CN101766837B - 仿生多孔微球组织工程支架及其制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了仿生多孔微球组织工程支架及其制作方法，该支架是模仿天然细胞外基质制作的微球，直径为100μm～500μm，表面分布有细胞孔和物质交换孔，内部具有相互联通的三维网络结构，应用时，借助于特制模具或组织工程反应器，由一定数量的这种支架构成肉眼可见的各种支架。该支架由天然生物材料胶原和壳聚糖构成，其制作包括以下步骤：(1)将8％～10％的胶原乙酸分散液和壳聚糖乙酸分散液按一定比例混合；(2)将(1)步所得混合液与含6％～8％Span 85的液体石蜡混合；(3)将(2)步所得混合液按体积比为1∶5加入到液体石蜡中，然后剧烈搅拌，用戊二醛交联，制得该组织工程支架粗品；(4)将(3)步所得分别用蒸馏水、异丙醇、乙醚、无水乙醇洗涤，经过筛选获得组织工程支架成品。本发明可作为一种组织工程支架，能抑制干细胞生长发育过程中的致瘤倾向，促进血管、神经再生，并且，降解吸收速率与组织器官形成相适应。此外，还可用于可注射组织工程支架，组织工程用种子细胞的大量扩增，或治疗用干细胞转移的载体。

Description

仿生多孔微球组织工程支架及其制作方法

技术领域

本发明属于生物医学材料领域，特别是涉及一种仿生多孔微球组织工程支架，该支架在临床上可用于：①仿生组织工程支架，用于干细胞三维培养再生各种组织器官，供临床移植；②组织工程用种子细胞的大量扩增；③可注射组织工程支架或治疗用干细胞转移的载体。

背景技术

利用干细胞组织工程技术再生人体组织器官(如皮肤、血管、肝脏等)是解决目前临床上以“损伤修复损伤”和可供临床移植器官严重短缺难题的重要途径。组织工程支架(tissue engineering scaffold)是一种细胞外基质替代物，是组织工程的基础。它是根据材料用于不同人体组织及具体替代组织具备的功能所设计的。现有支架材料可分为三大类：①天然生物材料，如明胶、琼脂糖、藻酸盐等；②合成有机材料，如聚乙烯醇、聚羟基乙酸、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)等；③无机材料，如羟基磷灰石、生物陶瓷、生物玻璃等。其中天然生物材料具有本身包含着生物信息、能够促进和维持细胞生长发育、生物相容性好、可在体内降解吸收以及来源广泛等优势，是今后组织工程支架材料发展的趋势。

在众多组织工程支架中，多孔支架较普通支架具有更多优越性，更适合于细胞三维培养(陈彦彦等.壳多糖组织工程支架材料的制备及其应用.吉林大学学报(医学版)，33(5)：867-870，2007)。现有多孔支架尚具有以下缺陷：①形状不规则，主要是片状(Xinetal.Continuingdifferentiation of human mesenchymal stem cells and inducedchondrogenic and osteogenic lineages in electrospun PLGAnanofibers caffold.Biomaterials，(28)：316-325，2007)、块状(

et al.Evaluation of RGD-or EGF-immobilized chitosanscaffolds for chondrogenic activity.International Journal ofBiological Macromolecules，(43)：121-128，2008)、实心微球状(Blaker et al.Novel fabrication techniques to producemicrospheres by thermally induced phase separation for tissueengineering and drug delivery.ActaBiomaterialia，(4)：264-272，2008)、圆盘状(Wang et al.In vitrocartilage tissue engineering with 3D porous aqueous-derived silkscaffolds and mesenchymal stem cells.Biomaterials，(26)：7082-7094，2005)、管状(Nieponice et al.Development of a tissue-engineered vascular graft combining abiodegradable scaffold，muscle-derived stem cells and arotational vacuum seeding technique.Biomaterials，(29)：825-833，2008)、纤维状(Danielsson et al.Modified collagenfleece，a scaffold for transplantation of human bladder smoothmuscle cells.Biomaterials，(27)：1054-1060，2006)等形状，这些形状的支架比表面积小，不利于细胞生长分化，在实际应用中会有一定限制；②由于制作方法的原因，支架内孔的几何结构不利于细胞三维培养和组织再生；③由于支架形状不规则和内部几何结构不合理，再生组织中缺乏血管和神经发育的自然空间。

发明内容

本发明的目的是为了解决已有多孔支架尚具有的上述缺陷，设计一种新型仿生多孔微球组织工程支架来有效地解决这些问题，并且，制作支架时，可通过改变支架中不同材料的组成比例来改变组织器官形成后支架的降解吸收速率；本技术方案制作的支架具有一定的抗菌性，有助于减少组织器官再生和移植过程中污染发生的机会；本发明所述的支架能抑制干细胞体外培养时的致瘤特性，向正常组织器官分化。所以，本发明的仿生多孔微球组织工程支架具有极好的临床应用前景。

实现上述目的的本发明的技术方案为，仿生多孔微球组织工程支架是由胶原(明胶)和壳聚糖(壳聚糖衍生物)制成，微球直径在100μm～500μm，且微球表面分布有孔，微球内部具有模仿天然细胞外基质环境而设计制作的相互联通的三维网络结构，微球内部具有60％以上的空体积，上述微球表面分布有两种类型的孔，即大直径的细胞孔，在生理盐水中的孔直径＞10μm，供细胞钻入或进入微球内部生长发育；小直径的物质交换孔，在生理盐水中的孔直径＜10μm，供微球内的细胞与微球外的环境之间进行物质交换，并且构建组织工程支架的胶原和壳聚糖比例为20％～80％。

上述仿生多孔微球组织工程支架的制作方法，包括以下步骤：(1)将胶原乙酸分散液和壳聚糖乙酸分散液混合；(2)将(1)步所得的混合液与6％～8％Span 85的液体石蜡混合；(3)将(2)步混合液按体积比1∶5加入液体石蜡后剧烈搅拌，用戊二醛交联，制得仿生多孔微球组织工程支架粗品；(4)将(3)步制得的组织工程支架粗品分别用蒸馏水、异丙醇、乙醚、无水乙醇洗涤去除乙酸和液体石蜡后冷冻干燥，经过不锈钢筛子筛选，获得仿生多孔微球组织工程支架成品。

上述步骤(1)中的胶原乙酸分散液和壳聚糖乙酸分散液分别是将胶原和壳聚糖各溶于1％乙酸，形成浓度为8％～10％的分散液。

上述步骤(2)中，胶原壳聚糖混合液与Span 85的石蜡液混合的比例在2.1∶1～2.7∶1。上述步骤(3)中，交联用戊二醛的浓度为0.25％～2.5％，交联时间为1h～2h，交联温度为25℃。

上述步骤(4)中，异丙醇、乙醚、无水乙醇洗涤对工程支架粗品的洗涤次数不少于3次。

本发明和已有的组织工程支架相比具有以下优点：①模仿天然细胞外基质的环境，胶原、多糖都是天然细胞外基质成分，由胶原、壳聚糖构建的多孔微球内部的三维网络结构类似于天然细胞外基质环境，在其中生长发育的干细胞倾向于形成有功能的组织；②具有一定刚性且易于塑造成型的组织工程支架，本发明的仿生多孔微球组织工程支架是一种可广泛应用于不同种类组织器官再生的支架。作为一种通用性很强的组织工程支架，它有两个显著特点：第一，具有一定刚性，可以很好地起到支架作用，因为尽管单纯的胶原或壳聚糖作为支架强度上都不尽人意，但当胶原与壳聚糖复合时，壳聚糖的游离氨基与胶原的羟基之间发生交联反应，使支架的强度提高，同时，壳聚糖带正电荷，胶原带负电荷，两者可自然地通过静电相互作用，进一步提高支架的强度；第二，规则的微球体，易于塑造成型，因为本发明的组织工程支架，就像砖块一样，可以在特制的模具或组织工程反应器内搭建成不同形态的组织器官(皮肤、肝脏、肾脏等)，供干细胞在其中生长发育，这是几何形状不规则的一些支架无法相比的；③可注射性组织工程支架，本发明的仿生多孔微球组织工程支架，由于是极微小的规则球体(裸球直径为100μm、200μm、300μm、400μm、500μm五种)，按实际需要选择不同直径的微球接种细胞并经一段时间适应培养后，可用注射器注射到发生机能障碍的组织器官进行原位修复；④用于干细胞高效高质量扩增，干细胞是组织工程常用的种子细胞，它来源有限、数量少，如何获得足够数量的可用于临床移植的干细胞一直以来是个世界性难题。本发明的仿生多孔微球组织工程支架，由于是规则的球体，球体在自然界中具有最大的表面积体积比，再加之微球内部60％以上是空的，微球内部之间的孔隙又是相互联通的，这就为干细胞繁殖提供了大量空间和生长表面，因而可进行干细胞高效扩增。干细胞在体外扩增时具有致瘤倾向，如何控制好干细胞的这一特性，直接影响到组织工程产品的安全。本发明的仿生多孔微球组织工程支架，主要成分是胶原和壳聚糖。微球内外表面分布有大量纳米胶原纤维丝构成的网，由于胶原具有非常好的细胞亲和力，可以诱导细胞正常地黏附、生长；壳聚糖具有抗肿瘤作用，可以抑制干细胞生长发育过程中的致瘤倾向；同时微球内部的三维立体网络结构有助于干细胞发育分化形成正常的组织器官。因而本发明的仿生多孔微球组织工程支架生产的组织工程产品是相对安全的。⑤在再生组织器官中的降解吸收速度可适当调控，作为支架材料，胶原、壳聚糖在再生组织器官中的降解分别在细胞分泌的不同酶作用下进行；胶原降解比较快，壳聚糖降解比较慢，通过调整支架中两种材料的比例，可以使支架降解吸收速度与组织器官形成速度相适应，并且，将胶原与壳聚糖复合，壳聚糖带正电荷，胶原带负电荷，两者可自然地通过静电相互作用，胶原的降解也因此得到延缓；⑥为血管、神经发育预留了空间，本发明的仿生多孔微球组织工程支架，当用于组织器官再生时，需要用一定数量的多孔微球搭建成组织器官雏形，球与球之间具有自然形成的相互连通的三维空间，这为血管、神经发育预留了空间，同时有助于球与球之间细胞的融合生长和营养交换，并且血管、神经可以向任意方向发育生长，有利于形成有功能的组织器官。而一般组织工程支架由于支架形状不规则和内部几何结构不合理，再生组织中缺乏血管和神经发育的自然空间；⑦支架具有一定的抗菌性，本发明的多孔微球组织工程支架，由于含有具有广谱抗菌抗病毒作用的壳聚糖，有助于减少组织器官再生和移植过程中污染发生的机会；⑧具有纳米材料的优越性，本发明的仿生多孔微球组织工程支架中的胶原材料本身是由天然纳米级纤维构成的。纳米纤维具有较高的表面积与体积比，它可以大大增加细胞的黏附和生物相容性，从而增加细胞的迁移、增殖及分化功能。所以，本发明的仿生多孔微球组织工程支架较传统支架更适于干细胞三维培养再生组织器官。

附图说明

图1是本发明所述仿生多孔微球组织工程支架外观结构示意图；图中，1、大直径的细胞孔；2、小直径的物质交换孔。

图2是本发明所述仿生多孔微球组织工程支架剖面图；

图3是本发明所述仿生多孔微球组织工程支架制作工艺流程图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行具体描述，如图1是本发明所述仿生多孔微球组织工程支架外观结构示意图，如图所示，仿生多孔微球组织工程支架，是由胶原(明胶)和壳聚糖(壳聚糖衍生物)制成，微球直径可以为100μm、200μm、300μm、400μm、500μm，两种类型的孔，即：大直径的细胞孔1，在生理盐水中的孔直径＞10μm，供细胞钻入或进入微球内部生长发育；小直径的物质交换孔2，在生理盐水中的孔直径＜10μm，供微球内的细胞与微球外的环境之间进行物质交换，即微球外环境中的各种营养物质(包括氧气、生长因子等)进入微球内部，同时内部细胞产生的代谢废物(包括二氧化碳、乳酸等)进入微球外部。图2是本发明所述仿生多孔微球组织工程支架剖面图，如图所示，构建组织工程支架的微球内部是空的，空体积在60％以上，空体积越小微球的机械强度越大，越适于用在组织器官中承受压力大或张力强度大的地方。如皮肤的再生，可用60％～70％空体积的微球做皮下组织再生的支架，70％～90％空体积的微球做真皮组织再生的支架，90％以上空体积的微球做表皮组织再生的支架。再如耳朵的再生，在特制的模具中，沿耳朵轮廓及隆起部分使用空体积较小的60％～70％的微球做支架，其他受力小的部位使用70％～90％，甚至90％以上空体积的微球做支架。

微球内部具有相互联通的三维网络结构，微球中胶原和壳聚糖的比例为20％～80％。

图3是本发明所述仿生多孔微球组织工程支架的制作工艺流程图，如图所示，制作本发明所述仿生多孔微球组织工程支架的主要原料：胶原制备自哺乳动物(如猪、牛、羊、马等)的筋腱或皮肤，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示一条带；壳聚糖制备自海洋动物(虾、蟹)的皮或壳，脱乙酰度90％以上。首先，胶原、壳聚糖各溶于1％乙酸，分别配浓度为8％～10％的胶原乙酸分散液、壳聚糖乙酸分散液，然后以一定比例混合。混合物中胶原、壳聚糖的质量比例因所制作支架培养的组织器官种类不同而改变；比如，当用于角膜组织工程时，胶原的比例可以是20％～30％，相应壳聚糖的比例可以是70％～80％；再比如，当用于软骨组织工程时，胶原的比例可以是40％～50％，而相应壳聚糖的比例可以是50％～60％；又比如，当用于血管组织工程时，胶原的比例可以是70％～80％，而相应壳聚糖的比例是20％～30％。这样制得的胶原壳聚糖混合液为A液。

含6％～8％Span 85的液体石蜡为B液。

将A液和B液按一定比例混合制得C液，混合比因所制作微球的空体积不同而变化；比如，当微球空体积是60％～70％时，A、B液之比大致可以是A∶B＝2.7∶1；当微球空体积是70％～80％时，A、B液之比大致可以是A∶B＝2.3∶1；当微球空体积是80％～90％时，A、B液之比大致可以是A∶B＝2.1∶1。

将C液加入体积比为1∶5的液体石蜡中，用磁力搅拌器剧烈搅拌，搅拌速度约为1000rpm/min。然后在25℃条件下，用0.25％～2.5％的戊二醛交联1h～2h，制得仿生多孔微球组织工程支架粗品，接着用蒸馏水反复冲洗去除没有反应的戊二醛，然后用异丙醇、乙醚、无水乙醇洗涤至少3次，以去除乙酸和液体石蜡，冷冻干燥，系列不锈钢筛子筛选，获得仿生多孔微球组织工程支架成品。成品在生理盐水中溶胀后的直径为100μm～500μm。

上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.仿生多孔微球组织工程支架，其特征在于，该支架是由天然生物材料胶原和壳聚糖制成的微球，直径为100μm～500μm，表面分布有孔，内部是相互联通的三维网络结构，内部具有60%以上的空体积。

2.根据权利要求1所述仿生多孔微球组织工程支架，其特征在于，微球表面分布有两种类型的孔，即大直径的细胞孔，在生理盐水中的孔直径＞10μm，供细胞钻入或进入微球内部生长发育；小直径的物质交换孔，在生理盐水中的孔直径＜10μm，供微球内的细胞与微球外的环境之间进行物质交换。

3.根据权利要求1所述仿生多孔微球组织工程支架，其特征在于，组成支架的材料是胶原/明胶与壳聚糖/壳聚糖衍生物的混合。

4.根据权利要求1所述仿生多孔微球组织工程支架，其特征在于，胶原制备自哺乳动物的筋腱或皮肤；壳聚糖制备自海洋动物的皮或壳，脱乙酰度90%以上。

5.根据权利要求1所述仿生多孔微球组织工程支架，其特征在于，支架中胶原和壳聚糖比例为20％～80％。

6.仿生多孔微球组织工程支架的制作方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）将胶原乙酸分散液和壳聚糖乙酸分散液混合；

（2）将（1）步所得的混合液与含6%～8% Span 85的液体石蜡混合；

（3）将（2）步所得混合液按体积比1：5加入液体石蜡中，剧烈搅拌 ，用戊二醛交联，制得仿生多孔微球组织工程支架粗品；

（4）将（3）步制得的仿生多孔微球组织工程支架粗品分别用蒸馏水、异丙醇、乙醚、无水乙醇洗涤去除乙酸和液体石蜡后冷冻干燥，经过不锈钢筛子筛选，获得仿生多孔微球组织工程支架成品。

7.根据权利要求6所述的仿生多孔微球组织工程支架的制作方法，其特征在于，胶原乙酸分散液和壳聚糖乙酸分散液分别是将胶原和壳聚糖各溶于1%乙酸，形成浓度为8 %～10 %的分散液。

8.根据权利要求6所述的仿生多孔微球组织工程支架的制作方法，其特征在于，上述步骤（2）中，胶原壳聚糖混合液与含Span 85的液体石蜡混合的比例为2.1:1～2.7:1。

9.根据权利要求6所述的仿生多孔微球组织工程支架的制作方法，其特征在于，上述步骤（3）中，交联用戊二醛的浓度为0.25%～2.5%，交联时间为1h～2h，交联温度为25℃。

10.根据权利要求6所述的仿生多孔微球组织工程支架的制作方法，其特征在于，上述步骤（4）中，异丙醇、乙醚、无水乙醇洗涤对工程支架粗品的洗涤次数不少于3次。

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