CN112891636B - 具有温敏和缓释功能的复合生物材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有温敏和缓释功能的复合生物材料及其制备方法和应用，属于基础发育生物学和生物医学工程领域。将脊髓腹侧化的信号因子SAG装载到多孔壳聚糖内，再在其表面包被一层具有温敏特性的基质胶Geltrex形成具有温敏和缓释功能的复合生物材料，以此作为体外制备3D脊髓类器官的内核支架，再通过设计的脊髓定向分化模式在外侧培养体系中加入脊髓背侧化的信号因子BMP4，可以制备出具有完整背腹侧结构的脊髓类器官。本发明提供了研究人的脊髓发育，生理病理机制的3D新模型以及脊髓损伤治疗的新方法，本发明获得的脊髓类器官对脊髓相关疾病建模，脊髓损伤治疗以及药物筛选都具有重要意义。

Description

具有温敏和缓释功能的复合生物材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基础发育生物学以及生物医学工程领域，尤其是涉及一种具有温敏和缓释功能的复合生物材料及其制备方法和应用。
背景技术
脊髓损伤(SCI)是一种严重的疾病，SCI首先导致中枢神经系统的细胞死亡，包括神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞和内皮细胞。特别是，对长轴突投射的损害会导致大脑和身体其他部位之间信息传递的下行和上行环路中断，继而导致严重的运动、感觉和自主神经功能障碍，甚至引起下肢的完全瘫痪。据估计，全世界有300万人患有脊髓损伤(SCI)，并且每年报告约180 000例新病例。以运动训练为基础的疗法是临床上主要用来促进康复的医学方法。但是目前，脊髓损伤还没有有效的治疗方法，脊髓完全损伤仍然是极具挑战的科学难题。神经干细胞可以提供组织特异性的发育微环境，在重建受损的神经回路和轴突再生方面有巨大的潜力。其中，3D脊髓类器官的诱导作为目前的研究热点也是难点，将使人们更好地理解脊髓的发育，并有助于制备有效的脊髓离体疾病模型。
近年来，随着细胞重编程技术的引入，干细胞的制备技术已经有了较大的突破，在这一过程中，成熟的体细胞可以转化为多能干细胞，称为人诱导多能干细胞(Humaninduced pluripotent stem cells，hiPSCs)。为了治疗脊髓相关疾病，包括脊髓损伤(SCI)，肌萎缩侧索硬化(ALS)等，迫切的需要制备具有人3D背腹侧结构的脊髓组织用于基础和再生医学研究，以及药物筛选。Jun Takahashi等人(Development,2018,145,dev162214)在2018年发表的工作中描述了一种制备脊髓类器官的方法，从人多能干细胞分别诱导了背侧和腹侧脊髓样3D组织。证明了通过激活Shh信号，可以成功诱导中间和腹侧脊髓样组织。在Jimena Andersen等人(Cell,2020,183,1913-1929)发表在《Cell》的文章中，也制备了3D脊髓类器官，并且实现了和皮层类器官、3D肌肉组织的功能连接。然而在他们的工作中，还依然存在未解决的问题：①Takahashi等人虽然分别诱导了脊髓的背侧和腹侧样组织，但没有完整的脊髓结构，更没有严格背侧和腹侧的空间分布。Jimena Andersen等人诱导的类器官只有腹侧结构没有背侧结构。②脊髓类器官在长期培养时，中间部位容易坏死，类器官容易崩解。③在Jimena Andersen的工作中，脊髓类器官的单细胞测序结果是与小鼠胚胎相比较，尚未证实其与人脊髓发育结构的一致性。造成以上缺陷的主要原因是以上方法中诱导脊髓发育信号分子不具有严格的背腹侧空间分布，诱导过程中也没能建立背腹侧信号分子的浓度梯度。
综上，目前还没有成功制备具有背腹侧结构的3D脊髓类器官方案。
发明内容
为了获得具有完整3D背腹侧脊髓类器官，本发明提供一种具有温敏和缓释功能的复合生物材料及其制备方法和应用。
所述应用主要是指利用具有温敏和缓释功能的复合生物材料来制备具有背腹侧结构的脊髓类器官的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的第一个目的在于，提供一种多孔壳聚糖微球，制备方法为：
①利用微乳法和低温热诱导相分离方法，将高分子量的壳聚糖溶解在乙酸溶液中形成壳聚糖溶液，作为分散相；
②将表面活性剂司班80和吐温20配制为连续相；
③将分散相滴加到连续相中，搅拌形成乳化状液体；
④将乳化状液体放置冻存后，将固定的微球分散；
⑤加入氢氧化钠的乙醇/水溶液，搅拌后收集微球。
在本发明的一个实施方式中，还包括：⑥收集好的微球多次清洗、浸泡两天以上，再灭菌处理。
在本发明的一个实施方式中，本发明提供了一种具体的制备多孔壳聚糖微球的方法，包括以下步骤：
①利用微乳法和低温热诱导相分离方法，将高分子量的壳聚糖溶解在1％的乙酸溶液中形成壳聚糖溶液，浓度为10mg/ml，作为分散相溶液；
②将表面活性剂司班80和吐温20按照质量比为4.8:0.2的比例滴加到石油醚中，表面活性剂和石油醚(沸点≥60℃)的质量比为45:5，配置好的溶液为连续相；
③将分散相按照体积比为1:5的量缓慢滴加到连续相中，在磁力搅拌器上搅拌3小时形成乳化状液体(40℃，700rpm)；
④将乳化液放置-20℃冻存3.5-5小时后，用磁力搅拌器缓慢将固定的微球分散(2min,200rpm)；
⑤加入100ml氢氧化钠的乙醇/水溶液(氢氧化钠浓度为10mg/ml，无水乙醇：水＝14:1)，缓慢搅拌后收集微球；
⑥收集好的微球通过无水乙醇多次清洗、浸泡两天以上，再用紫外照射30min灭菌。
本发明采用微乳法和低温热诱导相分离法相结合的方法来制备获得多孔壳聚糖微球，技术改进后合成的多孔壳聚糖微球尺寸均一、表面规则。
本发明的第二个目的在于，提供一种具有温敏和缓释功能的复合生物材料，制备方法为：将脊髓腹侧化的信号因子SAG装载到多孔壳聚糖微球内，再在其表面包被一层具有温敏特性的基质胶Geltrex，形成具有温敏和缓释功能的复合材料。
在本发明的一个实施方式中，脊髓腹侧化的信号因子SAG与多孔壳聚糖微球之间的比例关系为：30-40个微球加入10μl浓度为0.1mM的SAG。
在本发明的一个实施方式中，基质胶Geltrex与SAG溶液的体积比为4:1。
在本发明的一个实施方式中，具有温敏和缓释功能的复合生物材料的制备方法为：
①将灭好菌的多孔壳聚糖微球用PBS清洗5遍以上。
②在冰上加入浓度为0.1mM的SAG，30-40个微球加入10μl SAG，用枪头轻轻将它们混匀，放在4℃冰箱存放12h。
③在冰上加入原液Geltrex，Geltrex与SAG溶液的比例为4:1，用枪头轻轻混匀后放在37℃存放30min。
本发明在制备具有温敏和缓释功能的复合生物材料时，先将需要释放的诱导因子SAG装载到多孔壳聚糖微球中，在低温环境下将多孔壳聚糖微球浸泡在高浓度的Geltrex和脊髓腹侧化诱导信号分子SAG中，再将其升温，使Geltrex成凝胶状，进而SAG被包裹在多孔壳聚糖微球孔内，即为具有温敏和缓释功能的复合生物材料。包被后的微球表面变得光滑，尺寸无明显变化(图1F-G)，细胞粘附性明显增加。
本发明的第三个目的在于，提供一种具有温敏和缓释功能的复合生物材料，采用上述制备方法获得。
本发明的第四个目的在于，提供一种具有温敏和缓释功能的复合生物材料的应用，具有温敏和缓释功能的复合生物材料作为体外制备3D脊髓类器官的内核支架。
在本发明的一个实施方式中，具有温敏和缓释功能的复合生物材料作为体外制备3D脊髓类器官的内核支架，进行具有背腹侧结构的3D脊髓类器官的体外制备，包括以下步骤：
将人多能胚胎干细胞接种在具有温敏和缓释功能的复合生物材料表面，使其聚合成细胞球；
在第7天时加入原液Geltrex包埋每个细胞球，待Geltrex完全成胶状后加入培养基培养，在不同培养时期添加不同的神经诱导因子，诱导脊髓类器官建成。
在本发明的一个实施方式中，在培养过程中，
第1周使用LDN193189+SB431542+CHIR99021+bFGF促进神经管分化和神经细胞增值，第2周开始更换神经元培养基并加入脊髓尾侧化诱导因子RA；复合材料中释放的SAG诱导脊髓腹侧化以及同时给予诱导因子BMP4进行背侧化诱导脊髓类器官建成(具体培养方案见图2B)。
在本发明的一个实施方式中，在培养过程中，
第1天到第7天使用的培养基：SRM+100nM LDN193189+10μM SB431542+3μMCHIR99021+20ng/ml bFGF
第8天到第10天使用的培养基：Nurobasal+2％B27+20ng/ml bFGF+100nM RA第11天到第21天使用的培养基：Nurobasal+2％B27+15ng/ml BMP4
第22天以后使用的培养基：Nurobasal+2％B27+20ng/ml GDNF+20ng/ml BDNF+200μM Vc。
在本发明的一个实施方式中，在本发明的一个实施方式中，具有温敏和缓释功能的复合生物材料作为体外制备3D脊髓类器官的内核支架，进行具有背腹侧结构的3D脊髓类器官的体外制备的具体方法为：
①体外2D培养人胚胎干细胞H9，培养基使用商业化E8培养基
②待细胞长满后，用胰蛋白酶TrypLE将细胞消化，终止液使用DMEM+10％FBS，离心后去掉上清液，加入SRM培养基(DMEM+20％KSR+1％Glutmax+10μMβ-mercaptoethanol)。
③将制备好的具有温敏和缓释功能的复合生物材料用剪去尖端并且刨光后的枪头转移到低吸附圆底96孔板中，加入200μl SRM培养基。
④每个孔加入约2x105个细胞，轻轻吹打混匀，再加入浓度为10μM的Y27632。放置在5％CO2培养箱中，每两天换一次新鲜培养液。
⑤第7天时，将96孔板中形成的细胞球转移到低吸附6cm培养皿中，吸掉多余的培养基，加入15μl原液Geltrex包埋每个细胞球，在37℃培养箱中加热5-10min，待Geltrex完全成胶状后加入6ml Nurobasal+2％B27培养基。
⑥第10天时，将每个细胞球分别转移到24孔培养皿中，各500μl Nurobasal+2％B27培养基，进行培养，得到具有背腹侧结构的3D脊髓类器官。
各阶段使用的培养基和诱导因子如下(图2B)：
第1天到第7天使用的培养基：SRM+100nM LDN193189+10μM SB431542+3μMCHIR99021+20ng/ml bFGF
第8天到第10天使用的培养基：Nurobasal+2％B27+20ng/ml bFGF+100nM RA
第11天到第21天使用的培养基：Nurobasal+2％B27+15ng/ml BMP4
第22天以后使用的培养基：Nurobasal+2％B27+20ng/ml GDNF+20ng/ml BDNF+200μM Vc。
与现有技术相比，本发明技术方案的主要创新以及技术原理如下：
1.壳聚糖是一种具有良好生物安全性且可降解的生物材料，在过去的研究中，被广泛用在生物医药领域。在组织工程应用中，常被用作装载小分子药物的载体。通常使用交联剂制备的壳聚糖微球具有毒性不适用于干细胞的生长。本发明制备的多孔壳聚糖微球采用微乳法和低温热诱导相分离法相结合，技术改进后合成的多孔壳聚糖微球尺寸均一、表面规则(图1B)。尺寸在400-600μm之间，孔径大约15±5μm(图1C-E)。单个微球既可用作内核支架，支撑类器官的生长，也可作为缓释载体，释放诱导因子调控干细胞分化过程。
2.Geltrex是一种商业化的用于干细胞培养的基质胶，它具有良好的生物活性和温敏特性，通常用于干细胞的2D培养，为干细胞生长提供可靠的微环境。壳聚糖微球表面不具有细胞粘附性，不能直接用于干细胞的培养。Geltrex在低温下的状态为液体，而升温后不可逆的形成凝胶状。这种方法可以增加单一壳聚糖微球的细胞黏附性以及用于小分子药物装载。
3.本发明提供的复合材料将多孔壳聚糖和温敏的Geltrex相结合。具体实施如下：先将需要释放的诱导因子提前装载到多孔壳聚糖微球中，在低温环境下使多孔壳聚糖微球浸泡在高浓度的Geltrex和脊髓腹侧化诱导信号分子SAG中，再将其升温，使Geltrex成凝胶状，进而SAG被包裹在多孔壳聚糖微球孔内(图1A)。包被后的微球表面变得光滑，尺寸无明显变化(图1F-G)，细胞粘附性明显增加。
4.在脊髓发育过程中，两个组织中心决定脊髓神经祖细胞的空间特性。其中一个组织中心是顶端(RP)，它位于背侧，通过产生骨形态发生蛋白(BMPs)和骨形成蛋白(Wnts)来诱导背侧祖细胞结构域。另一个组织中心是尾端(FP)，它位于腹侧，通过产生Shh诱导腹侧前体细胞结构域。在这两个形态发生组织中心的帮助下，沿着背腹轴生成了6个离散的背侧祖结构域和5个腹侧祖结构域，并从特定的前体细胞结构域生成了各种亚类的脊髓中间神经元和运动神经元(示意如图2A)。本发明将模拟这一脊髓发育模式。具体诱导模式如下：1、缓释SAG功能的复合生物微球制备，通过微乳法和低温相诱导分离法相结合制备多孔壳聚糖微球，再通过温度变化引起的Geltrex凝胶化将SAG装载到其中；2、将人多能胚胎干细胞接种在复合微球表面，在低吸附圆底96孔培养皿中使其聚合成细胞球；3、在不同培养时期添加不同的神经诱导因子，第1周使用LDN193189+SB431542+CHIR99021+bFGF促进神经管分化和神经细胞增值，第2周开始更换神经元培养基并加入脊髓尾侧化诱导因子RA；复合材料中释放的SAG诱导脊髓腹侧化以及同时给予诱导因子BMP4进行背侧化诱导脊髓类器官建成(具体培养方案见图2B)。
该技术制备的脊髓类器官具有明显的背腹侧结构(图2，3)，可用来进行脊髓损伤后移植治疗，3D脊髓组织模型建立。将在药物筛选，脊髓相关疾病的治疗方面展示重要的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中复合材料的制备方法和相关表征，以及实施例2中复合材料的缓释曲线图。
图1A为本发明中复合材料的制备方法流程图；
图1B为多孔壳聚糖微球的宏观分布图；
图1C为多孔壳聚糖微球的低倍镜扫描电镜图；
图1D为多孔壳聚糖微球的高倍镜扫描电镜图；
图1E为多孔壳聚糖微球的相差显微镜图(标尺＝400μm)；
图1F为包被了Geltrex的微球低倍镜扫描电镜图；
图1G为包被了Geltrex的微球高倍镜扫描电镜图；
图1H为包被了Geltrex的微球相差显微镜图(标尺＝400μm)；
图1I为多孔壳聚糖微球的孔径分布图；
图1J为本发明实施例2中的SAG缓释曲线图。
图2为本发明实施例3中脊髓类器官在第21天的结构模式图以及免疫染色鉴定结果图。
图2A为脊髓的祖细胞结构域分布及代表性标记物分布示意图；
图2B为脊髓类器官诱导方案；
图2C为基于材料的脊髓类器官在生长过程中第1天的相差显微镜图像；
图2D为对照脊髓类器官在生长过程中第21天的相差显微镜图像；
图2E为基于材料的脊髓类器官在生长过程中第21天的相差显微镜图像；
图2F为本发明实施例3中MAP2/NKX6.1的染色鉴定结果；
图2G为本发明实施例3中OLIG2/NKX6.1的染色鉴定结果；
图2H为本发明实施例3中PAX6/NKX6.1的染色鉴定结果；
图2I为本发明实施例3中OLIG3/TUJ1的染色鉴定结果；
图2J为本发明实施例3中OLIG3/NKX6.1的染色鉴定结果；
图3为本发明实施例4中脊髓类器官在第42天的结构模式图以及免疫染色鉴定结果图。
图3A为脊髓的神经细胞分布及代表性标记物空间分布示意图；
图3B为培养5周脊髓类器官的体视镜观察图；
图3C为培养10周脊髓类器官的体视镜观察图；
图3D为本发明实施例4中MAP2/ChAT的单通道MAP2染色鉴定结果；
图3E为本发明实施例4中MAP2/ChAT的单通道ChAT染色鉴定结果；
图3F为本发明实施例4中MAP2/ChAT的染色鉴定结果；
图3G为本发明实施例4中MAP2/HB9的单通道MAP2染色鉴定结果；
图3H为本发明实施例4中MAP2/HB9的单通道HB9染色鉴定结果；
图3I为本发明实施例4中MAP2/HB9的染色鉴定结果；
图3J为本发明实施例4中MAP2/GAD67的染色鉴定结果；
图3K为本发明实施例4中MAP2/VGLUT1的染色鉴定结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
1、多孔壳聚糖微球的制备
①利用微乳法和低温热诱导相分离方法，将高分子量的壳聚糖溶解在1％的乙酸溶液中形成壳聚糖溶液，浓度为10mg/ml，作为分散相。
②将表面活性剂司班80和吐温20按照质量比为4.8:0.2的比例滴加到石油醚中，表面活性剂和石油醚(沸点≥60℃)的质量比为45:5，配置好的溶液为连续相。
③将分散相按照体积比为1:5的量缓慢滴加到连续相中，在磁力搅拌器上搅拌3小时形成乳化状液体(40℃，700rpm)。
④将乳化液放置-20℃冻存3.5-5小时后，用磁力搅拌器缓慢将固定的微球分散(2min,200rpm)。
⑤加入100ml氢氧化钠的乙醇/水溶液(氢氧化钠浓度为10mg/ml，无水乙醇：水＝14:1)，缓慢搅拌后收集微球。
⑥收集好的微球通过无水乙醇多次清洗、浸泡两天以上，再用紫外照射30min灭菌。
2、具有温敏和缓释功能的复合生物材料的制备
①将灭好菌的多孔壳聚糖微球用PBS清洗5遍以上。
②在冰上加入浓度为0.1mM的脊髓腹侧化的信号因子SAG，30-40个微球加入10μlSAG，用枪头轻轻将它们混匀，放在4℃冰箱存放12h。
③在冰上加入具有温敏特性的基质胶Geltrex原液，Geltrex与SAG溶液的比例为4:1，用枪头轻轻混匀后放在37℃存放30min，得到具有温敏和缓释功能的复合生物材料。
3、具有背腹侧结构的3D脊髓类器官的体外制备
①体外2D培养人胚胎干细胞H9，培养基使用商业化E8培养基
②待细胞长满后，用胰蛋白酶TrypLE将细胞消化，终止液使用DMEM+10％FBS，离心后去掉上清液，加入SRM培养基(DMEM+20％KSR+1％Glutmax+10μMβ-mercaptoethanol)。
③将制备好的具有温敏和缓释功能的复合生物材料用剪去尖端并且刨光后的枪头转移到低吸附圆底96孔板中，加入200μl SRM培养基。
④每个孔加入约2x105个细胞，轻轻吹打混匀，再加入浓度为10μM的Y27632。放置在5％CO2培养箱中，每两天换一次新鲜培养液。
⑤第7天时，将96孔板中形成的细胞球转移到低吸附6cm培养皿中，吸掉多余的培养基，加入15μl原液Geltrex包埋每个细胞球，在37℃培养箱中加热5-10min，待Geltrex完全成胶状后加入6ml Nurobasal+2％B27培养基
⑥第10天时，将每个细胞球分别转移到24孔培养皿中，各500μl Nurobasal+2％B27培养基，进行培养，得到具有背腹侧结构的3D脊髓类器官。
其中，人胚胎干细胞H9可以通过商用途径购买获得(WiCell,WA09)。
各阶段使用的培养基和诱导因子如下(图2B)：
第1天到第7天使用的培养基：SRM+100nM LDN193189+10μM SB431542+3μMCHIR99021+20ng/ml bFGF
第8天到第10天使用的培养基：Nurobasal+2％B27+20ng/ml bFGF+100nM RA
第11天到第21天使用的培养基：Nurobasal+2％B27+15ng/ml BMP4
第22天以后使用的培养基：Nurobasal+2％B27+20ng/ml GDNF+20ng/ml BDNF+200μM Vc。
实施例2
体外验证实施例1中制备的具有温敏和缓释功能的复合生物材料的缓释功能
实验方法
①将制备好的温敏复合缓释材料放置在盛放了PBS的2ml离心管中(20个复合微球，2ml PBS)，模拟细胞生长环境的温度、湿度，将2ml离心管放置在37℃培养箱。从第0天开始，每两天取200μl液体并做好标记，再加入200μl新的PBS于离心管中。
②配置标准的不同浓度SAG的PBS溶液，通过紫外分光度计测量SAG的紫外吸收波长与吸收值，并计算吸收值-浓度线性关系。
③收集好的溶液通过紫外分光度计测量紫外吸收峰值。
④绘制释放曲线
实验结果
SAG的释放曲线如附图1J所示，第0天时溶液中带有少量的SAG，随着时间的增加，SAG浓度逐渐升高，在第10天时达到峰值，约19.5nM。随后SAG释放量变低或停止。这与计划的体外脊髓发育模式基本保持一致。
实施例3
通过免疫染色验证实施例1中构建的3D脊髓类器官在第21天时的脊髓干/祖细胞种类和分布
实验方法
①将第21天的脊髓类器官经过4％PFA固定30min，30％蔗糖溶液脱水过夜以及OCT混合物(optimal cutting temperature compound)包埋后进行切片，贴在病理防脱粘附载玻片上，进行后续免疫染色。
②选择类器官中间部分的切片在37℃干燥箱中放置过夜，再在60℃烘箱中放置4h。将载玻片浸泡在煮沸后的抗原修复液中，在98℃的水浴锅中恒温30min。
③将浸泡着载玻片的抗原修复液静置在泡沫箱中使其缓慢降温，约3h左右。随后进行免疫染色。
④载玻片用PBS清洗后，用组化笔画圈、加入50μl 3％BSA+0.3％Triton封闭30min。
⑤按照OLIG3/NKX6.1、OLIG2/NKX6.1、PAX6/NKX6.1、MAP2/NKX6.1、OLIG3/TUJ1的抗体组合分别对5个切片样本进行染色，在4℃存放48h。
⑥在避光环境中加入荧光二抗和细胞核染料DAPI，1.5h后封片。在荧光共聚焦显微镜下观察细胞免疫染色情况。
实验结果
通过荧光共聚焦显微镜，五组免疫染色的结果如图2所示，代表腹侧祖细胞结构域的NKX6.1+细胞集中在内部，即靠近材料侧，而代表背侧祖细胞结构域的OLIG3+细胞主要分布在类器官外侧(图2J)。对比脊髓祖细胞分布模式图(图2A)，染色结果显示PAX6+细胞广泛分布在内外侧(图2H)；OLIG2+细胞集中分布在腹侧的NKX6.1+祖细胞区域(图2G)。MAP2+和TUJ1+表明第21天具有大量神经元产生(图2F、图2I)。
实施例4
通过免疫染色验证实施例1中构建的3D脊髓类器官在第42天时的细胞种类和分布。
实验方法
①类器官的固定、脱水、包埋与切片与实施例3中的方法一致。
②载玻片用PBS清洗后，用组化笔画圈、加入50μl 3％BSA+0.3％Triton封闭30min。
③按照MAP2/CHAT、MAP2/HB9、MAP2/GAD67、MAP2/VGLUT1的抗体组合分别对4个样本进行染色，在4℃存放48h。
④在避光环境中加入荧光二抗和细胞核染料DAPI，1.5h后封片。在荧光共聚焦显微镜下观察细胞免疫染色情况。
实验结果
通过荧光共聚焦显微镜，四组免疫染色的结果如图3所示。在第42天的免疫染色结果里发现有明显的HB9+细胞，表明由SAG诱导的腹侧神经祖细胞开始发育成前体运动神经元(图3G-I)。代表成熟运动神经元的ChAT+信号呈明显的腹角形态并且主要分布在靠近材料微球侧，表明在诱导的类器官发育形成了比较典型的腹角结构(图D-F)。此外，在脊髓类器官检测到大量的GAD67+抑制性神经元和VGLUT1+兴奋性神经元，表明本方法成功的诱导出具有空间结构和主要神经元亚型的脊髓类器官(图3J、3K)。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有温敏和缓释功能的复合生物材料的制备方法，其特征在于，将脊髓腹侧化的信号因子SAG装载到多孔壳聚糖微球内，再在其表面包被一层具有温敏特性的基质胶Geltrex，形成具有温敏和缓释功能的复合材料。
2.根据权利要求1所述一种具有温敏和缓释功能的复合生物材料的制备方法，其特征在于，多孔壳聚糖微球的制备方法包括以下步骤：
①利用微乳法和低温热诱导相分离方法，将高分子量的壳聚糖溶解在1％乙酸溶液中形成壳聚糖溶液，作为分散相；
②将表面活性剂司班80和吐温20配制为连续相；
③将分散相滴加到连续相中，搅拌形成乳化状液体；
④将乳化状液体放置冻存后，将固定的微球分散；
⑤加入氢氧化钠的乙醇/水溶液，搅拌后收集微球。
3.根据权利要求1所述一种具有温敏和缓释功能的复合生物材料的制备方法，其特征在于，脊髓腹侧化的信号因子SAG与多孔壳聚糖微球之间的比例关系为：30-40个微球加入10μL浓度为0.1mM的SAG。
4.根据权利要求1所述一种具有温敏和缓释功能的复合生物材料的制备方法，其特征在于，基质胶Geltrex与SAG溶液的体积比为4:1。
5.根据权利要求1所述一种具有温敏和缓释功能的复合生物材料的制备方法，其特征在于，具有温敏和缓释功能的复合生物材料的制备方法为：
①将灭好菌的多孔壳聚糖微球用PBS清洗5遍以上；
②在冰上加入浓度为0.1mM的SAG，30-40个微球加入10μL SAG，用枪头轻轻将它们混匀，放在4℃冰箱存放12h；
③在冰上加入原液Geltrex，Geltrex与SAG溶液的比例为4:1，混匀后放在37℃存放30min。
6.权利要求1-5中任一项所述制备方法制备得到的具有温敏和缓释功能的复合生物材料。
7.根据权利要求6所述具有温敏和缓释功能的复合生物材料的应用，其特征在于，具有温敏和缓释功能的复合生物材料作为体外制备3D脊髓类器官的内核支架。
8.根据权利要求7所述具有温敏和缓释功能的复合生物材料的应用，其特征在于，具有温敏和缓释功能的复合生物材料作为体外制备3D脊髓类器官的内核支架，进行具有背腹侧结构的3D脊髓类器官的体外制备，包括以下步骤：
将人多能胚胎干细胞接种在具有温敏和缓释功能的复合生物材料表面，使其聚合成细胞球；
在第7天时加入原液Geltrex包埋每个细胞球，待Geltrex完全成胶状后加入培养基培养，在不同培养时期添加不同的神经诱导因子，诱导脊髓类器官建成。
9.根据权利要求7所述具有温敏和缓释功能的复合生物材料的应用，其特征在于，在培养过程中，第1周使用LDN193189+SB431542+CHIR99021+bFGF促进神经管分化和神经细胞增殖，第2周开始更换神经元培养基并加入脊髓尾侧化诱导因子RA；复合材料中释放的SAG诱导脊髓腹侧化以及同时给予诱导因子BMP4进行背侧化诱导脊髓类器官建成。
10.根据权利要求7所述具有温敏和缓释功能的复合生物材料的应用，其特征在于，在培养过程中，
第1天到第7天使用的培养基：SRM+100nM LDN193189+10μM SB431542+3μM CHIR99021+20ng/mLbFGF；
第8天到第10天使用的培养基：Nurobasal+2％B27+20ng/mLbFGF+100nM RA；
第11天到第21天使用的培养基：Nurobasal+2％B27+15ng/mLBMP4；
第22天以后使用的培养基：Nurobasal+2％B27+20ng/mL GDNF+20ng/mL BDNF+200μMVc。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116899018B (zh) * 2023-09-13 2023-12-12 四川大学 E7多肽-明胶纳米纤维微球支架及其制备方法和应用

Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007016122A2 (en) * 2005-07-27 2007-02-08 Cook Incorporated Implantable remodelable materials comprising magnetic material
EP1904114A2 (en) * 2005-05-19 2008-04-02 Albiorex, LLC Terminal sterilization of injectable collagen products
CN101766837A (zh) * 2009-12-28 2010-07-07 中国人民解放军第二炮兵总医院 仿生多孔微球组织工程支架及其制作方法
CN101928355A (zh) * 2010-08-25 2010-12-29 深圳清华大学研究院 一种氨基化海藻酸及其制备方法
CN103816570A (zh) * 2014-01-28 2014-05-28 浙江大学 一种丝素蛋白/干细胞复合微球及应用
CN104226209A (zh) * 2013-06-09 2014-12-24 冯淑芹 一种双层温敏凝胶微球及制备方法
CN104436306A (zh) * 2014-11-11 2015-03-25 四川大学 一种细胞-凝胶材料复合微球及其制备方法和应用
CN104722251A (zh) * 2015-04-23 2015-06-24 福建师范大学 一种壳聚糖基多孔微球的制备方法
CN108310470A (zh) * 2018-03-02 2018-07-24 南方医科大学 一种缓控释氧微球及其制备方法和用途
CN108752530A (zh) * 2018-05-09 2018-11-06 同济大学 可负载细胞的温敏性水凝胶材料、温敏性水凝胶及其制备方法与应用
CN110522946A (zh) * 2019-09-20 2019-12-03 浙江瑞谷生物科技有限公司 一种载rhBMP-2的骨修复材料微球及其制备方法
CN111303347A (zh) * 2020-03-12 2020-06-19 蚌埠学院 一种核-壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球的制备方法
CN111298195A (zh) * 2019-11-13 2020-06-19 长春圣博玛生物材料有限公司 一种复合微米材料、皮肤填充剂及其制备方法和应用
CN111921012A (zh) * 2020-08-03 2020-11-13 北京华龛生物科技有限公司 一种三维多孔微载体支架及其采用离子型添加剂制备的方法

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1904114A2 (en) * 2005-05-19 2008-04-02 Albiorex, LLC Terminal sterilization of injectable collagen products
WO2007016122A2 (en) * 2005-07-27 2007-02-08 Cook Incorporated Implantable remodelable materials comprising magnetic material
CN101766837A (zh) * 2009-12-28 2010-07-07 中国人民解放军第二炮兵总医院 仿生多孔微球组织工程支架及其制作方法
CN101928355A (zh) * 2010-08-25 2010-12-29 深圳清华大学研究院 一种氨基化海藻酸及其制备方法
CN104226209A (zh) * 2013-06-09 2014-12-24 冯淑芹 一种双层温敏凝胶微球及制备方法
CN103816570A (zh) * 2014-01-28 2014-05-28 浙江大学 一种丝素蛋白/干细胞复合微球及应用
CN104436306A (zh) * 2014-11-11 2015-03-25 四川大学 一种细胞-凝胶材料复合微球及其制备方法和应用
CN104722251A (zh) * 2015-04-23 2015-06-24 福建师范大学 一种壳聚糖基多孔微球的制备方法
CN108310470A (zh) * 2018-03-02 2018-07-24 南方医科大学 一种缓控释氧微球及其制备方法和用途
CN108752530A (zh) * 2018-05-09 2018-11-06 同济大学 可负载细胞的温敏性水凝胶材料、温敏性水凝胶及其制备方法与应用
CN110522946A (zh) * 2019-09-20 2019-12-03 浙江瑞谷生物科技有限公司 一种载rhBMP-2的骨修复材料微球及其制备方法
CN111298195A (zh) * 2019-11-13 2020-06-19 长春圣博玛生物材料有限公司 一种复合微米材料、皮肤填充剂及其制备方法和应用
CN111303347A (zh) * 2020-03-12 2020-06-19 蚌埠学院 一种核-壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球的制备方法
CN111921012A (zh) * 2020-08-03 2020-11-13 北京华龛生物科技有限公司 一种三维多孔微载体支架及其采用离子型添加剂制备的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
壳聚糖基多孔微球的制备及其止血性能的研究;李济祥;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)工程科技Ⅰ辑》;20170515;第B014-181页 *

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