JP2012135313A - 歯の製造方法、歯の集合体及び組織の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】間葉系細胞及び上皮系細胞のいずれか一方のみから実質的になる第1の細胞集合体と、いずれか他方のみから実質的になる第2の細胞集合体とを、細胞の接触状態を保持可能な支持担体の内部に接触させて配置し、培養して、特有の細胞配置を有する歯を得る。
【選択図】図2
Description
歯は、胎児期の発生過程の誘導によって形成され、複数の細胞種によって構築された機能単位であり、器官や臓器と同じであると考えられている。そのため歯は、成体内の造血幹細胞や間葉系幹細胞のような幹細胞から細胞種が発生する幹細胞システムによって発生するのではなく、現在、再生医療によって進められている幹細胞の移入のみ(幹細胞移入療法)では歯を再生することができない。また、歯の発生過程で特異的に発現する遺伝子を同定し、歯胚を人為的に誘導することによる歯の再生も考えられているが、遺伝子を特定しただけでは、歯の再生を完全に誘導することができない。
そこで、近年、単離された歯胚細胞を用いた歯胚を再構成させて、この再構成歯胚を移植することによる歯の再生を中心とした検討が行われている。
また、非特許文献2には、継代された培養細胞による上皮−間葉相互作用が実現可能な系とし、コラーゲンゲルによる共培養が有効であると記載されている。
歯胚の再生方法としては、例えば、特許文献1には、歯胚細胞を、線維芽細胞増殖因子等の生理活性物質の存在下で培養することが記載されている。また、特許文献2には、歯胚細胞及びこれらの細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも1種類を、フィブリンを含む担体と一緒に培養することが提案されており、ここでフィブリンを含む担体は、歯胚の目的形状のものを使用して、特有の形態を有する「歯」を形成すると記載されている。
一方、特許文献5には、骨の欠損又は損傷を有する患者を治療するための歯の再生方法を開示している。この方法によれば、ポリグリコール酸メッシュ担体に間葉系細胞を播種した後に、上皮系細胞をコラーゲンと共に重層する又は上皮細胞シートで包むことによって、骨が形成される。なお、特許文献5では、骨の形状を構築するために担体を用いている。
また、組織を構成している複数の細胞を単に単離して培養しただけでは、特有の細胞配置を備えた組織を再構築することが困難であった。
また、本発明の他の目的は、組織特有の細胞配置を保持した組織の製造方法を提供することである。
またここで、前記第1の細胞集合体及び第2の細胞集合体が、共に単一細胞集合物であってもよい。
また、上記組織は、歯、毛髪、腎臓、肺、肝臓からなる群より選択されたものであることを特徴としている。
この結果、目的とする組織に特有の細胞配置を有する組織を作製することができる。また、間葉系細胞及び上皮系細胞の少なくとも一方を歯胚由来とすることにより、外側にエナメル質を有し内側に象牙質を有するという特有の細胞配置を備えた歯及び歯の集合体を作製することができる。
また、本発明によれば、組織特有の細胞配置を保持した組織の製造方法を提供するができる。
また、歯の方向性は、歯冠や歯根の配置によって特定することができる。歯冠や歯根は、形状や組織染色などに基づいて目視にて確認することができる。
なお、本発明において「間葉系細胞」とは、間葉組織由来の細胞を意味し、「上皮系細胞」とは上皮組織由来の細胞を意味する。
本発明における間葉系細胞及び上皮系細胞は、歯胚を形成する又は形成する可能性がある上記蕾状期から鐘状後期までのもの(以下、単に「歯胚」という)であればよく、細胞の分化段階の幼若性と均質性の観点から蕾状期から帽状期からのものであることが好ましい。
第1の細胞集合体第2の細胞集合体は、いずれが上皮系細胞及び間葉系細胞であってもよく、この細胞集合体を構成する細胞の数は、動物の種類や、支持担体の種類、硬さ及び大きさによって異なるが、細胞集合体1個あたり、一般に101〜108個、好ましくは103〜108個とすることができる。
本発明の製造方法における配置工程では、上記第1及び第2の細胞集合体を、細胞の接触状態を保持可能な支持担体の内部に配置するので、それぞれの細胞集合体を構成する細胞が、他方の細胞集合体を構成する細胞と混じり合うことがない。このように配置工程では、各細胞集合体を混合することなく配置するので、細胞集合体の間に境界線が形成される。このような配置形態を、本明細書中では適宜「区画化」と表現する。
本製造方法で用いられる間葉系細胞及び上皮系細胞は、生体内での細胞配置を再現して特有の構造及び方向性を有する歯を効果的に形成するために、少なくともいずれか一方が歯胚に由来するものであればよいが、確実に歯を形成させるためには、間葉系細胞及び上皮系細胞のいずれもが共に歯胚由来であることが最も好ましい。
また、歯胚以外に由来する上皮系細胞としては、生体内の他の上皮系組織に由来する細胞であり、好ましくは、皮膚や口腔内の粘膜や歯肉の上皮系細胞、さらに好ましくは皮膚や粘膜などの分化した、例えば角化した、あるいは錯角化した上皮系細胞を生み出しうる未熟な上皮系前駆細胞、たとえば非角化上皮系細胞やその幹細胞等を挙げることができる。
好ましくは、周囲組織から歯胚細胞を容易に分離するため及び/又は歯胚組織から上皮組織及び間葉組織を分離するために、酵素を用いてもよい。このような用途に用いられる酵素としては、ディスパーゼ、コラーゲナーゼ、トリプシン等を挙げることができる。
培養に用いられる培地としては、一般に動物細胞の培養に用いられる培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)等を用いることができ、細胞の増殖を促進するための血清を添加するか、あるいは血清に代替するものとして、例えばFGF、EGF、PDGF等の細胞増殖因子やトランスフェリン等の既知血清成分を添加してもよい。なお、血清を添加する場合の濃度は、そのときの培養状態によって適宜変更することができるが、通常10%とすることができる。細胞の培養には、通常の培養条件、例えば37℃の温度で5%CO2濃度のインキュベーター内での培養が適用される。また、適宜、ストレプトマイシン等の抗生物質を添加したものであってもよい。
なお、ここで支持担体は、第1及び第2の細胞集合体が担体内部で成育することができる程度の厚みを有すればよく、目的とする組織の大きさ等によって適宜設定することができる。
高密度の状態とは、組織を構成する際の密度と同等程度であることをいい、例えば、細胞集合体の場合、細胞配置時で5×107〜1×109個/ml、細胞の活性を損なわずに確実に細胞相互作用させるため好ましくは1×108〜1×109個/ml、最も好ましくは2×108〜8×108個/mlの密度をいう。このような細胞密度に細胞集合体を調製するには、細胞を遠心によって凝集させ沈殿化することが細胞の活性を損なわずに簡便に高密度化できるため好ましい。このような遠心は、細胞の生存を損ねない300〜1200×g、好ましくは500〜1000×gの遠心力に該当する回転数で3〜10分間おこなえばよい。300×gよりも低い遠心では、細胞の沈殿が不十分となって細胞密度が低くなる場合があり、一方、1200×gよりも高い遠心では細胞が損傷を受ける場合があるため、それぞれ好ましくない。
培養工程は、支持担体によって第1の細胞集合体と第2の細胞集合体との接触状態が維持されて行われればよく、第1及び第2の細胞集合体を有する支持担体単独による培養であっても、他の動物細胞の存在下での培養であってもよい。
培養期間としては、支持担体内部に配置された細胞数及び細胞集合体の状態、更には培養工程の実施条件によって異なるが、一般に、1〜300日、エナメル質を外側に有し、象牙質を内側に有する歯を形成するためには、好ましくは1〜120日、迅速に提供可能とする観点からは、好ましくは1〜60日とすることができる。更に歯周組織を備えた歯とするためには、一般に1〜300日、好ましくは1〜60日とすることができる。
また、組織や細胞集合体のガス交換や栄養供給の観点から器官培養を用いることが好ましい。器官培養では、一般に、動物細胞の増殖に適した培地上に多孔性の膜をフロートさせ、その膜上に支持担体で包埋された細胞集合体を置いて培養を行う。ここで用いられる多孔性の膜には、0.3〜5μm程度の孔を多数有した膜であることが好ましく、具体的にはセルカルチャーインサート(商品名)、アイソポアフィルター(商品名)を挙げることができる。
この用途に利用可能な動物は、哺乳動物、例えばヒト、豚、マウス等を好ましく挙げることができ、歯胚組織と同一の種に由来するものであることが更に好ましい。ヒト歯胚組織を移植する場合には、ヒト、又は免疫不全に改変したヒト以外の他の哺乳動物を用いることが好ましい。このような生体内成育に好適な生体部位としては、動物細胞の器官や組織をできる限り正常に発生させるためには、腎臓皮膜下、腸間膜、皮下移植等が好ましい。
移植による成育期間としては、移植時の大きさと発生させる歯の大きさによって異なるが、一般に、3〜400日とすることができる。例えば、腎臓皮膜下への移植期間は移植する培養物の大きさと再生させる歯の大きさによっても異なるが、歯の再生と移植先で発生させる歯の大きさの観点から7〜60日間であることが好ましい。
前培養の期間は短期であっても長期であってもよい。長期間、例えば3日以上、好ましくは7日以上とした場合には、歯胚から歯芽に発生させることができるので、移植後に歯ができるまでの期間を短縮することもできるため好ましい。前培養の期間としては、例えば腎臓皮膜下へ移植を行う場合の器官培養として、好ましくは1〜7日とすることが効率よく歯を再生するために好ましい。
即ち、本発明の歯周組織の製造方法は、上記培養工程を、支持担体に内部で、前記第1及び第2の細胞集合体を、歯とこれに連続する歯周組織とを得るまで培養する工程(培養工程)とし、更に、前記培養によって得られた歯周組織を単離する工程と、を含むことを特徴としている。
この方法では、歯周組織が得られるまで延長された培養期間によって、歯に連続して歯周組織を形成させ、歯から分離することにより、歯周組織のみを得ることができる。歯周組織の単離は、培養工程の過程で形成された歯周組織と歯とを分離することができる如何なる方法によって行ってもよく、ピンセット等による分離や、酵素による部分消化等を挙げることができる。
なお上記歯の製造方法において説明した事項は、培養期間を制限しない限り、いずれも本歯周組織の製造方法にも適用することができる。
なお、得られた歯又は歯周組織を移植片として用いる場合には、製造方法における培養工程を、他の動物細胞との接触がなく且つ全行程in vitroで調製することができる器官培養としたものであることが好ましい。
このような歯の集合体は、歯特有の細胞配置を有する複数の歯で構成されているため、個々の歯を集合体から分離して、以下に述べるように1つの歯の移植片として用いることができる。このように本発明の歯の製造方法は、複数の歯を同時に作製した場合には、複数の歯で構成された歯の集合体としても歯を提供することができる。この結果、移植片としての歯を効率よく作製することができる。
歯の集合体の製造方法において、第1及び第2の細胞集合体は、複数本の歯が発生するための歯胚の再誘導を容易にするために共に単一細胞により構成されていることが好ましい。なお、培養工程は、前記と同様に、器官培養であっても腎臓皮膜下での培養であってもよいが、得られた歯を移植片として用いる場合には、他の動物細胞との接触がなく且つ全行程in vitroで調製することができる器官培養とすることが好ましい。
これにより、歯の移植を、特有の細胞配置と方向性を備えた複数の歯を同時に得て、効率よく実施することができる。
即ち、本発明の治療方法は、本発明による製造方法によって得られた歯及び/又は歯周組織を、欠損及び/又は損傷部位へ移植することを含む。これにより、欠損及び/又は損傷部位の上記症状を治療及び/又は緩和することができる。
本発明の他の治療方法は、本発明における培養工程のみ、或いは、配置工程及び培養工程を、欠損及び/又は損傷部位において実施させることを含む。この場合、支持担体としては、上述したものに加えて、欠損及び/又は損傷部位の周囲組織そのものを支持担体として適用してもよい。これにより、生体内での周辺組織からのサイトカイン等によって、より迅速に欠損及び/又は損傷部位の治療等を行うことができる。
即ち、本発明の組織の製造方法は、間葉系細胞と上皮系細胞との相互作用により構築される組織の製造方法であって、支持担体内部に、間葉系細胞及び上皮系細胞のいずれか一方のみから実質的になる第1の細胞集合体と、いずれか他方のみから実質的になる第2の細胞集合体とを接触させて配置すること、前記第1及び第2の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養すること、を含む。
なお上記歯の製造方法において説明した事項は、特記しない限り、いずれも本組織の製造方法にも同様に適用することができる。
このとき、間葉系細胞と上皮系細胞の少なくとも一方は、目的とする組織に由来するものであることが好ましい。これにより、目的とする組織へ方向付けが既に行われている細胞を用いて容易に組織を形成することができる。また、より確実に目的とする組織を製造するには、共に目的とする組織に由来することが最も好ましい。
これらから各細胞集合体を調製するには、前述したように、組織から間葉系細胞と上皮系細胞とを分離して前記同様にして第1及び第2細胞集合体を調製し、前記同様にして、支持担体内部へ配置し、培養及び/又は移植すればよい。
これにより、前述した歯と同様に、目的とする組織に特有の細胞配置を有する組織を得ることができる。
(1)歯胚上皮系細胞と歯胚間葉系細胞の調製
歯の形成を行うために、歯胚の再構築を行った。この実験モデルとしてマウスを用いた。
C57BL/6Nマウス(日本クレアから購入)又はGreen Fluorescence Protein (EGFP) トランスジェニックマウスであるC57BL/6−TgN(act-EGFP)OsbC14-Y01-FM131(GFPマウス:理研バイオリソースセンター)の胎齢14.5日、胚仔から下顎切歯歯胚組織を顕微鏡下で常法により摘出した。下顎切歯歯胚組織をCa2+,Mg2+不含リン酸緩衝液(PBS(−))で洗浄し、PBS(−)に最終濃度1.2U/mlのDispase II (Roche, Mannheim, Germany)を添加した酵素液で室温にて12.5分間処理した後、10%FCS(JRH Biosciences, Lenexa, KS)を添加したDMEM(Sigma, St. Louis, MO)で3回洗浄した。さらにDNase I溶液 (Takara, Siga, Japan)を最終濃度70U/mlになるよう添加し歯胚組織を分散させ、25G注射針 (Terumo, Tokyo, Japan)を用いて外科的に歯胚上皮組織と歯胚間葉組織を分離した。
一方、歯胚間葉系細胞は、歯胚間葉組織をPBS(−)で3回洗浄し、0.25%Trypsin (Sigma)、50U/mlのCollagenase I (Worthington)を含むPBS(−)で処理した。70U/mlのDNase I (Takara)を添加して、ピペッティングにより単一の歯胚間葉系細胞を得た。
次に、上記で調製された歯胚上皮系細胞及び歯胚間葉系細胞を用いて、歯胚再構築を行った。
シリコングリースを塗布した1.5mLマイクロチューブ (Eppendorf, Hamburg, Germany)に、10%FCS(JRH Biosciences) 添加DMEM(Sigma)で懸濁した歯胚上皮系細胞、あるいは歯胚間葉系細胞を入れ、遠心分離(580×g)により細胞を沈殿として回収した。遠心後の培養液の上清をできる限り除去し、再度遠心操作を行い、実体顕微鏡で観察しながら細胞の沈殿周囲に残存する培養液を GELoader Tip 0,5−20μL (eppendorf) を用いて完全に除去し、再構成歯胚作製に用いる細胞を準備した。
シリコングリースを塗布したペトリディッシュに、2.4mg/mlの濃度に上記培養液で調製したCellmatrix type I-A (Nitta gelatin, Osaka, Japan) を30μL滴下してコラーゲンゲル溶液のドロップ(ゲルドロップ)を作製した。この溶液に、上記歯胚上皮系細胞、あるいは歯胚間葉系細胞の遠心後の沈殿を、0.1−10μLのピペットチップ (Quality Scientific plastics)を用いて、0.2−0.3μLアプライして、細胞集合体としての細胞凝集塊を作製した。
ピペットチップ16で先にゲルドロップ10内に配置された細胞凝集塊12は、ゲルドロップ10内で球体を構成する(図2(B)参照)。この後に他方の細胞凝集塊14を押し込むことによって、球体の細胞凝集塊12がつぶされて、他方の細胞凝集塊14を包むようになることが多い(図2(C)参照)。その後にゲルドロップ10を固化させることにより、細胞間の結合が強固になる(図2(D)参照)。
本実施例において、細胞凝集塊と組織とによる再構成歯胚を組み合わせる場合(実施例1及び2)には、歯胚上皮系細胞、あるいは間葉系細胞から作製した細胞凝集塊に、上皮系細胞又は間葉系細胞からなる部分組織をゲルドロップ中に移した後、それぞれの組織の歯胚における組織境界面側を、タングステン針を用いて細胞凝集塊に密着させて再構成歯胚を作製した。
一方、単一細胞にした歯胚上皮系細胞と歯胚間葉系細胞を用いた再構成歯胚(実施例3)では、先に作製した歯胚間葉系細胞の細胞凝集塊に接するように、歯胚上皮系細胞を同様の方法によりアプライして細胞凝集塊を作製し、両者が互いに密接するようにして再構成歯胚を作製した。
また比較例としては、歯胚組織をそのまま腎皮膜下に移植したもの(比較例1)と、歯胚から分離した上皮組織と間葉組織をそれぞれ単独で移植したもの(比較例2)、また細胞の容量と等量の培養液を含む低密度凝集塊を用いたもの(比較例3)と、歯胚から分離して上皮細胞と間葉細胞を混合して上皮細胞と間葉細胞を区画化することなく支持担体中で細胞凝集塊を形成させたもの(比較例4)とを、それぞれ上記と同様にして調製し、同様に解析した。なお、比較例4において、上皮細胞と間葉細胞との混合は、それぞれ1対1の比率で穏やか混合した後、実施例1〜3と同様にして、再構成歯胚作製に用いる1の細胞凝集塊として調製した。
腎皮膜下に移植の場合には、移植後7日目、あるいは14日目に周囲の腎組織ごと再構成歯胚を摘出し、4%パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液で6時間固定した後、4.5%のEDTA(pH7.2)で24時間脱灰し、常法によりパラフィン包埋して、10μmの切片を作製した。組織学的解析のためには常法に従い、ヘマトキシリン−エオジン染色を行った。
再構成歯胚にGFPマウス由来の歯胚を用いた場合は、50%(w/v)スクロース−4%パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液で18時間固定した後、4.5%のEDTA(pH7.2)で24時間脱灰し、OCT compound(Miles Inc., Naperville, IL)に包埋して、クリオスタット (Leica, Wetzlar, Germany)で10μmの切片を作製し、蛍光顕微鏡(Zeiss社製)で観察した。
歯胚組織のまま培養した結果を図3に、本発明の製造方法に従って培養した結果を図4〜7に示す。
またゲルドロップ内に配置された直後には、細胞凝集塊を構成する細胞が顕微鏡下で単独で存在することが認められるが、1日の短期の培養によって、摘出した正常歯胚と同様に、細胞の結合が強固になり、ひとつのまとまりのある組織へと変化した。このことから、移植前の短期の培養が歯の形成に有効であることが示された。
また、低密度の細胞凝集塊を用いた比較例3の場合では、図9に示されるように、コラーゲンゲルドロップ中での培養において既に単一細胞が分散し、腎臓皮膜下に移植しても、歯としての特定構造を再構成しなかった。このことは、細胞相互作用によって歯を再構成するには、可能な限り高密度の細胞凝集塊を用いることが好ましいことが示唆された。
更に、歯胚上皮系細胞と歯胚間葉系細胞とを事前に1対1で混合させ、高密度でこれら細胞を区画化することなく細胞凝集塊を形成させた比較例4の場合には、図10に示されるように、エナメル質や象牙質の硬組織は認められなかった。このことは、歯胚上皮系細胞の集合体と歯胚間葉系細胞の集合体とを別個に調製した後、区画化して細胞凝集塊を形成させることが重要であることが示された。
次に、本方法によって形成された歯が歯周組織を備えているか確認した。歯周組織の確認は、上記のHE染色像による観察に加えて、下記のようなin situ ハイブリダイゼーションを用いた。
腎皮膜下移植した再構成歯胚を移植14日目に摘出し、常法によりパラフィン包埋して10μm厚に切片化した。キシレンとエタノール希釈系列に切片を浸してパラフィンを除去した。10μg/ml Protease K (Nacalai tesque, kyoto, Japan) in PBS(-)で3分間処理し、4%パラホルムアルデヒド (Nacalai tesque) リン酸緩衝液で15分間固定した。0.1% (v/v) TritonX-100 (Sigma) in PBS(-)で3分間処理し、PBS(−)で3分間洗浄した。0.2N HCl (Wako) で10分間処理し、PBS(−)とDEPC(ジエチルピロカーボネート)waterでそれぞれ5分間洗浄した。1.5% (v/v) トリエタノールアミン(nacalai tesque), 0.33N HCl (Wako), 0.25% (v/v) 無水酢酸 (Nacalai tesque) in DEPC waterで10分間処理した後、2×SSCで10分間、2回洗浄した。Periostin (Genbank accession no. NM#015784) プローブは、センスプライマー (-7; ggctgaagatggttcctctc、配列番号1)とアンチセンスプライマー (573; gtacattgaaggaataacca、配列番号2)を用いてPCRにより取得したcDNA断片を、DIG標識して用いた。定法に従ってin situ ハイブリダイゼーションを行い、抗DIG−AP Fabフラグメント(Roche)とNBT/BCIP Stock Solution(Roche)で発色させ、Axio Imager A.1 (Zeiss)とAxioCam MRc5 (Zeiss)で解析を行なった。
このことは、実施例1〜3により作製した歯胚は、歯槽骨や歯根膜といった歯周組織を形成することができることを示している。
上記と同様にして配置工程を終了した後に、培養工程として、一般に用いられる器官培養を14日間にわたって継続して実施し、歯の発生を解析した。歯胚由来上皮組織と間葉細胞との組み合わせを実施例4とし、歯胚由来上皮細胞と間葉細胞との組み合わせを実施例5とした。なお、正常歯胚を用いて器官培養した例を比較例5とした。結果を図13に示す。
図13に示されるように、実施例4及び5のいずれも、培養期間が長くなるにつれて歯胚の大きさが大きくなり、腎皮膜下移植を実施した場合とほぼ同様の特徴的な構造を有した歯の発生が認められた。
また実施例4及び5のいずれにおいても、器官培養によって得られた歯は、複数の歯で構成された集合体(例えば、間葉細胞と上皮細胞とを用いた場合には6個;図13最下段)を形成していた。
実施例5で示されるように、再構成歯胚から得られた歯は、1個の再構成歯胚から間葉細胞及び上皮細胞を調製したにも拘わらず、複数の歯へ再誘導された。このように再構成歯胚で同時に再誘導された個々の歯が1本の歯として成長しうるかどうかを解析した。
1)複数発生させた歯胚の個別分離と器官培養
実施例3と同様にして得られた再構成歯胚を、2〜5日間器官培養し、1つの再構成歯胚から複数の歯胚を発生させた。その後、歯胚が複数発生している再構成歯胚を、器官培養2〜5日目に実体顕微鏡下で注射針とピンセットを用いて外科的に1個の歯胚に分離した。
シリコングリースを塗布したペトリディッシュに、実施例1と同様にして、Cellmatrix type I-A (Nitta gelatin, Osaka, Japan) を30μL滴下してゲルドロップを作製した。このゲルドロップに、上記個別分離歯胚を入れ、CO2インキュベーターに10分間静置してCellmatrix type I-A (Nitta Gelatin)を固形化し、10%FCS(JRH) 添加DMEM(Sigma)にセルカルチャーインサート(ポアサイズが0.4ミクロンのPETメンブレン;BD, Franklin Lakes, NJ)が接するようにセットした培養容器のセルカルチャーインサートの膜上に、個別分離歯胚を支持担体である周囲のゲルと共に移して、18−24時間、器官培養した。
2)組織学的解析
培養後、周囲のゲルごと8週齢C57BL/6の腎皮膜下に移植して14日目に周囲の腎組織ごと個別分離歯胚を摘出した。組織を、4%パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液で6時間固定した後、常法によりパラフィン包埋して、10μmの切片を作製した。組織学的解析のためには常法に従い、ヘマトキシリン−エオジン染色を行った。
分離した歯胚を腎臓皮膜下へ移植して14日間発生させ、組織学的に解析した結果を、図14に示した。図14に示されるように、移植した分離歯胚は、それぞれがエナメル質と象牙質、歯髄、歯冠、歯根という特徴を有する1本の「歯」に発生した。また、得られた歯の歯冠部にはエナメル質と象牙質が存在すること(図14中段及び下段におけるa参照)及び歯根部では歯根の開口部が存在すること(図14中段におけるb参照)がそれぞれ確認できた。
これらのことは、正常発生した歯と同様に、歯冠部においてエナメル芽細胞と象牙芽細胞が存在し、また正常発生した歯と同一の形態を有することを示しており、歯の集合体として同時に発生した個々の歯が、いずれも正常発生した歯と細胞配置及び方向性において同一であることを示していた。
1)個別分離歯胚と個別分離歯牙の作製
上記と同様にして、器官培養2〜5日目において歯胚が複数発生している再構成歯胚から、個別に分離した歯胚を作製した。一方、腎皮膜下移植して14日後に摘出した、再構成歯胚より複数発生した歯を、実体顕微鏡下で注射針とピンセットを用いて外科的に個別に分離した。
個別分離歯胚の場合、前記同様に、シリコングリースを塗布したペトリディッシュに、2.4mg/mlの濃度に上記培養液で調製したCellmatrix type I-A (Nitta gelatin, Osaka, Japan) を30μL滴下してゲルドロップを作製した。このゲルドロップに、上記個別分離歯胚を入れ、CO2インキュベーターに10分間静置してCellmatrix type I-A (Nitta Gelatin)を固化した。次いで、10%FCS(JRH) 添加DMEM(Sigma)にセルカルチャーインサート(ポアサイズが0.4ミクロンのPETメンブレン;BD, Franklin Lakes, NJ)が接するようにセットした培養容器のセルカルチャーインサートの膜上に、支持担体である周囲のゲルと共に個別分離歯胚を移して、18−24時間、器官培養した。
培養後、周囲のゲルを注射針とピンセットで外科的に除去し、8週齢C57BL/6の下顎切歯抜歯孔に移植し、実施例6とした。一方、腎臓皮膜下へ移植した再構成歯胚より個別に分離した歯の場合には、分離後ゲルに包まず、そのまま8週齢C57BL/6の下顎切歯抜歯孔に移植し、実施例7とした。
口腔内移植の3日前に、ジエチルエーテルで吸引麻酔した8週齢C57BL/6に、5mg/mlのペントバルビタールナトリウムを含む生理食塩水を、体重20gに対して200μlの割合で腹腔注射した。痛覚の麻痺したマウスの下顎切歯萌出部付近の下顎骨をメスで剥離し、顎骨に埋まっている切歯先端部を露出させた。ピンセットを用いて下顎から切歯を抜歯し、血液を脱脂綿で拭き取り止血した。食物摂取のために、抜歯は片側の下顎切歯のみとし、粉末状に砕いた飼育用の餌を毎日与えた。
なお、切歯抜歯後に移植をしなかったマウスを比較例6とした。
口腔内移植して14日目に、個別分離歯胚、並びに個別分離歯を移植した下顎骨を摘出した。4%パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液で16時間固定した後、22.5%のギ酸で72時間脱灰し、常法によりパラフィン包埋して、10μmの切片を作製した。脱灰液は下顎骨2つにつき50mlとし、脱灰48時間目に全量を交換した。組織学的解析のためには常法に従い、ヘマトキシリン−エオジン染色を行った。
個別分離歯胚、並びに個別分離歯牙にC57BL/6−TgN(act−EGFP)OsbC14-Y01-FM131マウス由来の歯胚を用いた場合は、4%パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液で16時間固定した後、22.5%のギ酸で72時間脱灰し、常法によりOCT compound(Miles Inc., Naperville, IL)に包埋して、クリオスタット (Leica, Wetzlar, Germany)で10μmの切片を作製し、蛍光顕微鏡(Zeiss社製)で観察した。
切歯抜歯後に移植をしなかった比較例6のマウスの抜歯後14日後の組織像を図15に、個別分離した歯胚(実施例6)、並びに歯(実施例7)を、切歯抜歯孔へ移植して14日後の組織像を、それぞれ図16及び図17に示した。
図15に示すように、比較例6の非移植マウスでは、切歯抜歯孔の移植部位に該当する位置に浸潤した細胞と発生した骨のみが認められ、硬組織を有する歯は認められなかった。
これに対して、図16に示すように、実施例6として個別分離した歯胚を移植した当該部位には、エナメル質を外側に、象牙質を内側に有する歯が発生した。発生した歯は、歯の先端と歯根が認められ、歯の方向性が存在し、正常発生する歯と同一の構造を有していた。
また、腎臓皮膜下へ移植して発生させた後に分離した歯を抜歯孔へ移植した実施例7のマウスでは、図17に示すように、当該部位にエナメル質を外側に、象牙質を内側に有する歯が発生した。発生した歯は、歯の先端と歯根を有しており、歯髄内部には血管が認められると共に、歯の周囲には歯根膜と歯槽骨を有しており、正常発生する歯と同一の構造を有していた。
(1)毛胞の再構成
本発明において開発した技術が、歯胚の発生に寄与するのみならず、他の器官形成にも有用な技術であることを示すために、毛胞の再構成を実施した。この実験モデルとしてマウスを用いた。
1)細胞の分離方法
C57BL/6Nマウス(日本クレアから購入)又はGreen Fluorescence Protein (EGFP) トランスジェニックマウスであるC57BL/6−TgN(act-EGFP)OsbC14-Y01-FM131(理研バイオリソースセンター)の胎齢14.5日、胚仔から上顎髭毛胞組織を顕微鏡下で常法により摘出した。上顎髭毛胞組織をCa2+,Mg2+不含リン酸緩衝液(PBS(−))で洗浄し、PBS(−)に最終濃度1.2U/mlのDispase II (Roche, Mannheim, Germany)を添加した酵素液で室温にて60分間処理した後、10%FCS(JRH Biosciences, Lenexa, KS)を添加したDMEM(Sigma, St. Louis, MO)で3回洗浄した。さらにDNase I溶液 (Takara, Siga, Japan)を最終濃度70U/mlになるよう添加し毛胞組織を分散させ、25G注射針 (Terumo, Tokyo, Japan)を用いて外科的に毛胞上皮組織と毛胞間葉組織を分離した。
一方、毛胞間葉系細胞は、毛胞間葉組織をPBS(−)で3回洗浄し、0.25%Trypsin (Sigma)、50U/mlのCollagenase I (Worthington)を含むPBS(−)で処理した。70U/mlのDNase I (Takara)を添加して、ピペッティングにより単一の毛胞間葉系細胞を得た。
次に、上記で調製された毛胞上皮系細胞及び毛胞間葉系細胞を用いた以外は実施例1と同様にして、再構成毛胞作製に用いる細胞を準備し、コラーゲンゲルドロップにそれぞれ0.2−0.3μLアプライしてそれぞれの細胞凝集塊を作製し、両者が互いに密接するようにして再構成毛胞を作製した。
3)腎皮膜下移植
ゲル中で作製した再構成毛胞は、実施例1と同様にして、培養容器のセルカルチャーインサートの膜上に、細胞塊を支持担体である周囲のゲルと共に移して、18−48時間、器官培養した。培養後、周囲のゲルごと8週齢C57BL/6の腎皮膜下に移植して異所的な毛の発生を進行させ、毛の発生を解析した。
一方、比較例7は、毛胞上皮系細胞及び毛胞間葉系細胞を用いた以外は、比較例4と同様にして、生体外で2種類の細胞を混合して1つの細胞凝集体を作製し、実施例8と同様にして腎皮膜下に移植した。
腎皮膜下に移植の場合には、移植後14日目に周囲の腎組織ごと再構成毛胞を摘出した。器官培養の場合には、同様の日数の培養後、細胞凝集塊を回収した。組織、あるいは細胞凝集塊を、4%パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液で6時間固定した後、常法によりパラフィン包埋して、10μmの切片を作製した。組織学的解析のためには常法に従い、ヘマトキシリン−エオジン染色を行った。
実施例8に係る毛胞を、同系マウスの腎臓皮膜下へ移植した結果を図18に示す。図18に示されるように、再構成毛胞を移植すると初期毛胞を構成する上皮細胞と間葉細胞との細胞間相互作用が損なわれないため、毛胞の縦断面(切片A)では上皮細胞に由来する毛包や内毛根鞘、外毛根鞘、並びに間葉細胞に由来する毛乳頭の細胞が認められた。さらに切片Aでは、毛は組織染色時に溶解するものの、完全に溶解していない毛が認められた。横断面(切片B)では、上皮細胞が毛穴を取り囲むように、内毛根鞘や外毛根鞘等の細胞配置が認められた。毛は組織染色時に溶解するため、毛の溶解残存物が認められた。
また、図19に示されるように、再構成毛胞を腎臓皮膜下へ移植して14日後に摘出した移植片には、毛胞から生えた毛が認められた。
一方、上皮、並びに間葉細胞をあらかじめ混合して、支持担体中で再構成した比較例7の場合には、図20に示されるように、毛胞組織は認められなかった。
従って、実施例8によれば、実施例1〜7の歯胚を用いて歯を作製する場合と同様に、毛胞組織から毛を作製することができた。
従って、本発明によれば、細胞間相互作用を損なうことなく多種の単一細胞から組織を再構築できるので、細胞相互作用によって構築される組織を人為的に作製することができる。
12 細胞凝集塊(第1の細胞集合体)
14 細胞凝集塊(第2の細胞集合体)
16 ピペットチップ
Claims (13)
- 支持担体の内部に、少なくともいずれか一方が歯胚由来である間葉系細胞及び上皮系細胞のいずれか一方のみから実質的になる第1の細胞集合体と、いずれか他方のみから実質的になる第2の細胞集合体とを接触させて配置すること、
前記第1及び第2の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養すること、
を含む歯の製造方法。 - 前記間葉系細胞及び上皮系細胞のいずれもが共に歯胚由来である請求項1記載の歯の製造方法。
- 第1の細胞集合体を調製する第1の調製工程と、第2の細胞集合体を調整する第2の調製工程とを、前記接触させて配置することの前に更に含む請求項1又は2記載の歯の製造方法。
- 前記支持担体の内部での成育を他の動物細胞の存在下で行うことを含む請求項1〜3のいずれか1項記載の歯の製造方法。
- 前記第1の細胞集合体及び前記第2の細胞集合体が共に単一細胞集合物である請求項1〜4のいずれか1項記載の歯の製造方法。
- 前記培養を、歯周組織が形成されるまで継続することを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項記載の歯の製造方法。
- 支持担体の内部に、少なくともいずれか一方が歯胚由来である間葉系細胞及び上皮系細胞のいずれか一方のみから実質的になる第1の細胞集合体と、いずれか他方のみから実質的になる第2の細胞集合体とを接触させて配置すること、
前記第1及び第2の細胞集合体を、前記支持担体の内部で、歯とこれに連続した歯周組織とを得るまで培養すること、
前記培養によって得られた歯周組織を単離すること
を含む歯周組織の製造方法。 - 支持担体の内部に、少なくともいずれか一方が歯胚由来である間葉系細胞及び上皮系細胞のいずれか一方のみから実質的になる第1の細胞集合体と、いずれか他方のみから実質的になる第2の細胞集合体とを接触させて配置すること、前記第1及び第2の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養することによって得られた歯の集合体。
- 前記間葉系細胞及び上皮系細胞のいずれもが共に歯胚由来である請求項8記載の歯の集合体。
- 間葉系細胞と上皮系細胞との相互作用により構築される組織の製造方法であって、
支持担体の内部に、間葉系細胞及び上皮系細胞のいずれか一方のみから実質的になる第1の細胞集合体と、いずれか他方のみから実質的になる第2の細胞集合体とを接触させて配置すること、
前記第1及び第2の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養すること、
を含む組織の製造方法。 - 第1の細胞集合体を調製する第1の調製工程と、第2の細胞集合体を調整する第2の調製工程とを、前記接触させて配置することの前に更に含む請求項10記載の組織の製造方法。
- 前記間葉系細胞及び上皮系細胞の少なくとも一方が、目的となる組織に由来する細胞であることを特徴とする請求項10又は11記載の組織の製造方法。
- 前記組織が、歯、毛髪、腎臓、肺、肝臓からなる群より選択されたものであることを特徴とする請求項10〜12のいずれか1項記載の組織の製造方法。
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