CN116899018B - E7多肽-明胶纳米纤维微球支架及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种E7多肽‑明胶纳米纤维微球支架及其制备方法和应用，涉及牙周组织再生支架技术领域。该材料包括明胶纳米纤维微球，E7多肽共轭结合至明胶纳米纤维微球的表面形成E7多肽‑明胶纳米纤维微球支架。本发明的支架能够选择性地增强骨髓间充质干细胞和牙周膜干细胞的粘附，同时能够抑制牙龈成纤维细胞和牙龈上皮细胞的粘附。通过逆转自发的细胞生长/占位顺序，本发明的E7多肽‑明胶纳米纤维支架促进了间充质干细胞对牙周缺损的占领，导致牙周再生的明显改善。解决了传统的牙周组织再生技术适应症有限，无法有效恢复牙周组织生理性支撑功能的问题。

Description

E7多肽-明胶纳米纤维微球支架及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及牙周组织再生支架技术领域，尤其是涉及一种E7多肽-明胶纳米纤维微球支架及其制备方法和应用。
背景技术
牙周炎是最常见的口腔疾病，牙周炎引起的牙周支持组织丧失是导致成年人牙齿缺失的最主要原因，严重影响了人们的生活质量，造成严重的疾病负担。
常规的牙周炎治疗方法是通过洗牙、牙根平整或翻瓣手术等手段，彻底清除局部牙菌斑、牙石等致病因素，消除炎症，最终达到延缓或阻止疾病进展的目的。但是，对于已经引起牙周缺损的牙周炎患者，常规治疗方法难以获得有效的牙周组织再生，牙周组织的支撑功能仍然受损，不利于疗效的长期稳定性。
临床治疗需要采用牙周再生技术来重建缺损的牙周结构并恢复其支持功能。牙周组织再生的主要细胞来源有四种：牙龈上皮细胞、牙龈成纤维细胞、牙周膜干细胞和从附近的牙槽窝或血管动员的间充质干细胞。根据竞争性占位理论，在牙周缺损的自然愈合过程中，牙龈上皮细胞和成纤维细胞首先迁移至缺损区，并在缺损处牙根表面形成长结合上皮或纤维结缔组织附着，阻止牙周膜干细胞和间充质干细胞迁移到缺损处形成功能性牙周组织，从而无法重建缺失的牙周组织，如图1A所示。
引导组织再生（GTR）是目前临床实践中最常用的牙周组织再生技术，GTR技术应用屏障膜覆盖牙周缺损，以防止牙龈上皮细胞和成纤维细胞向牙周缺损区域内部生长，并为牙周膜干细胞和间充质干细胞的向内迁移提供封闭空间，如图1B所示。通过为牙周膜干细胞和间充质干细胞创造迁移、增殖和分化的时间和空间，GTR在部分临床病例中取得了积极的临床效果。然而，GTR屏障膜的应用有其自身的局限性。屏障膜根据生物降解性分为不可吸收膜和可吸收膜。其中不可吸收膜临床操作简易，具有足够的机械强度来维持牙周缺损的空间，但需要进行二次手术来移除膜片，给患者造成二次创伤，并且二次手术增加了局部感染的风险，易导致再生组织暴露，影响疗效。对于可吸收膜，虽然避免了二次手术，但是膜的力学性能较差，影响其维持空间的能力，容易塌陷移位，通常需要与植骨材料结合使用。尽管临床实践已采用各种措施努力克服上述缺点，但GTR的适应症非常有限，主要应用于窄而深的骨下袋缺损和下颌磨牙II类根分叉缺损；当牙周缺损较大或缺损形态欠佳时，往往无法获得有效的牙周再生，这严重阻碍了其临床应用。因此，探索稳定、有效的牙周组织再生技术，恢复牙周组织的生理性支撑功能，是牙周临床实践亟待攻克的难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种E7多肽-明胶纳米纤维微球支架及其制备方法和应用，以解决现有技术中存在的牙周组织再生技术适应症有限，无法有效的恢复牙周组织的生理性支撑功能的技术问题。本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种E7多肽-明胶纳米纤维微球支架，所述支架包括明胶纳米纤维微球，所述E7多肽共轭结合至所述明胶纳米纤维微球的表面。第二方面，本发明提供了一种E7多肽-明胶纳米纤维微球支架的制备方法，包括如下步骤：
（1）制备明胶纳米纤维微球；
（2）制备E7多肽，并在E7多肽的羧基端引入半胱氨酸；将E7多肽溶解于二甲基亚砜中，得到E7多肽溶液；
（3）将所制备的明胶纳米纤维微球用含有NaCl的PBS溶液清洗后浸入磺基琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯溶液中，在室温下搅拌，然后用含EDTA的PBS溶液洗涤处理后的明胶纳米纤维微球，将洗涤后的明胶纳米纤维微球加入到E7多肽溶液中进行反应，以得到E7多肽-明胶纳米纤维微球支架。根据一种优选实施方式，在步骤（3）中，还包括：用含有0.15M NaCl，pH7.2的0.1M PBS溶液清洗5mg的明胶纳米纤维微球；将清洗后的明胶纳米纤维微球浸入1ml磺基琥珀酰亚胺-4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-甲酸酯溶液中，在室温下轻轻搅拌1小时，用含0.1M EDTA的pH7.0的PBS溶液洗涤处理过的明胶纳米纤维微球；
将上述明胶纳米纤维微球加入至1ml的E7多肽溶液中在室温下搅拌孵育1h；
用蒸馏水清洗E7多肽共轭的明胶纳米纤维微球，冻干保存。
根据一种优选实施方式，所述的制备明胶纳米纤维微球的步骤，还包括：（1）准备工作：将异丙醇和乙醇置于-80℃冰箱4h；将矿物油置于50℃预热1h；配置50%的乙醇溶液，备用；（2）将明胶溶解于上述步骤配置的50%的乙醇溶液中，加热至50℃，配置成12%的明胶溶液；（3）以800rmp转速搅拌矿物油，并将明胶溶液缓慢滴加进矿物油中，形成明胶/矿物油液滴；（4）将预冷的异丙醇、乙醇和室温二氧六环按照体积比为4：1：3比例配置成800ml混合有机溶剂，在低速搅拌状态下，将明胶/矿物油液滴乳化液倒入800ml预冷的有机溶剂中；通过低温相分离形成微球的纳米纤维结构；（5）待步骤（4）中的混合液恢复至室温，停止搅拌，将合成的明胶纳米纤维微球用20-300μm的金属筛转移至长柱状玻璃容器；（6）配置交联催化剂：将1g 2-吗啉乙磺酸、0.23g N-羟基琥珀酰亚胺和0.38g 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺溶解于20ml去离子水；（7）取2ml所配置的交联催化剂加入到50ml丙酮中，配置成4%的交联剂；（8）将步骤（7）中的交联剂加入到装有明胶纳米纤维微球的长柱状玻璃容器中，在4℃低速搅拌状态下交联48h，以合成稳定的微球纳米纤维结构；（9）待交联完成后，用20-300μm内多个不同尺寸的金属筛筛选出多种不同直径的微球，分装到15ml的离心管；（10）筛选后的不同直径的微球分别用乙醇和去离子水清洗；加入0.5 M的甘氨酸孵育3h，以中和未反应的交联剂；然后再分别用去离子水和乙醇清洗；（11）用二氧六环置换乙醇，在液氮中迅速冷冻，立即转移到真空低温冷冻干燥机，冷冻干燥；然后储存于密封袋，-20℃保存备用。
根据一种优选实施方式，所述的制备E7多肽，并在E7多肽的羧基端引入半胱氨酸，将E7多肽溶解于二甲基亚砜中，得到E7多肽溶液的步骤，还包括：通过固相多肽合成法在E7多肽的羧基端引入一个半胱氨酸，其中所述E7多肽的氨基酸序列为EPLQLKM，所述E7多肽溶液的浓度为2mg/ml。第三方面，本发明提供了如第一方面所述的E7多肽-明胶纳米纤维微球支架在治疗牙周缺损中的应用。
基于上述技术方案，本发明的E7多肽-明胶纳米纤维微球支架及其制备方法和应用至少具有如下技术效果：
本发明提供的一种E7多肽-明胶纳米纤维微球支架，包括明胶纳米纤维微球，E7多肽共轭结合至明胶纳米纤维微球的表面形成E7多肽-明胶纳米纤维微球支架。本发明的E7多肽-明胶纳米纤维微球支架能够选择性地增强骨髓间充质干细胞和牙周膜干细胞的粘附，同时抑制牙龈成纤维细胞和牙龈上皮细胞的粘附。通过逆转自发的细胞生长/占位顺序，本发明的E7多肽-明胶纳米纤维支架促进了间充质干细胞对牙周缺损的占领，使牙周再生明显改善。解决了传统的牙周组织再生技术适应症有限，无法有效的恢复牙周组织的生理性支撑功能的问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是牙周缺损的长结合上皮愈合和功能性牙周组织愈合的示意图；
图2是明胶纳米纤维微球（NFG-MS）和E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）的合成示意图；
图3是E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）的共聚焦图像；
图4是明胶纳米纤维微球（NFG-MS）和E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）的特征图；其中图4A为NFG-MS和E7-NFG-MS的SEM图像；图4B-4E为NFG-MS和E7-NFG-MS的孔隙率、表观密度、降解率和膨胀率图示，(*p<0.05，**p<0.01)；
图5是BMSCs、PDLSCs、GFs和GECs在NFG-MS和E7-NFG-MS上的粘附和铺展特征图；其中，图5A-5D为BMSCs、PDLSCs、GFs和GECs在NFG-MS和E7-NFG-MS上3h、6h和12h时的粘附和铺展特性的共聚焦图像，图5E为BMSCs、PDLSCs、GFs和GECs在NFG-MS和E7-NFG-MS上3h时的粘附率，图5F为BMSCs、PDLSCs、GFs和GECs在NFG-MS和E7-NFG-MS上12h的伸展面积；图5G-5J分别为BMSCs、PDLSCs、GFs和GECs在NFG-MS和E7-NFG-MS上3h、6h和12h时的伸展面积；
图6是BMSCs、PDLSCs、GFs和GECs在NFG-MS和E7-NFG-MS上的竞争性粘附图；“Seeding”为接种细胞，其中，图6A是流式细胞仪散点图显示BMSCs、PDLSCs、GFs和GECs的密度，图6B-6C为对BMSCs、PDLSCs、GFs和GECs的比例进行定量分析图。(*p<0.05， **p<0.01)；
图7是改良后的大鼠下颌骨牙周缺损模型的特征图；其中，图7A为大鼠下颌骨牙周缺损模型的照片，图7B为大鼠下颌第一磨牙的μ-CT重建图像，缺损模型中的颊根被移除，图7C为建立牙周缺损模型前后大鼠下颌骨的μ-CT重建图像，图7D-7F为建立牙周缺损模型前后大鼠下颌骨在冠状面、矢状面和水平面的灰度图像；
图8是术后8周，牙周缺损区的新生牙槽骨形成和牙周附着丧失图；图8A为Masson染色显示牙周缺损区的修复情况，图8B-8C为Masson染色和泛细胞角蛋白抗体（AE1/AE3）的IHC染色显示上皮附着和附着丧失，水平线垂直间距表示附着丧失的程度，图8D-8E为新生牙槽骨高度和附着缺失的定量分析图，(*p<0.05, **p<0.01)；
图9是术后8周，牙周缺损区的纤维组织形成图；图9A-9B为成纤维细胞标志物（ER-TR7）的IHC染色显示了牙周缺损区纤维组织的形成和分布，图9C-9D为纤维组织高度和新形成的功能性PDLC高度的定量分析，(*p<0.05, **p<0.01)；
图10是术后8周，牙周缺损区的功能性牙周组织形成图；Sirius Scarlet染色显示牙周缺损区的胶原纤维的分布和排列，其中，D：牙本质；C：牙骨质；P：牙周韧带；F：纤维组织；NB：新形成的骨；
图11是术后8周新形成的牙槽骨和牙根暴露的μ-CT分析图；图11A为大鼠下颌骨和新形成的骨的μ-CT重建图像。图11B为大鼠下颌骨第一磨牙和牙根周围新形成的骨的μ-CT重建图像，图11C-11D为第一磨牙远中根的冠状面和水平面的灰度图像，图11E-11G为新生骨量、牙根周围新骨的比例和牙根暴露长度的定量分析，(*p<0.05，**p<0.01)；
图12为本发明的E7多肽-明胶纳米纤维微球注射至牙周缺损区域后的效果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
牙周炎是人类最普遍的口腔疾病，其特点是牙周支持组织的破坏，是造成成人牙齿脱落的主要原因，对生活质量产生负面影响，并带来巨大的医疗经济负担。尽管引导组织再生（GTR）是目前临床上最常用的牙周组织再生技术，但它只能有效地治疗窄而深的骨内缺损。遗憾的是，对于其他类型的牙周缺损，仍然存在不可预测的结果。此外，即使有熟练的手术技巧，与GTR手术相关的并发症也很常见，并会对临床结果产生负面影响。
由于牙周组织复杂的解剖结构，牙周功能再生是一个非常具有挑战性的过程。参与牙周再生的细胞有四个主要来源：牙龈上皮细胞（GECs），牙龈成纤维细胞（GFs），牙周膜干细胞（PDLSCs）和骨髓间充质干细胞（BMSCs）。再生的结果依赖于这四种细胞的生长条件。在自发愈合中，GECs生长最快，首先附着在牙根表面，形成长的结合上皮，阻碍其他细胞附着在牙根表面，从而阻碍牙周再生的可能性，这是牙周愈合的最常见形式，如图1A。GFs的生长速度仅次于GECs，在接触牙根表面后形成纤维状愈合。PDLSCs的生长晚于GFs，但只有当PDLSCs首先占据牙根表面时，它们才能分化形成牙骨质细胞、牙周膜成纤维细胞和成骨细胞，在牙根表面沉积新的牙骨质，形成新的牙周韧带，并将其插入牙骨质和牙槽骨之间，这是功能性牙周组织再生的最佳方式，如图1B。BMSCs是最后一个迁移到缺损区的细胞类型，并分化为成骨细胞，形成新的牙槽骨。基于这一生物学原理，GTR技术利用屏障膜来阻止GECs和GFs向缺损区域迁移，同时为PDLSCs和BMSCs的内向迁移提供一个隐蔽的空间。
在本发明的研究中，也采用了临床GTR技术组，使用常用的生物可吸收胶原膜结合微球填充材料（Mem + MS）来治疗以非支撑性缺损为特征的改良牙周缺损模型。尽管有积极的效果，但是在实验操作中遇到了几个挑战，与GTR技术的临床应用中遇到的挑战相似。第一个问题与胶原膜的低机械强度和刚度有关。虽然柔软的屏障膜很容易与周围的骨组织形态贴合，但它也很容易皱缩、塌陷并占据缺损区域，阻碍牙周组织的生长。第二个问题是与牙周再生相比，膜的降解速度不等，胶原膜甚至在手术后8周仍保持其物理完整性。这种生物降解伴随着酶的活动和局部的炎症反应，可能会影响骨的重塑。第三个挑战是膜暴露的高发率，这是一个与GTR相关的主要临床并发症，发生在50%至100%的病例中。在本发明研究中，初级皮瓣闭合失败是膜暴露的主要原因，导致细菌入侵和伤口感染。由于附着在大鼠下颌牙冠上的牙龈组织相对较薄且脆弱，在缝合过程中牙龈撕裂，以及术后牙龈退缩和下颌骨运动引起的皮瓣移位的发生率很高。尽管采用了谨慎的缝合技术，但仍有可能出现膜暴露。为了确保客观评估GTR技术对牙周再生的影响，排除了发生并发症的样本。值得注意的是，与Mem + MS组相比，其他三组的并发症发生率，包括初级皮瓣闭合失败引起的感染，都明显较低。这一发现强调了GTR技术对手术操作和局部缺损环境方面的高要求，进一步强调了探索牙周再生替代技术的迫切性。
鉴于此，本发明提供了一种E7多肽-明胶纳米纤维微球作为间充质干细胞亲和性支架。这种支架可以选择性地促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）和牙周膜干细胞（PDLSCs）的粘附，同时抑制牙龈成纤维细胞（GFs）和牙龈上皮细胞（GECs）的粘附，以促进间充质干细胞对牙周缺损区域的占领，从而改善牙周再生。在本发明改良的大鼠牙周缺损模型中，证明了本发明的E7多肽-明胶纳米纤维微球支架在促进牙周再生方面比传统的GTR技术具有明显的优势。这种创新方法在促进功能性牙周组织的再生方面表现出更大的功效。
第一方面，本发明提供了一种E7多肽-明胶纳米纤维微球支架，包括明胶纳米纤维微球，E7多肽共轭结合至明胶纳米纤维微球的表面形成E7多肽-明胶纳米纤维微球支架。
本发明选择纳米纤维明胶微球作为牙周再生的支架是基于其独特的优势。一方面，这些微球完全由明胶纳米纤维组成，表现出与天然胶原纤维相匹配的尺寸尺度。它们具有极低的表观密度和高孔隙率，密切模拟了骨组织细胞外基质的有机化学成分和微物理结构。此外，它们还表现出良好的生物相容性、骨诱导性和骨传导性。此外，微球的低表观密度导致降解产物极少，而其高孔隙率为细胞生长和细胞外基质的沉积提供了充足的空间。另一方面，这些微球的可注射性使它们成为以微创方式填充不规则牙周缺损的最佳选择。与块状支架或水凝胶不同，微球之间相互连接的大孔有利于细胞迁移、增殖和血管向内生长，而微球中纳米纤维之间的微孔则促进细胞外基质的沉积，这对营养交换和清除代谢废物至关重要。这些特殊的性能，加上E7多肽的间充质干细胞亲和力，共同为牙周再生创造了一个最佳微环境。
本发明的E7多肽-明胶纳米纤维微球支架能够选择性地增强骨髓间充质干细胞和牙周膜干细胞的粘附，同时能够抑制牙龈成纤维细胞和牙龈上皮细胞的粘附。通过逆转自发的细胞生长占位顺序，本发明的E7多肽-明胶纳米纤维支架促进了间充质干细胞对牙周缺损的占领，导致牙周再生的明显改善。解决了传统的牙周组织再生技术适应症有限，无法有效的恢复牙周组织的生理性支撑功能的问题。
实施例
本发明提供的E7多肽-明胶纳米纤维微球支架的制备方法，如图2所示，具体如下：
1、制备明胶纳米纤维微球。
本发明的明胶纳米纤维微球的合成结合了水/油乳化和热诱导相分离技术，包括如下步骤：
（1）准备工作：（a）将异丙醇和乙醇置于-80℃冰箱预冷4h。（b）将矿物油置于50℃预热1h。（c）配置50%体积浓度的乙醇溶液。
（2）将1.2g明胶溶解于步骤（1）配置的50%的乙醇溶液中，加热至50℃，配置成10ml质量浓度为12%的明胶溶液；
（3）采用IKA®RW 20数字顶置搅拌器以800rmp转速搅拌矿物油，将10ml明胶溶液缓慢滴加进矿物油中，形成明胶/矿物油液滴，即水/油乳化状态。
（4）将预冷的异丙醇、乙醇和室温二氧六环以4：1：3体积比比例配置成800ml混合有机溶剂，在低速（300rmp）搅拌状态下，将步骤（3）的明胶/矿物油液滴乳化液迅速倒入800ml 预冷的有机溶剂，使明胶在低温下相分离形成纳米纤维微球，并且预冷的有机溶剂将明胶中的水溶液置换出来。
（5）待步骤（4）中的混合液恢复至室温，停止搅拌，将合成的明胶纳米纤维微球用20-300μm的金属筛转移至长柱状玻璃容器。
（6）配置交联催化剂：将1g 2-吗啉乙磺酸（MES）、0.23gN-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、0.38g （1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺）（EDC）溶解于20ml去离子水。
（7）取2ml步骤（6）配置的交联催化剂加入到50ml丙酮，配置成4%的交联剂。
（8）将步骤（7）的交联剂加入到步骤（5）装有纳米纤维微球的长柱状容器，在4℃，低速（300rmp）搅拌状态下交联48h，以维持并稳定合成微球的纳米纤维结构。
（9）交联完成后，用20-300μm内不同大小的金属筛（20-32μm，32-63μm，63-72μm，72-90μm，90-106μm，106-125μm，125-150μm，150-300μm）将不同直径的微球分别筛选分类，分装到15ml的离心管。
（10）筛选后的不同直径的微球用乙醇清洗3次，去离子水清洗3次；然后加入0.5 M的甘氨酸孵育3h，以中和未反应的交联剂；然后去离子水清洗3次，乙醇清洗三次。
（11）用二氧六环置换乙醇3次，在液氮中迅速冷冻，立即转移到真空低温冷冻干燥机，冷冻干燥一周；然后储存于密封袋，-20℃保存备用。
2、E7多肽共价结合到微球纳米纤维上。
间充质干细胞亲和肽E7（EPLQLKM）是用Fmoc化学法通过固相多肽合成法（Scilight-Peptide Inc.）在E7的羧基（C）端引入一个额外的半胱氨酸，以方便支架连接或罗丹明标记。E7多肽被溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，达到2mg/ml的储存浓度。
E7多肽与明胶纳米纤维微球（NFG-MS）的共轭是按照以下方法进行的：
首先，用含有0.15M NaCl，pH7.2的0.1M PBS（Thermo Fisher Scientific）清洗5mg明胶纳米纤维微球（NFG-MS）三次。
然后，将明胶纳米纤维微球（NFG-MS）浸入1ml磺基琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯(sulfo-SMCC, Thermo Fisher Scientific)溶液(2mg/ml)中，在室温下轻轻搅拌1小时。
用含0.1M EDTA的pH7.0的PBS溶液洗涤处理过的明胶纳米纤维微球（NFG-MS）三次后，在1ml E7多肽溶液（0.2mg/ml）中室温下轻轻搅拌孵育1小时。
然后用蒸馏水清洗E7多肽共轭的明胶纳米纤维微球三次，冻干并保存在4℃。
为了观察E7多肽在明胶纳米纤维微球（NFG-MS）上的结合和分布情况，用于制造明胶纳米纤维微球（NFG-MS）的明胶用荧光素-5-异硫氰酸酯（FITC）标记，E7多肽则用罗丹明标记。在E7多肽共轭后，用共聚焦激光扫描显微镜观察E7多肽-明胶纳米纤维微球。
如图3所示，本发明制备的E7多肽-明胶纳米纤维微球支架中E7多肽能够均匀地连接到明胶纳米纤维微球（NFG-MS）的外层。且本发明的E7多肽-明胶纳米纤维微球支架完全是由纳米纤维组成，如图4A所示，平均直径为230±42nm，与骨ECM中天然胶原纤维的直径范围相同。如图4B和4C所示，本发明的E7多肽-明胶纳米纤维微球支架具有93.2±0.1%的高孔隙率和0.092±0.001g/cm3的低表观密度，这为ECM的沉积和营养交换提供了足够的空间，并在微球用作注射支架时最大限度地降解副产物的产生。如图4D所示，E7多肽-明胶纳米纤维微球支架的降解速度比明胶纳米纤维微球稍慢，这可能是由于E7多肽-明胶纳米纤维微球中E7多肽覆盖了微球表面的酶降解位点。如图4E所示，E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS） 具有亲水性，平衡膨胀比超过 18。从而可以得到，本发明的E7多肽共轭结合至明胶纳米纤维的表面不会过多的影响明胶纳米纤维的结构、孔隙率和表观密度。
3、分离牙龈上皮细胞（GECs）、牙龈成纤维细胞（GFs）、牙周膜干细胞（PDLSCs）和骨髓间充质干细胞（BMSCs）。
用4周龄的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠来分离提取牙龈上皮细胞（GECs）、牙龈成纤维细胞（GFs）、牙周膜干细胞（PDLSCs）和骨髓间充质干细胞（BMSCs）。
本发明用2-4代的细胞进行后续实验。
将牙龈组织用聚维酮碘消毒两次，用PBS清洗，然后用dispase II（Sigma）孵化，以分离上皮组织和结缔组织。将上皮组织切成小块，在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM中培养，以促进牙龈上皮细胞（GECs）的向外迁移。通过在胶原酶（Sigma）中孵化，从结缔组织中分离出牙龈成纤维细胞（GFs），并在含有10% FBS的α-MEM中培养。
对于牙周膜干细胞（PDLSCs）的分离，大鼠磨牙的牙周组织用胶原酶和胰蛋白酶进行酶解，然后过滤并在添加有10%FBS的α-MEM中培养。骨髓间充质干细胞（BMSCs）是通过用α-MEM冲洗大鼠股骨和胫骨的骨髓腔，过滤细胞，并在红细胞裂解后，在α-MEM和10% FBS中培养得到的。
4、E7多肽-明胶纳米纤维微球对牙周组织细胞的亲和力。
将牙龈上皮细胞（GECs）、牙龈成纤维细胞（GFs）、牙周膜干细胞（PDLSCs）和骨髓间充质干细胞（BMSCs）分别以5×104个细胞/孔的密度接种在96孔板的明胶纳米纤维微球（NFG-MS）和E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）上。培养3小时后，将微球转移到40μm的细胞过滤器中，用PBS轻轻地洗三次以去除未粘附的细胞，然后转移到96孔板的新孔中。使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8，Sigma Aldrich）检测每种细胞类型的细胞粘附率。在每个孔中加入100μl a-MEM和10μl CCK-8溶液，在37℃下孵育1小时。
细胞粘附率是通过将粘附在微球上的细胞数除以每孔中接种的细胞总数来计算。结果如图5E所示，图5E示出了牙龈上皮细胞（GECs）、牙龈成纤维细胞（GFs）、牙周膜干细胞（PDLSCs）和骨髓间充质干细胞（BMSCs）在明胶纳米纤维微球（NFG-MS）和E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）上3h时的粘附率。从图5E可以看出，骨髓间充质干细胞（BMSCs）、牙周膜干细胞（PDLSCs）、牙龈成纤维细胞（GFs）和牙龈上皮细胞（GECs）在明胶纳米纤维微球（NFG-MS）上的粘附率分别为41.8%、50.7%、59.4%和10.0%。牙龈成纤维细胞（GFs）在明胶纳米纤维微球（NFG-MS）上显示出最高的粘附率。
然而，从图5E可以看出，E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）显著增加了骨髓间充质干细胞（BMSCs）和牙周膜干细胞（PDLSCs）的粘附率。具体地，骨髓间充质干细胞（BMSCs）和牙周膜干细胞（PDLSCs）的粘附率分别增加至69.0%和54.4%，而牙龈成纤维细胞（GFs）的粘附率下降了15.8%，从而使骨髓间充质干细胞（BMSCs）在E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）上的粘附率最高。牙龈上皮细胞（GECs）在明胶纳米纤维微球（NFG-MS）和E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）上的粘附率都是最低的，且E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）进一步降低了其粘附率近一半。这些结果表明，E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）能够明显促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）和牙周膜干细胞（PDLSCs）的粘附，并抑制牙龈成纤维细胞（GFs）和牙龈上皮细胞（GECs）的粘附，而明胶纳米纤维微球（NFG-MS）和E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）都不利于牙龈上皮细胞（GECs）的粘附。
5、牙周组织细胞在E7-NFG-MS上的伸展和形态学特性。
为了研究E7多肽-明胶纳米纤维微球对牙周组织细胞形态的影响，将牙龈上皮细胞（GECs）、牙龈成纤维细胞（GFs）、牙周膜干细胞（PDLSCs）和骨髓间充质干细胞（BMSCs）分别以1×104个细胞/孔的密度接种在96孔板的明胶纳米纤维微球（NFG-MS）和E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）上。
为避免细胞聚集，培养1小时后将微球转移到24孔板的新孔中。分别培养3小时、6小时和12小时后，对肌动蛋白细胞骨架进行免疫荧光染色，观察微球上细胞的伸展和形态。用4%多聚甲醛（PFA）在4℃下固定细胞-微球构建体30分钟，并在0.3%Triton X-100中透化15分钟。用20%的山羊血清和3%的BSA阻断1小时后，用CF633 Phalloidin（Biotium，美国）在室温下染色2小时，并用Hoechst（Invitrogen）进行核染色。使用共聚焦激光扫描显微镜（TCS SP5，Leica，美国）来获取微球上的单细胞图像。使用Imaris 9.0软件和Image-Proplus 6.0软件计算细胞伸展面积。
如图5所示，图5示出了骨髓间充质干细胞（BMSCs）、牙周膜干细胞（PDLSCs）、牙龈成纤维细胞（GFs）和牙龈上皮细胞（GECs）在明胶纳米纤维微球（NFG-MS）和E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）上的粘附和伸展特征。图5A-图5D分别为骨髓间充质干细胞（BMSCs）、牙周膜干细胞（PDLSCs）、牙龈成纤维细胞（GFs）和牙龈上皮细胞（GECs）在明胶纳米纤维微球（NFG-MS）和E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）上3h、6h和12h时的粘附和伸展特性的共聚焦图像。从图5A-图5D可以看出，微球上4种细胞的形态明显不同。在同一时间点，骨髓间充质干细胞（BMSCs）在E7-NFG-MS上的伸展面积明显大于NFG-MS。培养6h后，骨髓间充质干细胞（BMSCs）完全展开，细胞骨架排列清晰，像头巾一样覆盖在E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）表面。12小时后，单个骨髓间充质干细胞（BMSCs）的细胞骨架扩展到足以将两个相邻的微球连接成一个单元，这表明骨髓间充质干细胞（BMSCs）在E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）上有强大而稳定的粘附力。
相反，明胶纳米纤维微球（NFG-MS）上的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的伸展速度大大减慢，6h时明胶纳米纤维微球（NFG-MS）上的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的伸展面积甚至小于3h时E7多肽-明胶纳米纤维微球上的。骨髓间充质干细胞（BMSCs）直到12h才完全伸展，而且在明胶纳米纤维微球（NFG-MS）组几乎不可能观察到单个骨髓间充质干细胞连接两个微球的情况。
同样，E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）上的牙周膜干细胞（PDLSCs）仅在6小时内就完全伸展，表现出清晰排列的细胞骨架，类似于环绕微球的丝带，而明胶纳米纤维微球（NFG-MS）上的牙周膜干细胞（PDLCs）在6小时内仍处于收缩形态，细胞骨架不清晰，并且在明胶纳米纤维微球（NFG-MS）上需要12小时才能完全伸展。
与骨髓间充质干细胞（BMSCs）和牙周膜干细胞（PDLSCs）相比，牙龈成纤维细胞（GFs）在E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）上的伸展要慢得多。在3小时和6小时时，牙龈成纤维细胞（GFs）在E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）上显示出几乎是圆形的形态，伸展面积非常小，甚至在12小时时，牙龈成纤维细胞（GFs）在E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）上的伸展面积仅与6小时时在明胶纳米纤维微球（NFG-MS）上的伸展面积相当。12h时牙龈成纤维细胞（GFs）在明胶纳米纤维微球（NFG-MS）上完全展开，显示出典型的纺锤形细胞，而在E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）组12小时内没有观察到这种情况。
与其他三种类型的细胞截然不同，牙龈上皮细胞（GECs）在3小时、6小时和12小时时在明胶纳米纤维微球（NFG-MS）和E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）上都保持收缩、圆形的形态，这表明牙龈上皮细胞（GECs）在E7多肽-纳米纤维微球上的伸展受阻。这也与粘附率相对应。
这些结果表明E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）可以选择性地加速骨髓间充质干细胞（BMSCs）和牙周膜干细胞（PDLSCs）的伸展，而抑制牙龈成纤维细胞（GFs）和牙龈上皮细胞（GECs）的伸展。
6、竞争性粘附试验及牙周组织细胞对E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）的竞争性粘附作用。
将牙龈上皮细胞（GECs）、牙龈成纤维细胞（GFs）、牙周膜干细胞（PDLSCs）和骨髓间充质干细胞（BMSCs）分别以2×105个细胞/孔的密度接种在6孔板中。一旦细胞达到80~90%汇合度，按照制造商的说明，用细胞追踪染料Violet BMQC、Green CMFDA、Orange CMRA和Deep Red（Thermo Fisher Scientific）预染色30分钟。然后用PBS清洗细胞，通过胰蛋白酶法收集细胞，计数，并稀释到2×105个细胞/毫升的密度。将相同数量的每种细胞类型均匀混合，并将200微升混合细胞以2.5×105个细胞/孔的密度接种到24孔板的NFG-MS或E7-NFG-MS上。培养3小时后，用细胞过滤器除去未粘附的细胞，用胰蛋白酶收集粘附的细胞，用4%PFA固定，并重新悬浮在PBS中，用流式细胞仪检测定量分析每个细胞的比例。
如图6所示，图6示出了骨髓间充质干细胞（BMSCs）、牙周膜干细胞（PDLSCs）、牙龈成纤维细胞（GFs）和牙龈上皮细胞（GECs）在明胶纳米纤维微球（NFG-MS）和E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）上的竞争性粘附。图6A为流式散点图显示BMSCs、PDLSCs、GFs和GECs的密度。图6B-6C是对BMSCs、PDLSCs、GFs和GECs的比例进行定量分析，(*p<0.05, **p<0.01)。
从图6A-6C可以看出，骨髓间充质干细胞（BMSCs）、牙周膜干细胞（PDLSCs）、牙龈成纤维细胞（GFs）和牙龈上皮细胞（GECs）的初始接种率分别为20.9%、25.4%、22.0%和31.0%，其中牙龈上皮细胞（GECs）的接种率明显高于其他三种细胞类型，这可能是由于手工细胞计数的偏差。在明胶纳米纤维微球（NFG-MS）上共培养后，骨髓间充质干细胞（BMSCs）和牙周膜干细胞（PDLSCs）的比例略有增加，而牙龈成纤维细胞（GFs）大幅增长，几乎是其初始接种密度的两倍。然而，牙龈上皮细胞（GECs）的比例从最初的31.0%急剧下降到4.5%，导致其他三种细胞的比例增加。在E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）上共同接种后，牙龈成纤维细胞（GFs）的竞争性粘附优势被消除了，而骨髓间充质干细胞（BMSCs）的竞争性粘附被促进了。E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）组中牙龈成纤维细胞（GFs）的比例与接种组相似，大约是明胶纳米纤维微球（NFG-MS）组的一半。相反，E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）组中骨髓间充质干细胞（BMSCs）的比例大大增加到44.5%，分别是初始接种组和明胶纳米纤维微球（NFG-MS）组的2.1倍和1.8倍。尽管与最初的接种率相比，牙周膜干细胞（PDLSCs）在E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）上的比例有相当大的增长，但E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）和明胶纳米纤维微球（NFG-MS）之间没有明显差异。对于牙龈上皮细胞（GECs），与明胶纳米纤维微球（NFG-MS）相比，E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）上的竞争性粘附率进一步降低到1.3%。这些结果表明，E7多肽-明胶纳米纤维微球（E7-NFG-MS）特异性地增强了骨髓间充质干细胞（BMSCs）的竞争性粘附，抑制了牙龈成纤维细胞（GFs）和牙龈上皮细胞（GECs）的竞争能力。
细胞粘附在细胞和支架材料之间的相互作用中起着关键作用，是为后续细胞级联行为奠定基础的重要初始步骤。这些后续事件包括细胞迁移、增殖和分化，这对牙周缺损区的细胞富集和行使功能至关重要。来自牙周膜的PDLSCs或来自牙槽骨或血管的BMSCs应首先粘附在支架表面，然后才能从边缘迁移到缺损区的内部进行后续的细胞增殖和分化。本发明的研究表明，E7-NFG-MS明显促进了BMSCs和PDLSCs的粘附，同时阻止了GECs和GFs的粘附。特别是在四种细胞类型的竞争性粘附实验中，E7-NFG-MS大幅提高了BMSCs的粘附率至44.5%，而大幅降低了GECs的粘附率至1.3%（图6）。此外，细胞伸展实验表明，BMSCs仅在6小时内实现了在E7-NFG-MS上的完全铺展，而GECs在NFG-MS和E7-NFG-MS上的粘附区域有限，直到12小时仍为皱缩的球体（图5）。体内实验进一步证明，E7-NFG-MS有效地阻止了GECs和GFs的向内生长，使附着丧失明显减少，促进了功能性牙周组织的形成，其对牙周再生的效果明显优于使用GTR技术的组（Mem+NFG-MS组）。值得注意的是，微球本身并不利于GECs的粘附。体外粘附和扩散实验显示，GECs在NFG-MS上的粘附和扩散明显减少，体内实验显示，与Empty组相比，附着丧失明显减少。这些发现表明，微球本身可以作为屏障抑制牙龈上皮细胞的迁移，而E7多肽的共轭则进一步增强了与BMSCs和PDLSCs的亲和力，这有利于BMSCs和PDLSCs在缺损区的富集和分化，进而形成功能性牙周组织。
7、改良大鼠下颌骨牙周缺损模型的建立及特征。
动物研究模型和实验方案是在四川大学华西口腔医学院动物使用和伦理委员会的批准下进行的。共有24只8周龄的雄性SD大鼠被随机分配到四个组：Empty组（n=6），NFG-MS组（n=6），Mem+NFG-MS组（n=6），以及E7-NFG-MS组（n=6）。
没有微球植入缺损区的Empty组作为自然愈合对照，而NFG-MS组植入没有E7多肽共轭的NFG-MS，以评估微球对牙周再生的影响。为了比较E7-NFG-MS和临床上常用的GTR技术对牙周再生的效果，在Mem+NFG-MS组植入NFG-MS后，将可吸收的胶原膜（Geistlich Bio-Gide®）覆盖在缺损区。E7-NFG-MS组则植入与E7肽共轭的明胶纳米纤维微球。
建立大鼠下颌骨牙周缺损模型：麻醉后，通过去除大鼠颊侧皮肤周围的毛发和消毒皮肤，对手术部位进行了准备。手术在放大的体视镜（10×）下进行。沿着下颌骨下缘做一个1.5cm的切口，以暴露咀嚼肌并定位颊侧骨板。然后解剖颊部牙龈组织以暴露第一和第二磨牙。用2号圆钻去除第一磨牙的颊根，然后用1/2号圆钻完成截骨，形成3mm（高）×2mm（宽）×1mm（深）的标准尺寸的牙周缺损。然后将微球小心翼翼地植入牙周缺损区域。将面肌和手术部位的皮肤缝合到位。手术后，大鼠接受3天的镇痛和7天的软食。术后8周，处死大鼠，收取样本用于组织学、免疫组织化学和μ-CT检测。
为了更真实地模拟临床上由牙周炎引起的牙周缺损，对牙周开窗模型进行了修改，使其与口腔相通。如图7所示，其中图7A是大鼠下颌骨牙周缺损模型的照片。图7B是大鼠下颌第一磨牙的μ-CT重建图像，缺损模型中的颊根被移除。图7C是建立牙周缺损模型前后大鼠下颌骨的μ-CT重建图像。图7D-7F是建立牙周缺损模型前后大鼠下颌骨在冠状面、矢状面和水平面的灰度图像。图7中示出了标准牙周缺损的大小为3mm（高）×2mm（宽）×1mm（深），大鼠第一磨牙的颊根和围绕远中牙根颊部1/2侧全长的牙槽骨被磨除，暴露的远中根上的牙周膜被完全刮除，附着在牙髓牙釉质交界处（CEJ）的牙龈组织被解剖分离，这模仿了临床牙周炎引起的牙槽骨缺损和附着丧失。与牙周缺损的临床分类相对应，这个改良的牙周缺损模型是水平骨缺损和II壁缺损的组合，表现为颊侧牙槽骨的水平骨缺损和剩余的近中、远侧牙槽骨壁。由于与暴露的牙根表面相邻的牙槽骨量少于II壁缺损，而大于水平骨缺损，因此这种牙周缺损模型的预后预计会比II壁缺损差，比水平骨缺损好，这两种情况仍然是临床治疗的难题。本发明利用这个模型来评估E7-NFG-MS对牙周再生的影响。
8、进行组织学和免疫组织化学检测。
将大鼠下颌骨在4℃的4%PFA中固定48h，用PBS清洗1h，并在室温下用15%乙二胺四乙酸（EDTA）脱矿6周。乙醇梯度脱水和石蜡包埋后，对第一磨牙远中根部的连续冠状切片（4μm）进行脱蜡和再水化，用于以下组织学和免疫组化分析。根据制造商的说明，使用三色染色试剂盒（Sigma-Aldrich）进行Masson染色，进行组织学观察。进行Sirius Scarlet染色以确定牙周胶原纤维的排列。根据制造商的说明，用Vectastain Elite ABS-HRP试剂盒（Vector Laboratories, CA）进行免疫组织化学分析。抗体包括泛角蛋白抗体（AE1/AE3）（1:100，sc-81714，Santa Cruz Biotechnology），和成纤维细胞标记物（ER-TR7）（1:100，sc-73355，Santa Cruz Biotechnology）。新形成的牙槽骨的高度是根据从牙根牙周膜（PDL）的最低点画出的水平线进行测量，附着物损失的高度是牙釉质交界处（CEJ）和附着在牙根表面的牙龈上皮的最低点之间的垂直距离，纤维组织高度为新生牙槽骨顶点与纤维组织最高点之间的垂直距离，功能性牙周膜（PDL）高度定义为牙周膜（PDL）最低点与牙骨质-牙周膜-牙槽骨功能结构中最高牙周膜（PDL）附着点之间的垂直距离。组织形态学分析是用Image-Pro plus 6.0软件进行的。每个样本至少有四张玻片用于测量。
为了进行组织学比较观察，采用未做手术的下颌骨作为对照组，研究牙周再生效果。进行Masson's三色染色以评估新形成的牙周组织的结构，同时进行针对上皮细胞标记物 “AE1/AE3”的免疫组化染色，以评估附着丧失的程度。牙周健康评估主要包括两个直接相关的临床指标，即附着水平和牙槽骨高度。附着丧失是由于牙周支持组织的破坏而导致的，附着丧失的增加对应于牙槽骨高度的降低。如图8A-8B所示，Masson三色染色产生蓝色的胶原蛋白和骨，红色的角质上皮和肌肉纤维，以及粉红色的细胞质。E7-NFG-MS组的牙槽骨高度的恢复明显高于Mem+NFG-MS、NFG-MS和Empty组，尽管仍远低于健康对照组（图8A、8B、8D）。此外，Mem+NFG-MS组表现出第二高的牙槽骨高度，明显高于NFG-MS和Empty组。Empty组的牙槽骨高度恢复得最少。因此，E7-NFG-MS组表现出最少的附着丧失，而Empty组则最多，NFG-MS和Mem+NFG-MS组表现出的附着丧失介于E7-NFG-MS和Empty组之间（图8B-8E）。
纤维组织标志物 "ER-TR7 "的免疫组化显示，健康对照组的纤维组织阳性区域主要与牙周膜区域重叠，少量的纤维组织位于牙龈结缔组织中（图9A-9B）。相反，Empty组的缺损区域则被新生的纤维组织的完全填充。在NFG-MS、Mem+NFG-MS和E7-NFG-MS组，纤维组织主要位于新形成的牙槽骨周围和上方。此外，纤维组织的数量与缺损区新形成的牙槽骨高度呈反比关系。值得注意的是，E7-NFG-MS组的纤维组织明显少于NFG-MS和Mem+NFG-MS组（图9A-9C）。
利用Sirius Scarlet染色来评估胶原蛋白的排列和牙周功能结构的形成如图10。在健康对照组中，观察到排列有序的牙周膜通过Sharpey纤维连接牙根和牙槽骨。该牙周膜同时嵌入牙根和牙槽骨中，使牙周组织具有支持功能。相反，Empty组的缺损区只显示出无序的胶原纤维，很少形成牙周支持性结构。相反，NFG-MS、Mem+NFG-MS和E7-NFG-MS组显示出功能性结构，新形成的牙周膜排列有序，通过Sharpey纤维牢牢地固定在新形成的牙骨质和牙槽骨上，表明牙周组织的支持功能得到了恢复。值得注意的是，与NFG-MS组和Mem+NFG-MS组相比，E7-NFG-MS组形成了更多的功能性牙周结构，这可以从新形成的功能性牙周膜的高度增加中得到证明（图9D）。此外，E7-NFG-MS组新形成的牙骨质、牙周膜和牙槽骨内的胶原束为更密集和成熟，表现为其橙红色。
这些组织学发现表明，单独应用微球有利于功能性牙周结构的形成，而联合应用胶原屏障膜则增强了对牙周再生的有利影响。E7-NFG-MS组显著优于NFG-MS组和 Mem+NFG-MS组，可以进一步有效促进牙槽骨高度的恢复，减少牙周附着丧失和纤维组织的形成，最终显著促进牙周功能结构的形成。
对于牙周再生，大型动物模型，如狗、猪和非人灵长类动物，通常更接近于模拟人类的解剖、生理和病理条件，并且通常被认为是评估GTR技术、生物材料和生物制剂效果的理想选择。然而，高昂的成本和苛刻的维护，以及监管要求，限制了它们的广泛使用。因此，啮齿类动物的下颌开窗模型经常被用作替代品，并被广泛用于牙周再生实验。然而，这种标准化的缺损缺陷模型与口腔环境隔离，排除了牙周再生过程中负面的变量，如牙龈组织的生长和伤口的细菌污染，这与临床上由牙周炎引起的牙周缺损完全不同。在本发明对开窗模型进行了修改，使其与口腔相连接，并在实验处理后立即关闭牙龈瓣，以密切模仿临床情况。这种改良的牙周缺损模型的自发愈合的特点是：长的结合上皮、大量的结缔组织修复和有限的牙槽骨、PDL和牙本质形成（图8-图10），这与临床上慢性牙周缺损的愈合很相似。此外，应用屏障膜可以有效地防止GECs和GFs的入侵（图8-图10），表明该模型更适合于评估各种干预措施对牙周再生的影响。
9、显微计算机断层扫描（μ-CT）分析E7-NFG-MS对牙周再生的影响。
使用μ-CT35成像系统（Scanco Medical）对固定的大鼠下颌骨进行μ-CT扫描，分辨率为10μm（55kVp，145μA，8W）。使用Mimics 21.0软件（Materialise，比利时）对扫描数据进行了重建和分割。分析新形成的骨量，并将牙根暴露长度定义为牙髓牙釉质交界处（CEJ）与暴露牙根最低点之间的垂直距离。
将动物分为四组：Empty组、NFG-MS组、Mem+NFG-MS组和E7-NFG-MS组。Empty组对应于没有任何干预的自然临床愈合过程。在NFG-MS组中，将不含E7多肽的微球填充到缺损处，这模拟了临床移植材料处理。在Mem+NFG-MS组，采用屏障膜与微球移植材料相结合的方式，模仿GTR技术的应用。在E7-NFG-MS组，用E7多肽共轭的微球填充缺损区。
如显微CT重建图像所示（图11A，11E），缺损区的新生骨被分割并以红色标记。E7-NFG-MS组表现出最大的新生骨量，其次是Mem+NFG-MS和NFG-MS组，而Empty组的新生骨量最少。E7-NFG-MS、Mem+NFG-MS和NFG-MS组的新生骨量分别是Empty组的2.6、2.0和1.6倍。水平面和冠状面的灰度图像（图11C-11D）清楚地显示，虽然缺损区被新形成的骨覆盖，但根部表面新形成的骨很少，新形成的骨量随着与根尖距离的增加而减少。根部暴露在根的颊面是最大的，离剩余的牙槽骨壁最远，意味着干细胞迁移到这个区域需要更大的距离和时间，增加了骨再生的难度。如图11B-11D和图11G所示，通常牙根的表面新形成的骨量最少，表现为牙根暴露。牙齿远中根周围1mm的区域约占牙周总缺损量的50%，但该区域的新生骨量的比例（图11B，图11F中以绿色标示）在Empty组只有14.3%。 NFG-MS、Mem+NFG-MS和E7-NFG-MS组分别将这一比例明显提高到27.1%、34.2%和41.1%，其中E7-NFG-MS组的增幅最大。
牙根周围新骨量的增多与牙根暴露呈反比关系（图11B，图11E-11G）。值得注意的是，与其他三组相比，E7-NFG-MS组的牙根暴露长度明显减少，约为1200um。相比之下，Empty组的牙根在缺损区几乎完全暴露，新骨的覆盖率很小。与总的新骨量和牙根周围的新骨量成反比，与Mem+NFG-MS组相比，NFG-MS组表现出明显的牙根暴露长度，进一步证明了新形成的骨对牙根暴露的影响。这些发现表明，E7-NFG-MS可以有效地促进新骨形成，减少牙周缺损的牙根暴露长度，其效果明显优于Mem+NFG-MS和NFG-MS组。如图12所示，图12示出了本发明的E7多肽-明胶纳米纤维微球注射至牙周缺损区域后的效果图。
10、统计学分析。
本发明的统计分析使用SPSS软件16.0版（SPSS，Chicago，IL）进行。结果以平均值±标准差表示。四组之间的差异使用单因素方差分析进行比较，显著性水平为P<0.05。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (4)

1.一种用于治疗牙周缺损的E7多肽-明胶纳米纤维微球支架，其特征在于，所述E7多肽-明胶纳米纤维微球支架包括明胶纳米纤维微球，E7多肽共轭结合至所述明胶纳米纤维微球的表面，
所述E7多肽-明胶纳米纤维微球支架的制备方法，包括如下步骤：
（1）制备明胶纳米纤维微球：
准备工作：将异丙醇和乙醇置于-80℃冰箱4h；将矿物油置于50℃预热1h；配置50%的乙醇溶液，备用；
将明胶溶解于上述步骤配置的50%的乙醇溶液中，加热至50℃，配置成12%的明胶溶液；
以800rmp转速搅拌矿物油，并将明胶溶液缓慢滴加进矿物油中，形成明胶/矿物油液滴；
将预冷的异丙醇、乙醇和室温二氧六环按照体积比为4：1：3比例配置成800mL混合有机溶剂，在低速搅拌状态下，将明胶/矿物油液滴乳化液倒入800mL预冷的有机溶剂中；通过低温相分离形成微球的纳米纤维结构；
待前一步骤中的混合液恢复至室温，停止搅拌，将合成的明胶纳米纤维微球用20-300μm的金属筛转移至长柱状玻璃容器；
配置交联催化剂：将1g 2-吗啉乙磺酸、0.23g N-羟基琥珀酰亚胺和0.38g 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺溶解于20mL去离子水；
取2mL所配置的交联催化剂加入到50mL丙酮中，配置成4%的交联剂；
将上一步中的交联剂加入到装有明胶纳米纤维微球的长柱状玻璃容器中，在4℃低速搅拌状态下交联48h，以合成稳定的微球纳米纤维结构；
待交联完成后，用20-300μm内多个不同尺寸的金属筛筛选出多种不同直径的微球，分装到15mL的离心管；
筛选后的不同直径的微球分别用乙醇和去离子水清洗；加入0.5 M的甘氨酸孵育3h，以中和未反应的交联剂；然后再分别用去离子水和乙醇清洗；
用二氧六环置换乙醇，在液氮中迅速冷冻，立即转移到真空低温冷冻干燥机，冷冻干燥；然后储存于密封袋，-20℃保存备用；
（2）制备E7多肽，并在E7多肽的羧基端引入半胱氨酸；将含有半胱氨酸的E7多肽溶解于二甲基亚砜中，得到E7多肽溶液；
（3）将所制备的明胶纳米纤维微球用含有NaCl的PBS溶液清洗后浸入磺基琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯溶液中，在室温下搅拌，然后用含EDTA的PBS溶液洗涤处理后的明胶纳米纤维微球，将洗涤后的明胶纳米纤维微球加入到E7多肽溶液中进行反应，以得到E7多肽-明胶纳米纤维微球支架。
2.根据权利要求1所述的E7多肽-明胶纳米纤维微球支架，其特征在于，在步骤（3）中，还包括：
用含有0.15M NaCl，pH7.2的0.1M PBS溶液清洗5mg的明胶纳米纤维微球；
将清洗后的明胶纳米纤维微球浸入1mL磺基琥珀酰亚胺-4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-甲酸酯溶液中，在室温下轻轻搅拌1小时，用含0.1M EDTA的pH7.0的PBS溶液洗涤处理过的明胶纳米纤维微球；
将上述明胶纳米纤维微球加入至1mL的E7多肽溶液中在室温下搅拌孵育1h；
用蒸馏水清洗E7多肽共轭的明胶纳米纤维微球，冻干保存。
3.根据权利要求1所述的E7多肽-明胶纳米纤维微球支架，其特征在于，所述的制备E7多肽，并在E7多肽的羧基端引入半胱氨酸，将E7多肽溶解于二甲基亚砜中，得到E7多肽溶液的步骤，还包括：
通过固相多肽合成法在E7多肽的羧基端引入一个半胱氨酸，其中所述E7多肽的氨基酸序列为EPLQLKM，所述E7多肽溶液的浓度为2mg/mL。
4.如权利要求1所述的E7多肽-明胶纳米纤维微球支架在制备治疗牙周缺损的药物中的应用。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005278909A (ja) * 2004-03-30 2005-10-13 Nipro Corp 歯周組織再生用材料
CN101156849A (zh) * 2007-09-20 2008-04-09 山东大学 一种促牙周再生的苯妥英钠缓释凝胶及其制备方法与应用
CN102229646A (zh) * 2011-06-09 2011-11-02 北京大学第三医院 骨髓间充质亲干细胞亲和多肽的氨基酸序列、筛选方法及应用
CN106074393A (zh) * 2016-06-09 2016-11-09 丽珠医药集团股份有限公司 一种注射用多肽类药物的缓释微球的制备
CN112675361A (zh) * 2020-12-28 2021-04-20 浙江大学 一种区域功能特异性临床牙周缺损修复模块的制备方法
CN112891636A (zh) * 2021-01-30 2021-06-04 复旦大学 具有温敏和缓释功能的复合生物材料及其制备方法和应用
CN116531365A (zh) * 2023-02-01 2023-08-04 四川大学 一种羌活醇在制备预防和/或治疗牙周炎药物中的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019209762A1 (en) * 2018-04-23 2019-10-31 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Nanofiber microspheres and methods of use thereof
US20200155594A1 (en) * 2018-09-14 2020-05-21 University Of Virginia Patent Foundation Hornerin: a novel non-vegf mediated angiogenic protein expressed in both human and mouse angiogenic endothelial cells and human pancreatic cancer cells

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005278909A (ja) * 2004-03-30 2005-10-13 Nipro Corp 歯周組織再生用材料
CN101156849A (zh) * 2007-09-20 2008-04-09 山东大学 一种促牙周再生的苯妥英钠缓释凝胶及其制备方法与应用
CN102229646A (zh) * 2011-06-09 2011-11-02 北京大学第三医院 骨髓间充质亲干细胞亲和多肽的氨基酸序列、筛选方法及应用
CN106074393A (zh) * 2016-06-09 2016-11-09 丽珠医药集团股份有限公司 一种注射用多肽类药物的缓释微球的制备
CN112675361A (zh) * 2020-12-28 2021-04-20 浙江大学 一种区域功能特异性临床牙周缺损修复模块的制备方法
CN112891636A (zh) * 2021-01-30 2021-06-04 复旦大学 具有温敏和缓释功能的复合生物材料及其制备方法和应用
CN116531365A (zh) * 2023-02-01 2023-08-04 四川大学 一种羌活醇在制备预防和/或治疗牙周炎药物中的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mechanosensitive Piezo1 in Periodontal Ligament Cells Promotes Alveolar Bone Remodeling During Orthodontic Tooth Movement;Yukun Jiang等;《ORIGINAL RESEARCH》;第12卷;1-10 *
Peptide-Grafted Microspheres for Mesenchymal Stem Cell Sorting and Expansion by Selective Adhesion;Shuo Wu等;《ORIGINAL RESEARCH》;第10卷;1-16 *
明胶微球在骨组织工程中的应用;翟远航等;《生物工程学报》;1-18 *
转化生长因子明胶微球的制备及其对人牙周膜细胞增殖作用的影响;张晓霞等;《中国医药导报》;第6卷(第31期);第10页第1.2-1.3节，第12页第3节 *

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