用去离子水反复冲洗去除残留的氢氧化锂、尿素和硫酸钠，得到纸片状纤维素；在避光条件下，将上述纸片状纤维素浸泡在0.04g/mL、pH为2的高碘酸钠溶液中1.5小时，之后浸泡在0.1mol/L的乙二醇溶液中直至除去过量的高碘酸钠，用去离子水清洗3次，得到2-3二醛纤维素；
(3) 称取按质量百分含量20%四氧化三铁纳米核壳结构颗粒、80%的壳聚糖机械研磨至混合均匀后，在超声振荡下分散到90mL0.2M的盐酸中得到壳聚糖混合溶液；将步骤(2)中制备的2-3二醛纤维素浸泡在上述壳聚糖混合溶液中，37℃恒温40分钟后，去离子水清洗至成中性，移至真空干燥箱中37℃干燥至恒重，得到呈薄纸片状的细胞培养支架材料；
(4) 取步骤(3)中制备的细胞培养支架材料，通过裁剪可制成所需形状的2D支架；依据欲培养组织的横截面形状对薄纸片状支架材料进行剪裁并依序编号，获得一系列截面形状的2D支架材料，然后将上述2D支架材料利用石蜡固定并按序号依次层叠组装成3D细胞培养支架。
实施例3：
(1) 制备四氧化三铁纳米核壳结构颗粒，原料均选用市售分析纯试剂，分别将氯化铁(FeCl3·6H2O)和硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)配置成0.1M的水溶液，取上述两种溶液，使Fe3+/Fe2+摩尔比为1.2，在电磁搅拌下加入到3.0M的氢氧化钠(NaOH)溶液中，剧烈搅拌下于90℃水浴20分钟得到黑色沉淀，然后分别用无水乙醇和去离子水洗涤3次去除未反应的离子，得到直径为5-20nm的四氧化三铁纳米颗粒，将得到的四氧化三铁在超声振荡下分散到去离子水中得到四氧化三铁分散体系，称取乙酰度为95％壳聚糖0.4g，溶于0.2M的盐酸中，搅拌至混合均匀后，加入到四氧化三铁分散体系中，然后超声振荡至混合均匀得到壳聚糖-四氧化三铁溶液；称取1.0g β-甘油磷酸钠，溶解于1mL去离子水中形成澄清溶液，然后在搅拌条件下滴加至壳聚糖-四氧化三铁溶液中，滴加完成后再持续搅拌30分钟；将得到的溶液于37℃恒温10分钟后，移至真空干燥箱中37℃干燥至恒重，然后经过研磨过筛得到包覆壳聚糖的四氧化三铁纳米核壳结构颗粒；
(2) 称取12g α-纤维素、0.8g纳米羟基磷灰、25g氢氧化锂、34g尿素溶于250g去离子水中，搅拌均匀后于-25℃冷冻20小时，解冻并机械搅拌，于2℃、9000转离心脱泡15分钟，然后将纤维素溶液流延形成纸片状，通过酸性硫酸钠固定成型，用去离子水反复冲洗去除残留的氢氧化锂、尿素和硫酸钠，得到纸片状纤维素；在避光条件下，将上述纸片状纤维素浸泡在0.04g/mL、pH为2的高碘酸钠溶液中1.5小时，之后浸泡在0.1mol/L的乙二醇溶液中直至除去过量的高碘酸钠，用去离子水清洗3次得，得到2-3二醛纤维素；
(3) 称取按质量百分含量20%四氧化三铁纳米核壳结构颗粒、80%的壳聚糖机械研磨至混合均匀，在超声振荡下分散到100mL0.2M的盐酸中得到壳聚糖混合溶液；将步骤(2)中制备的2-3二醛纤维素浸泡在上述壳聚糖混合溶液中，然后37℃恒温30分钟后，去离子水清洗至成中性，移至真空干燥箱中37℃干燥至恒重，得到呈薄纸片状的细胞培养支架材料；
(4) 取步骤(3)中制备的细胞培养支架材料通过裁剪可制成所需形状的2D支架；依据欲培养组织的横截面形状对薄纸片状支架材料进行剪裁并依序编号，获得一系列截面形状的2D支架材料，然后将上述2D支架材料利用石蜡固定并按序号依次层叠组装成3D细胞培养支架。

Claims (1)

1.一种二维/三维细胞培养支架材料，其特征在于含有纳米四氧化三铁，纳米四氧化三铁呈纳米核壳结构，其表面包覆一层壳聚糖，直径为5-20nm，纳米羟基磷灰石，纳米羟基磷灰石呈棒状直径为20-30nm，长度为80-120nm，乙酰度为80-95％的壳聚糖，2-3二醛纤维素；该支架材料具有容易制备成二维、三维结构，形态和机械性能可控，在水溶液中降解且降解速度可调，对外加磁场具有智能响应，促进细胞生长的特性；其组分由重量百分比1-5%的四氧化三铁，1-5%的纳米羟基磷灰石，70-80%的2-3二醛纤维素和余量的壳聚糖。
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