JP2002538914A

JP2002538914A - 生体組織工学用多孔性生分解性生適合性高分子支持体の製造方法

Info

Publication number: JP2002538914A
Application number: JP2000605718A
Authority: JP
Inventors: ジュンジンユン; タイガンパク; ユンソンナン
Original assignee: コリアアドバンストインスティテュートオブサイエンスアンドテクノロジ−
Priority date: 1999-03-18
Filing date: 2000-02-12
Publication date: 2002-11-19
Also published as: DE60035775T2; EP1165749A1; WO2000055300A1; DE60035775D1; US6586246B1; EP1165749B1; ES2291189T3; ATE368728T1

Abstract

(57)【要約】【課題】生体組織工学用多孔性生分解性生適合性高分子支持体の製造方法を提供すること。【解決手段】本発明は生体分解性及び生体適合性合成高分子を使用する三次元多孔性支持体の製作方法に関するもので、より詳しくは生分解性ポリエステル系高分子を有機溶媒に溶解させて非常に高い粘度の溶液を作り、それを発泡性塩と混合させることで、どんな模様ででも変形させることができるゲルを作った後、塩を発泡させて多様な模様と大きさの孔隙を有する多孔性支持体の製造方法に関するものである。本発明の目的は生分解性ポリエステル系高分子と発泡性塩が混合されたゲルを利用し、どんな形態ででも易く変形させることができ、常温の酸性溶液から発泡塩を沈出させ、所望する孔隙の大きさと孔隙率を有する高分子構造物を製作することで、生体組織を再生するための発泡培養用の生分解性高分子三次元多孔性支持体を提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】

本発明は、生体組織培養の時、支持体又は培養気質で利用する三次元多孔性支
持体の製造方法に関するものであり、より詳しくは、ゲル状を利用して支持体を
製造する場合に発泡性塩を利用する製造方法に関するものである。

【０００２】このような製造方法によって最終的な支持体が所望する形態で成形され、所望
する孔隙の大きさ及び孔隙率を有するようになる。

【０００３】

【従来技術】

生体組織再生のために活用される高分子の基本的な特性は生体分解性及び生体
適合性を有しなければならないにおいて、そのような条件を満足する高分子で乳
酸又はグリコード酸を基本単位とする脂肪族ポリエステルはアメリカ食品医薬局
（ＦＤＡ）によって承認をもらった高分子として一番広く使用されてきた。

【０００４】上述の脂肪族ポリエステルの具体的な例にはポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコ
ール酸（ＰＧＡ）、ポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ｐｏｌｙ（Ｄ
、Ｌ−ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃａｃｉｄ）、以下ＰＬＧＡとい
う）、ポリ（カポロラクトン）、ポリ（バレロラクトン）、ポリ（ヒドロキシ酪
酸塩）又はポリ（ヒドロキシバレレート（ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒａｔｅ）
）等がある。

【０００５】そのような脂肪族ポリエステルは薬物伝達用担体又は手術用縫合糸で長期間使
用され、既にその生体的合成が証明された。

【０００６】ＰＬＧＡの場合は乳酸とグリコール酸単量体の比率を調節したり、高分子合成
過程を変形させることで多様な分解寿命を有する生分解性高分子を得ることがで
きる。

【０００７】生体組織再生のためには、生体分解性及び適合性以外にも高い密度の細胞粘着
を可能するようにする広い表面積と生体内への移植以後に、血管の形成及び栄養
分、成長因子、ホルモン等の物質伝達を可能するようにする大きい孔隙の大きさ
と孔隙間との高い相好連結性（ｉｎｔｅｒｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）を有しな
ければならない。

【０００８】そのような条件を満足する多抗性支持体を作る方法は次の通りである。

【０００９】現在一番になっており、使用されてあり、商品化されたものはＰＧＡ縫合糸と
なった支持体（ｕｎｗｏｖｅｎＰＧＡｆｉｂｅｒｍｅｓｈ）で無作為的に
解かれた縫合糸の糸筋を熱処理して三次元的形態を構成するもので、非常に高い
孔隙率と孔隙の大きさ及び孔隙間の相好連結性を備えているが、機械的強度が非
常に弱いから、その応用が制限されてきた。（参照：Ａ．Ｇ．Ｍｉｋｏｓ、Ｙ．
Ｂａｏ、Ｌ．Ｇ．Ｃｉｍａ、Ｄ．Ｅ．Ｉｎｇｂｅｒ、Ｊ．Ｐ．Ｖａｃａｎｔｉ
ａｎｄＲ．Ｌａｎｇｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．（１９
９３）２７、１８３−１８９）

【００１０】粒子沈出（Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅｌｅａｃｈｉｎｇ）方法はＡ．Ｇ．Ｍｉ
ｋｏｓ等によって度々使用されており、使用する塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の
大きさによって孔隙の大きさを調節しやすい長所があるが、残存する塩化ナトリ
ウム又は、荒い形状によって招来される細胞の損傷等が問題される。（参照：Ａ
．Ｇ．Ｍｉｋｏｓ、Ｇ．Ｓａｒａｋｉｎｏｓ、Ｓ．Ｍ．Ｌｅｉｔｅ、Ｊ．Ｐ、Ｖ
ａｃａｎｔｉ、ａｎｄＲ．Ｌａｎｇｅｒ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（１９９３
）１４、５、３２３−３３０；Ａ．Ｇ．Ｍｉｋｏｓ、Ａ．Ｊ．Ｔｈｏｒｓｅｎ、
Ｌ．Ａ．Ｃｚｅｒｗｏｎｋａ、Ｙ．Ｂａｏ、Ｒ、Ｌａｎｇｅｒ、Ｄ．Ｎ．Ｗｉｎ
ｓｌｏｗ、ａｎｄＪ．Ｐ．Ｖａｃａｎｔｉ、Ｐｏｌｙｍｅｒ（１９９４）３５
、５、１０６８−１０７７）

【００１１】その他に硫化凍結乾燥法（ｅｍｕｌｓｉｏｎｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）
又は、高圧気体膨張法（ｈｉｇｈｐｒｅｓｓｕｒｅｇａｓｅｘｐａｎｓｉ
ｏｎ）等が使用され、夫々そのなりの長所を有しているが、開構造を有する孔隙
（ｏｐｅｎｃｅｌｌｕｌａｒｐｏｒｅｓ）を作りがたいという限りがある。
（参照：Ｋ．Ｗｈａｎｇ、Ｃ．Ｈ．Ｔｈｏｍａｓ、Ｋ．Ｅ．Ｈｅａｌｙ、Ｇ．Ｎ
ｕｂｅｒ、Ｐｏｌｙｍｅｒ（１９９５）３６、４、８３７−８４２；Ｄ．Ｊ．Ｍ
ｏｏｎｅｙ、Ｄ．Ｆ．Ｂａｌｄｗｉｎ、Ｎ．Ｐ．Ｓｕｈ、Ｊ．Ｐ．Ｖａｃａｎｔ
ｉ、Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（１９９６）１７、１４１７
−１４２２）

【００１２】最近は高分子溶液の状分離現状（ｐｈａｓｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）を利用
する方法がＫ．Ｗ．ＬｅｏｎｇとかＰｈ．Ｔｅｙｓｓｉｅ等によって試みたこと
があるが、それも、現在に孔隙の大きさが非常に小さいから、細胞の培養が難し
いという問題を有している。（参照：Ｈ．Ｌｏ，Ｍ．Ｓ．Ｐｏｎｔｉｃｉｅｌｌ
ｏ、Ｋ．Ｗ．Ｌｅｏｎｇ、ＴｉｓｓｕｅＥｎｇ．（１９９５）１、１５−２８
；Ｈ．Ｌｏ、Ｓ．Ｋａｄｉｙａｌａ、Ｓ．Ｅ．Ｇｕｇｇｉｎｏ、Ｋ．Ｗ．Ｌｅｏ
ｎｇ、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｓｔｅｒ．Ｒｅｓ．（１９９６）３０、４７５−
４８４；Ｃｈ．Ｓｅ．Ｈｕｇｅｎｓ、Ｖ．Ｍａｇｕｅｔ、Ｃｈ．Ｇｒａｎｄｆｉ
ｌｓ、Ｒ．Ｊｅｒｏｍｓ、Ｐｈ．Ｔｅｙｓｓｉｅ、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅ
ｒ．Ｒｅｓ．（１９９６）３０、４４９−４６１）

【００１３】以上の方法は細胞の粘着と分化を誘導することができる三次元的高分子支持体
を製造するためのものであるが、今まで生体分解性高分子で三次元組織再生用支
持体を作る方法には多い問題点が残り、現在アドバンスドティッシュサイアンス
社（ＡｄｖａｎｃｅｄＴｉｓｓｕｅＳｃｉｅｎｃｅＩｎｃ．）又はテキア
スバイオテクノロジ社（ＴｅｘａｓｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｃ．）
等に小規模製作段階にあるＰＧＡ縫合糸を利用する方法を除いては商品化となら
ない状態である。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】

本発明の目的は上述した従来技術の問題点を解決することで、所望する形態で
成形することができ、所望する孔隙の大きさ及び孔隙率を有する生分解性支持体
を製造する方法を提供することにある。

【００１５】

【課題を解決するための手段】

本発明は生体組織工学用生分解性生適合性多孔性高分子支持体において、（i
）高粘性度の高分子溶液を製造するために、生分解性高分子を有機溶媒に溶解す
る段階と、（ii）高分子/塩/有機溶媒が混合されたゲルを製造するために、高分
子溶液に発泡性の塩を均質するように混合する段階と、（iii）高分子/塩/有機
溶媒が混合されたゲルから有機溶媒を除去する段階と、（iv）三次元高分子構造
を形成させるため、有機溶媒−不在高分子/塩ゲルスラリーを高温水溶液又は酸
性溶液に浸漬させ、常温で塩を発泡する段階と、（v）高分子構造を蒸溜水に洗
った後、乾燥させる段階とからなることを特徴とする生体組織工学用生分解性生
適合性多孔性高分子支持体の製造方法を提供する。

【００１６】本明細書で使用している用語はただ本発明の具体的である実現例を述べるため
のことだけである。本明細書及び請求範囲で使用されている単数形“ａ”、“ａ
ｎ”、“ｔｈｅ”は別に指摘されたところがないと複数形を含むことである。

【００１７】本明細書で引用されている文献は本発明が属する技術分野の従来技術を明らか
にするために、文献全体に開示された事項が本明細書に参照で記入されている。

【００１８】本発明において、生体組織培養のための生分解性及び生適合性、三次元多孔性
支持体の製造は状分離及び粒子沈出に基づいた。先ず、生分解性及び生適合性高
分子を有機溶媒内に溶解して高粘性度の高濃度溶液を製造する。選択的に、高分
子溶液は高分子を溶解させない有機溶媒とさらに混合し、溶液を濃縮された溶液
のゲル状で濃縮させる。それによって、従来には高濃度を有するが、低粘性度の
ために使用することができなかった物質である生分解性、低分子量の高分子を有
する多孔性高分子支持体を得ることができる。その後、高分子量の溶液を発泡性
塩と均質に混合して高分子/塩/有機溶媒が混合されたゲルを製造し、ついでゲル
から有機溶媒を除去する。有機溶媒−不在高分子/塩ゲルスラリーを高温の水溶
液又は、酸性溶液に沈漬させて塩を発泡させることで、多孔性構造を形成させる
。ついで、構造を蒸溜水に洗い、冷凍乾燥させて細胞培養及び組織培養に適合す
る支持体を得る。

【００１９】上述の生分解性高分子はポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、無定形高分子である
ポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸）（ＰＤＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（Ｄ、Ｌ−
乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ヒ
ドロキシ酪酸塩）で選択された一つであったり、それらの共重合体させた共重合
体を含む。一方、それら生分解性高分子は分子量に構わなく使用することができ
るが、より良くは、分子量が５，０００〜５００，０００であるものを使用する
ことが多孔性支持体の製造時、良い効果を得ることができる。

【００２０】生分解性高分子を溶解させる有機溶媒は塩化メチレン、クロロホルム、アセト
ン、ジメチルスルホキシド、ジメチルメタンアミド、Ｎ−メチルピロリドシ、ジ
オキサン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、メチルエチルケトン、アセトニト
リルの中、選択された一つを使用する一方、高濃度の高分子溶液に溶解されない
ながら、高分子溶液を沈殿及び濃縮させることに使用する有機溶媒は水、エタノ
ール、メタノール、エタノール水溶液、エチルエテール、ジエチルエテール、ヘ
キサン、石油エテール、石油エテール水溶液の中で選択された一つを使用する。

【００２１】上記に使用した発泡性塩は１００〜５００μm大きさの炭酸アンモニウム、重
炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムの中、選択された一つを
使用し、それらの添加量は重量比で高分子：発泡性塩＝１：１〜１：１００であ
る。

【００２２】高分子/塩/有機溶媒のゲルから有機溶媒を除去する方法は、残存している有機
溶媒の種類によっていろいろの方法で除去することができ、沸騰点が低い塩化メ
チレン、クロロホルム、ジオキサン等は常圧又は真空乾燥を利用し、沸騰点が高
いジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メチルピロリドン等の場合には沸騰点が
低いエタノール又はメタノール等で溶媒を交換させた後、常圧又は真空乾燥させ
、除去することができる。

【００２３】高分子/発泡性塩のスラリーで塩を発泡させるのに使用する酸性水溶液から酸
性物質はクエン酸、塩酸、酢酸、ギ酸、酒石酸、サリチル酸、安息香酸、グルタ
ンミン酸の中、選択された一つを使用し、それらの酸は水又は生分解性高分子を
溶解させることに使用する塩化メチレン、クロロホルム、ジオキサン、ジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ）、メチルピロリドン等の有機溶媒を飽和させた水に添
加して使用されるが、その時使用する酸性水溶液の濃度は１％から過飽和溶液ま
で使用する。

【００２４】以下、実施例では本発明をより詳しく説明しようとする。

【００２５】それら実施例は本発明をただ説明するためのことで、本発明の要旨に従って本
発明の範囲がそれら実施例に限らないということは、当業界に通常の知識を持っ
ている者において明らかなものである。

【００２６】

【発明の実施の形態】

＜実施例I＞ポリＬ−乳酸（ＰＬＬＡ）を利用した多抗性支持体重量平均分子量が３００，０００であるＰＬＬＡと塩化メチレンを重量比１：
６の比にしてＰＬＬＡを塩化メチレンに溶解させ、高分子溶液を製造した後、常
圧下で溶媒をゆっくり蒸発させ、高分子溶液の粘度を増加させた。１００から５
００μm大きさの分布を有する重炭酸アンモニアム塩を質量比である高分子：塩
＝１：６の比率で高分子溶液に添加した後、均一に混合させて高分子/塩/溶媒に
構成されたゲルを形成した。

【００２７】半径２５mm、厚さ３mmの黄銅鋳物に高分子ゲルを注入した後、常圧下で溶媒で
ある塩化メチレンを蒸発させて除去した後、高分子/塩混合物を鋳物から分離し
、１４日間真空状態（９×１０^-6Torr）で塩を除去した後、４０℃の蒸溜水に沈
殿させた後、残っている塩を沈出方法で完全に除去させて支持体を製造した。

【００２８】塩を完全に除去させた高分子支持体は真空乾燥させた後、水銀注入孔隙測定器
（ＭｅｒｃｕｒｙＩｎｔｒｕｓｉｏｎＰｏｒｏｓｉｍｅｔｒｙＭａｔｅｒ
ｉａｌｓ、Ｉｎｃ．、Ｉｔｈａｃａ、ＮＹ）を利用して孔隙率と孔隙の総積を測
定し、その結果は次の表１に整理して示した。

【００２９】

【表１】

【００３０】一方、高分子支持体はＳｐｕｔｔｅｒコーティング機（Ｈｕｍｍｅｒｓ、ｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＵＳＡ）でアルゴンガスの圧力を５psiに調節した後、１０m
Aの電流を維持しながら５分間、金でコーティングした後、走査電子顕微鏡（Ｓ
ｃａｎｎｉｎｇＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＳＥＭ、Ｐｈｉｌ
ｌｉｐｓ５３５Ｍ）で高分子支持体の全体形状、表面及び断面の構造と内部孔
隙の形状を観察し、それを図１（ａ）（ｂ）に示された。

【００３１】＜実施例II＞ポリＬ−乳酸（ＰＬＬＡ）を利用した多抗性支持体分子量が３００，０００であるＰＬＬＡとクロロホルムを重量比１：１０〜１
：２０を使用してＰＬＬＡをクロロホルムに溶解させて高粘度の高分子溶液を製
造した。１００〜１８０μm、１８０〜３００μm、３００〜５００μm粒子大き
さの重炭酸アンモニウム塩をＰＬＬＡ：塩＝１：１０、１：１５、１：２０の質
量比で高分子溶液添加した後、均一に混合させて高分子/塩/溶媒で混合された高
分子ゲルを製造し、半径５mm、厚さ１．１mmのテフロン（登録商標）（ｔｅｆｌｏｎ（登録商標））鋳物に高分子ゲルを注入した後、常圧下で溶媒を蒸発させて除去した。溶媒を除去した後、高分子/塩混合物を鋳物から分離し、９０℃の蒸溜水３リットルに沈殿させ、塩を発泡させることで高分子支持体を製造し、それを真空乾燥機を利用して乾燥させた。

【００３２】製造した高分子支持体はＳｐｕｔｔｅｒコーティング機（Ｈｕｍｍｅｒｓ、ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＵＳＡ）でアルゴンガスの圧力を５psiに調節した後、１
０mAの電流を維持しながら５分間、金でコーティングした後、走査電子顕微鏡（
ＳｃａｎｎｉｎｇＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＳＥＭ、Ｐｈｉ
ｌｌｉｐｓ５３５Ｍ）で高分子支持体の全体形状、表面及び断面の構造と内部
孔隙の形状を観察し、高分子支持体の表面構造及び断面構造を図２に示した。

【００３３】一方、高分子支持体の製造過程で起きることができる高分子の熱的性質変化を
ジュポン（Ｄｕｐｏｎｔ）社のモデル２０００示差走査熱量計（Ｄｉｆｆｅｒｅ
ｎｔｉａｌＳｃａｎｎｉｎｇＣａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ、ＤＳＣ）で分析した
ところ、実験の温度範囲は−１０℃から２００℃まで分当１０℃の速度で加熱し
ながら実施した。

【００３４】一番目の加熱には高分子の溶融温度（ｍｅｌｔｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒ
ｅ、Ｔｍ）とそれに該当するエンタルピー（ｅｎｔｈａｌｐｙ、ΔＨｍ）とを測
定し、二番目の加熱ではガラス転移温度（ｇｌａｓｓｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
、Ｔｇ）を測定して次の表２に整理して示したが、ポリＬ−乳酸高分子（ＰＬＬ
Ａ）パウダーの溶融温度、エンタルピー、ガラス転移温度値と大きく差がないか
ら、高分子支持体を製造する過程で高分子の熱的性質は変わらなかったことを確
認することができる。

【００３５】

【表２】

【００３６】一方、高分子支持体の孔隙率と総積を水銀孔隙測定器を利用して測定し、その
結果は次の表３に示された。

【００３７】

【表３】

【００３８】表３の結果から孔隙率と孔隙の総積は塩の比率が増加することに従って増加し
、塩の大きさには大きく依存しないことがわかった。

【００３９】実施例IIからなった多孔性高分子支持体の圧縮強度（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｍｏｄｕｌｕｓ）はインストロン（Ｉｎｓｔｒｏｎ）５５３８で１０ニュート
ン（N）のｌｏａｄｃｅｌｌを分当２mmの速度で垂直降下させながら測定し、
その結果は次の表４に孔隙率と比べて示した通りである。一方、多孔性高分子支
持体の試片はＡＳＴＭＦ４５１−９５の規格によって直径６mmと高さ１２mmの
円柱形で製作して使用した。

【００４０】

【表４】

【００４１】表４の結果から孔隙率が大きくなると高分子支持体の圧縮強度が減少する傾向
を示し、塩と高分子との比が１０：１である場合非常に優れた圧縮強度を示すこ
とを確認した。

【００４２】＜試験例I＞実施例IIから製作された多孔性高分子支持体の三次元細胞培養での適合性を確
認するために、鼠の肝細胞をムニー（Ｍｏｏｎｅｙ）が開示した方法（Ｐ．Ｍ．
Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓ．Ｈｅｉｍｒａｔｈ，Ｂ．Ｓ．Ｋｉｍ，Ｄ．Ｊ．Ｍｏｏｎ
ｅｙ，ＣｅｌｌＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９９７）６，５，４６３
−４６８）によって多孔性高分子支持体内に注入し、それの注入効率を測定した
が、約９０〜９８％の高い細胞浸透率を示したから、これにて多孔性支持体が細
胞の注入に適合した構造を有していることがわかり、詳しく結果は次の表５に示
した。

【００４３】そして、多孔性支持体内に粘着された肝細胞の活性を２４時間間３７℃の常圧
下で９５％Ｏ₂と５％CO₂の存在下でＭＴＴ（３−（４、５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔ
ｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２、５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ
ｂｒｏｍｉｄｅ）を利用した肝細胞の活性分析を実施した結果、細胞の注入量が
７×１０⁴（ｃｅｌｌｓ/ｄｅｖｉｃｅ）である場合、約４０％を示し、４．８×
１０⁵（ｃｅｌｌｓ/ｄｅｖｉｃｅ）である時、約３０％で、細胞の注入量が増加
することによって肝細胞の活性が徐々に減少する傾向を示した。

【００４４】一方、セグルレン（Ｓｅｇｌｅｎ）によって報告された方法（Ｐ．Ｏ．Ｓｅｇ
ｌｅｎ、ＭｅｔｈｏｄｓＣｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７６）１３、２９〜８３
；Ｊ．Ｃ．Ｙ．Ｄｕｎｎ、Ｒ．Ｇ．Ｔｏｍｐｋｉｎｓ、Ｍ．Ｌ．Ｙａｒｍｕｓｈ
、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．（１９９１）７、２３７〜２４５）によっ
て、鼠の肝細胞を多孔性高分子支持体から分離してｔｒｙｐａｎｂｌｕｅｅ
ｘｃｌｕｓｉｏｎテストで確認した結果、約９０％以上の生存率（ｖｉａｂｉｌ
ｉｔｙ）を示した。

【００４５】

【表５】

【００４６】＜実施例III＞高分子溶液を使用したポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコー
ル酸）の多抗性支持体重量平均分子量が１８０，０００であるポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコー
ル酸）（ＰＬＧＡ）６５/３５をクロロホルムに重量比で３０％濃度まで溶解さ
せ、高い粘性を有する高分子溶液を製造した後、１８０〜３００μm大きさの重
炭酸アンモニアム塩を高分子に対して重量比１：１０、１：１５、１：２０の比
率で高分子溶液に添加して均一に混合させて高分子/塩/溶媒に構成されたゲルを
製造した。

【００４７】半径５mm、厚さ２mmのテフロン（ｔｅｆｌｏｎ）鋳物にゲルを注入され、常圧
下で溶媒を除去させた後、高分子/塩混合物を鋳物から分離して多様な濃度（２
０％、４０％、６０％、過飽和）のクエン酸溶液３リットルに入れ、攪拌させな
がら塩を発泡させた。発泡の過程を経た後、多孔性高分子支持体を回収して蒸溜
水に洗った後、真空乾燥機を利用して乾燥させた。

【００４８】乾燥過程を経た高分子支持体は水銀注入孔隙測定器（ＭｅｒｃｕｒｙＩｎｔ
ｒｕｓｉｏｎＰｏｒｏｓｉｍｅｔｒｙＭａｔｅｒｉａｌｓ、Ｉｎｃ．、Ｉｔ
ｈａｃａ、ＮＹ）を利用して孔隙率と孔隙の総積を測定した。測定された孔隙率
と孔隙の直径等は次の表６に整理した。

【００４９】

【表６】

【００５０】多孔性支持体の全体形状、表面及び断面の構造と内部孔隙の形状は走査電子顕
微鏡（ＳｃａｎｎｉｎｇＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＳＥＭ、
Ｐｈｉｌｌｉｐｓ５３５Ｍ）を利用して観察し、図３に示した。

【００５１】試料は顕微鏡で観察する前にＳｐｕｔｔｅｒコーティング機（Ｈｕｍｍｅｒｓ
、ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＵＳＡ）を利用して金でコーティングしたが、アルゴ
ンガスの圧力を５psiに合わせた後、１０mAの電流を維持しながら５分間実施し
た。

【００５２】製作された多孔性高分子支持体の圧縮強度（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎｍｏｄ
ｕｌｕｓ）はＩｎｓｔｒｏｎ５５３８を利用して測定した。試片をＡＳＴＭ
Ｆ４５１−９５規格によって直径６mmと高さ１２mmである円柱形に製作し、１０
Nのｌｏａｄｃｅｌｌを２mm/minの速度で垂直降下させながら測定した。実験
結果は次の表７に孔隙率と比べて示した。

【００５３】

【表７】

【００５４】結果的に表６のようにクエン酸の濃度を増加させると発泡性塩の発泡反応が増
加して孔隙の大きさ及び孔隙率を増加させることを確認した。又、塩の混合比を
増加させ、孔隙率が大きくなると高分子支持体の圧縮強度が減少する傾向を示し
、それを通じて孔隙率の増加が多孔性支持体の圧縮強度を減少させることを確認
した。

【００５５】＜実施例IV＞高分子沈殿物を用いたポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール
酸）の多抗性支持体実施例IIIから用いたＰＬＧＡ６５/３５をクロロホルムに溶解させた高分子溶
液に過量のエタノールを添加した後、１０分間放置し、溶液中の高分子を沈殿さ
せて濃縮した。高分子沈殿物はチューインガムのようなゲルの形態を維持した。

【００５６】エタノールを全部除去した高分子沈殿物に１８０〜３００μm粒子大きさを有
する重炭酸アンモニウム塩を塩：高分子＝１０：１の質量比に混合した。その過
程から製造された高分子/塩/溶媒ゲルスラリーは実施例IIIの場合よりゲルの含
む有機溶媒量が非常に少ない。

【００５７】ゲルを二つのテフロン鋳物（半径５mm、厚さ２mm及び半径５mm、厚さ５mm）に
注入した後、常圧下で溶媒を除去した後、高分子/塩混合物を鋳物から分離して
クエン酸過飽和溶液３リットルで塩を発泡させた。発泡が完了された多孔性高分子支持体は蒸溜水に洗って真空乾燥させて製造を完了した。

【００５８】多孔性支持体の形状と表面及び断面の構造と内部孔隙の形状は実施例IIIから
触れたように走査電子顕微鏡を利用して観察し、それを図４と図５に示した。図
４と図５からわかるように本発明によって製造された多孔性支持体はその模様と
か大きさに関係なしに相互連結性が優れる一定な大きさの孔隙が多孔性支持体全
体に均一に分布することがわかる。

【００５９】＜実施例V＞生分解性高分子ＰＬＧＡ６５/３５外にＰＬＧＡ５０/５０、ＰＬＧＡ７５/２
５を使用することを除外しては、上述の方法で多孔性高分子支持体を製造して高
分子支持体の孔隙率と孔隙直径、表面積を実施例IVとのように水銀注入孔隙測定
器を利用して測定したところ、その結果は次の表８に示した。

【００６０】

【表８】

【００６１】表８の結果から高分子沈殿物を使用して製造した多孔性高分子支持体の孔隙率
と孔隙の総積は高分子溶液から製造した多孔性支持体と大きい差がないことがわ
かる。

【００６２】又、実施例IVを通じて多孔性支持体を製造する場合、実施例IIIに比べて高分
子/塩/有機溶媒ゲルに含まれた有機溶媒の量が非常に少なくて残留溶媒除去が容
易であり、後の各種薬物を効果的に封入することができる。

【００６３】＜試験例II＞ポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）多抗性支持体を使用
した細胞培養製作された多孔性高分子支持体の三次元細胞培養適合性を確認するために鼠の
肝細胞を多孔性支持体内に注入させて培養した（図６参照）。カウプマンらが実
施した定置注入法（Ｐ．Ｍ．Ｋａｕｆｍａｎｎｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌｔｒ
ａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９９７）６、５、４６３−４６８）で多孔性高
分子支持体内に細胞を注入し、肝細胞の注入量は多孔性支持体当り７×１０⁴〜
８×１０⁴個の肝細胞を注入する範囲で実施し、全ての範囲で９０〜９５％の効
率で肝細胞が注入されることを確認した。これは多孔性支持体の孔隙間の相互連
結性が優れるから、注入された肝細胞が支持体内部にさらに均一に分布されたこ
とによって得た結果で判断された。肝細胞が注入された多孔性高分子支持体は５
％二酸化炭素（CO₂）の存在下で３７℃培養器で培養して７日間の細胞生存度を
確認した。細胞生存度ＭＴＴ（３−（４、５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ
−２−ｙｌ）−２、４ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉ
ｄｅ）を利用して測定した。図７で示したように、生存した細胞は多孔性支持体
の前半にかけて等しく分布していることがわかる。

【００６４】表９は培養７日後の細胞生存度及び肝細胞の分化機能であるアルブミン分泌量
を示したものである。

【００６５】

【表９】

【００６６】表９に示したことによると、鼠から分離した肝細胞が製作された多孔性支持体
で７日間培養後、約２０〜３０％程度減少することで示し、接種された細胞の数
に比例して生存度とアルブミン分泌量が減少することに確認された。

【００６７】

【発明の効果】

以上のように、本発明は体外に軟骨、骨、肝、心臓バルブ、消化管、尿道管等
の人工的に生体組織を再生する場合、必要な生体吸水性多孔性高分子支持体の製
造方法に関するもので、人工的に再生しようとする組織から抽出、分離した多量
の細胞を効果的に接種し、培養するために、十分な多孔性及び相互連結構造を有
する高分子マトリックスでいろいろの組織細胞の再生に効果かある。又、本発明の三次元多孔性高分子支持体は濃縮された生分解性ポリエシテル系
高分子と発泡性塩の混合で得られたゲルから発泡の過程を経て孔隙を形成する原
理を利用するもので、添加された発泡性塩の量と大きさ、又、発泡性塩のガス発
泡と塩沈出を誘発する酸性水溶液の濃度を調節して孔隙の大きさ及び孔隙率を易
く調節することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例Iで製造されたポリ（Ｌ−乳酸）の断面及び表面構造（１
ａ）を示すＳＥＭ写真。

【図２】(ａ) 実施例IIで１０：１の塩：高分子の重量比を利用して製造された
ポリ（Ｌ−乳酸）の表面構造を示すＳＥＭ写真。 (ｂ) 図２(ａ)の拡大写真。 (ｃ) 実施例IIで２０：１の塩：高分子の重量比を利用して製造された
ポリ（Ｌ−乳酸）の表面構造を示すＳＥＭ写真。 (ｄ) 図２(ｃ)の拡大写真。

【図３】実施例IIIで製造されたポリ（Ｄ．Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール
酸）多孔性支持体の表面を示しながら、拡大されたＳＥＭ写真。

【図４】(ａ) 実施例IVによって直径１０mm、厚さ２mmの大きさに製造されたポ
リ（Ｄ．Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）多孔性支持体の表面を示したＳＥＭ写
真。 (ｂ) 図４(ａ)の拡大した姿を示したＳＥＭ写真。 (ｃ) 実施例IVによって厚さ５mm、直径１０mmの大きさに製造したポリ
（Ｄ、Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）多孔性支持体の表面を示したＳＥＭ写真
。 (ｄ) 図４(ｃ)の拡大した姿を示したＳＥＭ写真。

【図５】(ａ) 直径１０mm、厚さ２mmの大きさに製造されたポリ（Ｄ．Ｌ−乳酸
−ｃｏ−グリコール酸）多孔性支持体の断面を示したＳＥＭ写真。 (ｂ) 図５(ａ)の拡大した姿を示したＳＥＭ写真。 (ｃ) 実施例２によって厚さ５mm、直径１０mmの大きさに製造したポリ
（Ｄ、Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）多孔性支持体の断面を示したＳＥＭ写真
。 (ｄ) 図５(ｃ)の拡大した姿を示した写真。

【図６】図３の多孔性支持体内に接種して７日間培養した鼠の肝細胞を示
したＳＥＭ写真。

【図７】培養した鼠の肝細胞生存を測定するためＭＴＴ試験後の生存肝細
胞の分布を示した工学顕微鏡写真。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年２月９日（２００１．２．９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【発明の名称】生体組織工学用多孔性生分解性生適合性高分子支持体の製造方法

【特許請求の範囲】

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は、生体の組織培養の時、支持体又は培養気質として利用される三次元
多孔性支持体の製造方法に関するものであり、より詳しくは、ゲル状を通して支
持体を製造する場合に発泡性塩を利用する製造方法に関するものである

【０００２】このような製造方法によって最終的な支持体が所望の形態で成形され、所望の
孔隙の大きさ及び孔隙率を有するようになる。

【０００３】

【従来技術】生体組織再生のために活用される高分子の基本的な特性は生体分解性及び生体
適合性を有するべきであるが、このような条件を満足する高分子としては乳酸又
はグリコード酸を基本単位とする脂肪族ポリエステルがアメリカ食品医薬局（Ｆ
ＤＡ）により承認された高分子として最も広く使用されてきた。

【０００４】上述の脂肪族ポリエステルの具体的な例としてはポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグ
リコール酸（ＰＧＡ）、ポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ｐｏｌｙ
（Ｄ、Ｌ−ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃａｃｉｄ）、以下ＰＬＧＡ
という）、ポリ（カポロラクトン）、ポリ（バレロラクトン）、ポリ（ヒドロキ
シ酪酸塩）又はポリ（ヒドロキシバレレート（ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒａｔ
ｅ））等がある。

【０００５】このような脂肪族ポリエステルは薬物伝達用担体又は手術用縫合糸として長く
使用され、既にその生体的合成は証明された。

【０００６】ＰＬＧＡの場合は乳酸とグリコール酸単量体との比率を調節したり、高分子合
成過程を変形させることで多様な分解寿命を有する生分解性高分子を得ることが
できる。

【０００７】生体組織再生のためには、生体分解性及び適合性以外にも高い密度の細胞粘着
を可能にする広い表面積と生体内への移植以後に、血管の形成及び栄養分、成長
因子、ホルモン等の物質伝達を可能にする大きい孔隙と孔隙間との高い相好連結
性（ｉｎｔｅｒｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）を有しなければならない。

【０００８】このような条件を満足する多抗性高分子支持体を製造する方法は次の通りであ
る。

【０００９】現在最も多く、使用されてあり、商品化されたものはＰＧＡ縫合糸からなる支
持体（ｕｎｗｏｖｅｎＰＧＡｆｉｂｅｒｍｅｓｈ）として、無作為的に解
かれた縫合糸の糸筋を熱処理して三次元的形態を構成するものであって、非常に
高い孔隙率と孔隙の大きさ及び孔隙間の相好連結性を備えているが、機械的強度
が非常に弱いから、その応用は制限されてきた。（参照：Ａ．Ｇ．Ｍｉｋｏｓ、
Ｙ．Ｂａｏ、Ｌ．Ｇ．Ｃｉｍａ、Ｄ．Ｅ．Ｉｎｇｂｅｒ、Ｊ．Ｐ．Ｖａｃａｎ
ｔｉａｎｄＲ．Ｌａｎｇｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．（
１９９３）２７、１８３−１８９）

【００１０】粒子沈出（Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅｌｅａｃｈｉｎｇ）方法はＡ．Ｇ．Ｍｉ
ｋｏｓ等によって多く使用されており、使用する塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の
大きさによって孔隙の大きさが調節しやすいという長所はあるが、残存する塩化
ナトリウム又は、荒い形状によってもたらす細胞の損傷等の問題があった。（参
照：Ａ．Ｇ．Ｍｉｋｏｓ、Ｇ．Ｓａｒａｋｉｎｏｓ、Ｓ．Ｍ．Ｌｅｉｔｅ、Ｊ．
Ｐ、Ｖａｃａｎｔｉ、ａｎｄＲ．Ｌａｎｇｅｒ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（１
９９３）１４、５、３２３−３３０；Ａ．Ｇ．Ｍｉｋｏｓ、Ａ．Ｊ．Ｔｈｏｒｓ
ｅｎ、Ｌ．Ａ．Ｃｚｅｒｗｏｎｋａ、Ｙ．Ｂａｏ、Ｒ、Ｌａｎｇｅｒ、Ｄ．Ｎ．
Ｗｉｎｓｌｏｗ、ａｎｄＪ．Ｐ．Ｖａｃａｎｔｉ、Ｐｏｌｙｍｅｒ（１９９４
）３５、５、１０６８−１０７７）

【００１１】その他に、硫化凍結乾燥法（ｅｍｕｌｓｉｏｎｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ
）又は、高圧気体膨張法（ｈｉｇｈｐｒｅｓｓｕｒｅｇａｓｅｘｐａｎｓ
ｉｏｎ）等が使用されるが、夫々それなりの長所を有しているが、開構造を有す
る孔隙（ｏｐｅｎｃｅｌｌｕｌａｒｐｏｒｅｓ）を作りにくいという限りが
ある。（参照：Ｋ．Ｗｈａｎｇ、Ｃ．Ｈ．Ｔｈｏｍａｓ、Ｋ．Ｅ．Ｈｅａｌｙ、
Ｇ．Ｎｕｂｅｒ、Ｐｏｌｙｍｅｒ（１９９５）３６、４、８３７−８４２；Ｄ．
Ｊ．Ｍｏｏｎｅｙ、Ｄ．Ｆ．Ｂａｌｄｗｉｎ、Ｎ．Ｐ．Ｓｕｈ、Ｊ．Ｐ．Ｖａｃ
ａｎｔｉ、Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（１９９６）１７、１
４１７−１４２２）

【００１２】最近は高分子溶液の状分離現状（ｐｈａｓｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）を利用
する方法がＫ．Ｗ．ＬｅｏｎｇやＰｈ．Ｔｅｙｓｓｉｅ等によって試みられたと
ころ、それも、現在では孔隙の大きさが非常に小さいから細胞の培養が難しいと
いう問題があった。（参照：Ｈ．Ｌｏ，Ｍ．Ｓ．Ｐｏｎｔｉｃｉｅｌｌｏ、Ｋ．
Ｗ．Ｌｅｏｎｇ、ＴｉｓｓｕｅＥｎｇ．（１９９５）１、１５−２８；Ｈ．Ｌ
ｏ、Ｓ．Ｋａｄｉｙａｌａ、Ｓ．Ｅ．Ｇｕｇｇｉｎｏ、Ｋ．Ｗ．Ｌｅｏｎｇ、Ｊ
．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｓｔｅｒ．Ｒｅｓ．（１９９６）３０、４７５−４８４；
Ｃｈ．Ｓｅ．Ｈｕｇｅｎｓ、Ｖ．Ｍａｇｕｅｔ、Ｃｈ．Ｇｒａｎｄｆｉｌｓ、Ｒ
．Ｊｅｒｏｍｓ、Ｐｈ．Ｔｅｙｓｓｉｅ、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅ
ｓ．（１９９６）３０、４４９−４６１）

【００１３】以上の方法は細胞の粘着と分化を誘導することができる三次元的高分子支持体
を製造するためのものであるが、今だに生体分解性高分子で三次元組織再生用支
持体を作る方法には多い問題点が残り、現在アドバンスドティッシュサイアンス
社（ＡｄｖａｎｃｅｄＴｉｓｓｕｅＳｃｉｅｎｃｅＩｎｃ．）又はテキサ
スバイオテクノロジ社（ＴｅｘａｓｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｃ．）
等で小規模製作段階にあるＰＧＡ縫合糸を利用した方法を除いては商品化となら
ない状態である。

【００１４】

【発明の解決しようとする課題】本発明の目的は上述した従来技術の問題点を解決することであって、所望の形
態で成形することができ、所望の孔隙の大きさ及び孔隙率を有する生分解性三次
元多孔性支持体を製造する方法を提供することにある。

【００１５】

【課題を解決するための手段】生体組織工学用生分解性、生適合性多孔性高分子支持体において、（i）高粘
性度の高分子溶液を製造するために、生分解性高分子を有機溶媒に溶解する段階
と、（ii）高分子/塩/有機溶媒が混合されたゲルを製造するために、高分子溶液
に発泡性塩を均質に混合する段階と、（iii）高分子/塩/有機溶媒が混合された
ゲルから有機溶媒を除去する段階と、（iv）三次元高分子構造を形成させるため
、上記有機溶媒−不在高分子/塩ゲルスラリーを高温の水溶液又は酸性溶液に浸
漬させ、常温で塩を発泡する段階と、（v）上記高分子構造を蒸溜水で洗った後
、燥させる段階とからなることを特徴とする生体組織工学用生分解性生適合性多
孔性高分子支持体の製造方法。

【００１６】本明細書から使用されている用語はただ本発明の具体的な実現例を述べるため
だけである。本明細書及び請求範囲で使用している単数形“ａ”、“ａｎ”及び
“ｔｈｅ”は別に指摘されていなければ複数形を含むものである。

【００１７】本明細書で引用している文献は、本発明が属する技術分野の従来技術を明らか
にするために、文献全体に開示された事項が本明細書に参照として記入されてい
る。

【００１８】本発明において、生体組織培養のための生分解性及び生適合性、三次元多孔性
支持体の製造は状分離及び粒子沈出に基づく。先ず、生分解性及び生適合性高分
子を有機溶媒内に溶解して高粘性度の高濃度溶液を製造する。選択的に、上記高
分子溶液は高分子を溶解させない有機溶媒とさらに混合して、上記溶液を濃縮さ
れた溶液のゲル状で濃縮させる。これによって、従来には高濃度を有するが、低
粘性度のために使用することができなかった物質の生分解性、低分子量の高分子
を有する多孔性高分子支持体を得ることができる。その後、高分子量の溶液を発
泡性塩と均質に混合して高分子/塩/有機溶媒が混合されたゲルを製造し、次いで
上記ゲルから有機溶媒を除去する。上記有機溶媒−不在高分子/塩ゲルスラリー
を高温の水溶液又は、酸性溶液に沈漬させ塩を発泡させることで、多孔性構造を
形成させる。それから、上記構造を蒸溜水で洗い、冷凍乾燥させ細胞培養及び組
織培養に適合した支持体を得る。

【００１９】上述の生分解性高分子はポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、無定形高分子である
ポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸）（ＰＤＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（Ｄ、Ｌ−
乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ヒ
ドロキシ酪酸塩）から選択された一つであったり、それらの共重合体を含む。一
方、これら生分解性高分子は分子量に関わらず使用することができるが、より好
ましくは、分子量が５，０００〜５００，０００であるものを使用することが多
孔性支持体の製造時、良い効果を得ることができる。

【００２０】生分解性高分子を溶解させる有機溶媒は塩化メチレン、クロロホルム、アセト
ン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジ
オキサン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、メチルエチルケトン、アセトニト
リルの中、選択された一つを使用する一方、高濃度の高分子溶液に溶解されなく
、高分子溶液を沈殿及び濃縮させることに使用する有機溶媒は水、エタノール、
メタノール、エタノール水溶液、エチルエテール、ジエチルエテール、ヘキサン
、石油エテール、石油エテール水溶液の中から選択された一つを使用する。

【００２１】上記で使用した発泡性塩は１００〜５００μm大きさの炭酸アンモニウム、重
炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムの中、選択された一つを
使用し、これらの添加量は重量比で高分子：発泡性塩＝１：１〜１：１００であ
る。

【００２２】高分子/塩/有機溶媒のゲルから有機溶媒を除去する方法は、残存している有機
溶媒の種類によって様々な方法で除去することができるが、沸騰点の低い塩化メ
チレン、クロロホルム、ジオキサン等は常圧又は真空乾燥を利用し、沸騰点の高
いジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メチルピロリジノン等の場合には沸騰点
の低いエタノール又はメタノール等で溶媒を交換させた後、常圧又は真空乾燥さ
せ、除去することができる。

【００２３】高分子/発泡性塩のスラリーから塩を発泡させるのに使用する酸性水溶液で酸
性物質はクエン酸、塩酸、酢酸、ギ酸、酒石酸、サリチル酸、安息香酸、グルタ
ンミン酸の中、選択された一つを使用し、これらの酸は水又は生分解性高分子を
溶解させることに使用する塩化メチレン、クロロホルム、ジオキサン、ジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ）、メチルピロリジノン等の有機溶媒を飽和させた水に
添加して使用されるが、その時、使用する酸性水溶液の濃度は１％から過飽和溶
液まで使用する。

【００２４】以下、実施例では本発明をより詳しく説明する。

【００２５】この実施例は本発明を説明するためだけで、本発明の要旨に従って本発明の範
囲がこの実施例に限られないということは、当業界では通常の知識を持っている
者において明らかなものである。

【００２６】

【発明の実施の形態】＜実施例I＞ポリＬ−乳酸（ＰＬＬＡ）を利用した多抗性支持体重量平均分子量が３００，０００であるＰＬＬＡと塩化メチレンとを重量比１
：６にしてＰＬＬＡを塩化メチレンに溶解させ、高分子溶液を製造した後、常圧
下で溶媒をゆっくり蒸発させ、高分子溶液の粘度を増加させた。１００から５０
０μmの大きさの分布を有する重炭酸アンモニアム塩を質量比の高分子：塩＝１
：６の比率で高分子溶液に添加した後、均一に混合させて高分子/塩/溶媒から構
成されたゲルを形成した。

【００２７】直径２５mm、厚さ３mmの黄銅鋳物に高分子ゲルを注入した後、常圧下で溶媒で
ある塩化メチレンを蒸発させて除去した後、高分子/塩の混合物を鋳物から分離
し、１４日間真空状態（９×１０^−６Torr）で塩を除去した後、４０℃の蒸溜水
に沈殿させた後、残っている塩を沈出方法で完全に除去させて支持体を製造した
。

【００２８】塩を完全に除去させた高分子支持体は真空乾燥させた後、水銀注入孔隙測定器
（ＭｅｒｃｕｒｙＩｎｔｒｕｓｉｏｎＰｏｒｏｓｉｍｅｔｒｙ；Ｐｏｒｏｕ
ｓＭａｔｅｒｉａｌｓ、Ｉｎｃ．、Ｉｔｈａｃａ、ＮＹ）を利用して孔隙率と
孔隙の総体積を測定し、その結果は次の表１に整理して示した。

【００２９】

【表１】

【００３０】一方、高分子支持体はＳｐｕｔｔｅｒコーティング機（Ｈｕｍｍｅｒｓ、ｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＵＳＡ）のアルゴンガスの圧力を５psiで調節した後、５mA
の電流を維持しながら５分間、金でコーティングした後、走査電子顕微鏡（Ｓｃ
ａｎｎｉｎｇＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＳＥＭ、Ｐｈｉｌｌ
ｉｐｓ５３５Ｍ）で高分子支持体の全体形状、表面及び断面の構造と内部孔隙
の形状を観察し、それを図１（ａ）、１（ｂ）に示された。

【００３１】＜実施例II＞ポリＬ−乳酸（ＰＬＬＡ）を利用した多孔性支持体分子量が３００，０００であるＰＬＬＡとクロロホルムとを重量比１：１０〜
１：２０にしてＰＬＬＡをクロロホルムに溶解させて高粘度の高分子溶液を製造
した。１００〜１８０μm、１８０〜３００μm、３００〜５００μm粒子大きさ
の重炭酸アンモニウム塩をＰＬＬＡ：塩＝１：１０、１：１５、１：２０の質量
比で高分子溶液添加した後、均一に混合させて高分子/塩/溶媒で混合された高分
子ゲルを製造し、直径５mm、厚さ１．１mmのテフロン（ｔｅｆｌｏｎ）鋳物に高
分子ゲルを注入した後、常圧下で溶媒を蒸発させて除去した。溶媒を除去した後
、高分子/塩混合物を鋳物から分離し、９０℃の蒸溜水３リットルに沈殿させ、
塩を発泡させることで高分子支持体を製造し、それを真空乾燥機で乾燥させた。

【００３２】製造した高分子支持体はＳｐｕｔｔｅｒコーティング機（Ｈｕｍｍｅｒｓ、ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＵＳＡ）のアルゴンガスの圧力を５psiに調節した後、５m
Aの電流を維持しながら５分間、金でコーティングした後、走査電子顕微鏡（Ｓ
ｃａｎｎｉｎｇＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＳＥＭ、Ｐｈｉｌ
ｌｉｐｓ５３５Ｍ）で高分子支持体の全体形状、表面及び断面の構造と内部孔
隙の形状を観察し、高分子支持体の表面構造及び断面構造を図２に示した。図２
ａ及び２ｂは質量比１：１０のＰＬＬＡ：塩を用いた支持体に関することであり
、図２ｃ及び図２ｄは質量比１：２０のＰＬＬＡ：塩を用いた支持体に関するこ
とである。上記図面でみたように、塩の比率が高くなればなるほど孔隙の大きさ
が増加される。

【００３３】一方、高分子支持体の製造過程で起きることができる高分子の熱的性質変化を
ジュポン（Ｄｕｐｏｎｔ）社のモデル２０００示差走査熱量計（Ｄｉｆｆｅｒｅ
ｎｔｉａｌＳｃａｎｎｉｎｇＣａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ）で分析したところ、
実験の温度範囲は−１０℃から２００℃まで分当１０℃の速度で加熱しながら実
施した。

【００３４】一番目の加熱には高分子の溶融温度（ｍｅｌｔｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒ
ｅ、Ｔｍ）とそれに該当するエンタルピー（ｅｎｔｈａｌｐｙ、_ΔＨｍ）とを測
定し、二番目の加熱ではガラス転移温度（ｇｌａｓｓｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
、Ｔｇ）を測定して次の表２に整理して示したが、ポリＬ−乳酸高分子（ＰＬＬ
Ａ）パウダーの溶融温度、エンタルピー、ガラス転移温度値と大きく差がないの
で、高分子支持体を製造する過程で高分子の熱的性質は変わらなかったことを確
認することができる。

【００３５】

【表２】

【００３６】一方、高分子支持体の孔隙率と総体積を水銀孔隙測定器を利用して測定し、そ
の結果は次の表３に示された。

【００３７】

【表３】

【００３８】表３の結果から孔隙率と孔隙の総体積は塩の比率が増加することに従って増加
し、塩の大きさにはあまり依存しないことがわかった。

【００３９】実施例IIからなった多孔性高分子支持体の圧縮強度（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｍｏｄｕｌｕｓ）はインストロン（Ｉｎｓｔｒｏｎ）５５３８で１０ニュート
ン（N）のｌｏａｄｃｅｌｌを２mm/minの速度で垂直降下させながら測定し、
その結果は次の表４に孔隙率と比べて示した通りである。一方、多孔性高分子支
持体の試片はＡＳＴＭＦ４５１−９５の規格によって直径６mmと高さ１２mmの
円柱形で製作して使用した。

【００４０】

【表４】

【００４２】＜試験例I＞実施例IIから製作された多孔性高分子支持体の三次元細胞培養での適合性を確
認するために、鼠の肝細胞をムニー（Ｍｏｏｎｅｙ）が開示した方法（Ｐ．Ｍ．
Ｋａｕｆｍａｎｎｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ
（１９９７）６、５、４６３−４６８）によって多孔性高分子支持体内に注入し
、それの注入効率を測定したが、約９０〜９８％の高い細胞浸透率を示したから
、これにて多孔性支持体が細胞の注入に適合した構造を有していることがわかり
、詳しく結果は次の表５に示した。

【００４３】そして、多孔性支持体内に粘着された肝細胞の活性を２４時間、３７℃の常圧
下で９５％のＯ_２と５％のCO_２の存在下でＭＴＴ（３−（４、５−ｄｉｍｅｔｈ
ｙｌｔｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２、５ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉ
ｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）を利用した肝細胞の活性分析を実施した結果、細胞の注
入量が７×１０^４（ｃｅｌｌｓ/ｄｅｖｉｃｅ）である場合、約４０％を現し、
４．８×１０^５（ｃｅｌｌｓ/ｄｅｖｉｃｅ）である場合、約３０％で、細胞の
注入量が増加することによる肝細胞の活性が徐々に減少する傾向を示した。

【００４５】

【表５】

【００４６】＜実施例III＞高分子溶液を使用したポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコー
ル酸）の多孔性支持体重量平均分子量が１８０，０００であるポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコー
ル酸）（ＰＬＧＡ）６５/３５をクロロホルムに重量比３０％濃度で溶解させ、
高い粘性を有する高分子溶液を製造した後、１８０〜３００μm大きさの重炭酸
アンモニアム塩を高分子に対して重量比１：１０、１：１５、１：２０の比率で
高分子溶液に添加し均一に混合させて高分子/塩/溶媒から構成されたゲルを製造
した。

【００４７】直径５mm、厚さ２mmのテフロン（ｔｅｆｌｏｎ）鋳物に上記ゲルを注入し、常
圧下で溶媒を除去させた後、高分子/塩の混合物を鋳物から分離して多様な濃度
（２０％、４０％、６０％、過飽和）のクエン酸溶液３リットルに入れ、攪拌さ
せながら塩を発泡させた。発泡の過程を経た後、多孔性高分子支持体を回収して
蒸溜水で洗った後、真空乾燥機を利用して乾燥させた。

【００４８】乾燥過程を経た高分子支持体は水銀注入孔隙測定器（ＭｅｒｃｕｒｙＩｎｔ
ｒｕｓｉｏｎＰｏｒｏｓｉｍｅｔｒｙＭａｔｅｒｉａｌｓ、Ｉｎｃ．、Ｉｔ
ｈａｃａ、ＮＹ）を利用して孔隙率と孔隙の総体積を測定した。測定された孔隙
率と孔隙の直径等は次の表６に整理した。

【００４９】

【表６】

【００５１】試料は顕微鏡で観察する前にＳｐｕｔｔｅｒコーティング機（Ｈｕｍｍｅｒｓ
、ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＵＳＡ）を利用し、金でコーティングしたが、アルゴ
ンガスの圧力を５psiに合わせた後、５mAの電流を維持しながら５分間実施した
。

【００５２】製作された多孔性高分子支持体の圧縮強度（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎｍｏｄ
ｕｌｕｓ）はＩｎｓｔｒｏｎ５５３８を利用して測定した。試片をＡＳＴＭ
Ｆ４５１−９５規格に応じて直径６mmと高さ１２mmである円柱形に製作し、１０
Nのｌｏａｄｃｅｌｌを２mm/minの速度で垂直降下させながら測定した。実験
結果は次の表７に孔隙率と比べて示した。

【００５３】

【表７】

【００５４】結果的に上記表６のようにクエン酸の濃度を増加させると発泡性塩の発泡反応
が増加して孔隙の大きさ及び孔隙率を増加させることを確認した。又、塩の混合
比を増加させ、孔隙率が大きくなると高分子支持体の圧縮強度が減少する傾向を
示し、それを通じて孔隙率の増加が多孔性支持体の圧縮強度を減少させることを
確認した。

【００５５】＜実施例IV＞高分子沈殿物を用いたポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール
酸）の多孔性支持体実施例IIIで用いたＰＬＧＡ６５/３５をクロロホルムに溶解させた高分子溶液
に過量のエタノールを添加した後、１０分間放置し、溶液中の高分子を沈殿させ
て濃縮した。高分子沈殿物はチューインガムのようなゲルの形態を維持した。

【００５６】エタノールを全部除去した高分子沈殿物に１８０〜３００μmの粒子大きさを
有する重炭酸アンモニウム塩を塩：高分子＝１０：１の質量比で混合した。この
過程から製造された高分子/塩/溶媒ゲルスラリーは実施例IIIの場合よりゲルの
含む有機溶媒量が非常に少ない。

【００５７】ゲルを二つのテフロン鋳物（直径５mm、厚さ２mm及び直径５mm、厚さ５mm）に
注入した後、常圧下で溶媒を除去した後、高分子/塩の混合物を鋳物から分離し
てクエン酸過飽和溶液３リットルで塩を発泡させた。発泡が完了された多孔性高
分子支持体は蒸溜水で洗って真空乾燥させて製造を完了した。

【００５８】多孔性支持体の形状と表面及び断面の構造と内部孔隙の形状は実施例IIIで述
べたように走査電子顕微鏡を利用して観察し、これを図４と図５に示した。図４
と図５からわかるように本発明によって製造された多孔性支持体はその模様と大
きさに関わらず相互連結性が優れた一定の大きさの孔隙が多孔性支持体全体に均
一に分布することがわかる。

【００５９】＜実施例V＞生分解性高分子ＰＬＧＡ６５/３５の外にＰＬＧＡ５０/５０、ＰＬＧＡ７５/
２５を使用することを除外しては、上述の方法で多孔性高分子支持体を製造して
高分子支持体の孔隙率と孔隙直径、表面積を実施例IVと同様に水銀注入孔隙測定
器を利用して測定したところ、その結果は次の表８に示した。

【００６０】

【表８】

【００６１】表８の結果から高分子沈殿物を使用して製造した多孔性高分子支持体の孔隙率
と孔隙の総体積は高分子溶液から製造した多孔性支持体と比べて大きな差がない
ということがわかる。

【００６２】又、実施例Vを通じて多孔性支持体を製造する場合、実施例IIIに比べて高分子
/塩/有機溶媒ゲル状に含まれた有機溶媒の量が非常に少なく残留溶媒の除去が容
易であり、その後の各種薬物を効果的に封入することができる。

【００６３】＜試験例II＞ポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）多孔性支持体を使用
した細胞培養製作された多孔性高分子支持体の三次元細胞培養適合性を確認するために鼠の
肝細胞を多孔性支持体内に注入させて培養した（図６参照）。カウプマンらが実
施した定置注入法（Ｐ．Ｍ．Ｋａｕｆｍａｎｎｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌｔｒ
ａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９９７）６、５、４６３−４６８）で多孔性高
分子支持体内に細胞を注入し、肝細胞の注入量は多孔性支持体当り７×１０^４〜
８×１０^４個の肝細胞を注入する範囲で実施し、全ての範囲で９０〜９５％の効
率で肝細胞が注入されることを確認した。これは多孔性支持体の孔隙間の相互連
結性が優れて、注入された肝細胞が支持体内部に割と均一に分布されることによ
って得られた結果であると判断される。肝細胞が注入された多孔性高分子支持体
は５％二酸化炭素（CO_２）の存在下で３７℃培養器で培養して７日間の細胞生存
度を確認した。細胞生存度ＭＴＴ（３−（４、５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚ
ｏｌ−２−ｙｌ）−２、４ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏ
ｍｉｄｅ）を利用して測定した。図７で示したように、生存した細胞は多孔性支
持体の全般にかけて等しく分布されていることがわかる。

【００６４】表９は培養７日後の細胞生存度及び肝細胞の分化機能であるアルブミン分泌
量を示したものである。

【００６５】

【表９】

【００６６】表９によると、鼠から分離した肝細胞が製作された多孔性支持体で７日間培養
後、約２０〜３０％程度減少することと現れ、接種された細胞の数に比例して生
存度とアルブミン分泌能が減少することがわかった。

【００６７】

【発明の効果】以上のように、本発明は体外で軟骨、骨、肝、心臓バルブ、消化管、尿道管等
の人工的に生体組織を再生する場合、必要な生体吸収性多孔性高分子支持体の製
造方法に関するものであり、人工的に再生しようとする組織から抽出、分離した
多量の細胞を効果的に接種し、培養するための十分な多孔性及び相互連結構造を
有する高分子マトリックスで多数の組織細胞の再生に効果がある。又、本発明の三次元多孔性高分子支持体は濃縮された生分解性ポリエステール
系高分子と発泡性塩の混合で得られたゲルから発泡の過程を経て孔隙を形成する
原理を利用するものとして、添加される発泡性塩の量と大きさ、そして、発泡性
塩のガス発泡と塩沈出を誘発する酸性水溶液の濃度を調節して孔隙の大きさ及び
孔隙率が調節しやすくできる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例Iで製造されたポリ（Ｌ−乳酸）の断面及び表面構造（１ａ）
を示すＳＥＭ写真、

【図２】（ａ）実施例IIで１０：１の塩：高分子の重量比を利用して製造され
たポリ（Ｌ−乳酸）の表面構造を示すＳＥＭ写真、（ｂ）図２（ａ）の拡大写真、（ｃ）実施例IIで２０：１の塩：高分子の重量比を利用して製造され
たポリ（Ｌ−乳酸）の表面構造を示すＳＥＭ写真、（ｄ）図２（ｃ）の拡大写真、

【図３】実施例IIIで製造されたポリ（Ｄ．Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）
多孔性支持体の表面を示しながら、拡大されたＳＥＭ写真、

【図４】（ａ）実施例IVによって直径１０mm、厚さ２mmの大きさで製造された
ポリ（Ｄ．Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）多孔性支持体の表面を示したＳＥＭ
写真、（ｂ）図４（ａ）の拡大したことを示したＳＥＭ写真、（ｃ）実施例IVによって厚さ５mm、直径１０mmの大きさに製造したポ
リ（Ｄ、Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）多孔性支持体の表面を示したＳＥＭ写
真、（ｄ）図４（ｃ）の拡大したことを示したＳＥＭ写真、

【図５】（ａ）直径１０mm、厚さ２mmの大きさで製造されたポリ（Ｄ．Ｌ−乳
酸−ｃｏ−グリコール酸）多孔性支持体の断面を示したＳＥＭ写真；（ｂ）図５（ａ）の拡大したことを示したＳＥＭ写真、（ｃ）厚さ５mm、直径１０mmの大きさで製造されたポリ（Ｄ、Ｌ−乳
酸−ｃｏ−グリコール酸）多孔性支持体の断面を示したＳＥＭ写真、（ｄ）図５（ｃ）の拡大したことを示した写真、

【図６】図３の多孔性支持体内に接種して７日間培養した鼠の肝細胞を示した
ＳＥＭ写真、

【図７】培養された鼠の肝細胞生存率を測定するためのＭＴＴ試験後の生存肝
細胞の分布を示した光学顕微鏡写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者パクタイガン大韓民国 305−761 ダイジュン−シティ，ユソン−グ，ゼンミン−ドン，エクスポアパートメント 211−1501 (72)発明者ナンユンソン大韓民国ソウル，ソンパ−グ，ザンシル−３ドン，ジュコンアパートメント 321−501 Ｆターム(参考） 4C081 AB13 AC02 BA12 BA16 CA171 CC01 DB03 DB04 DB05 EA02 4F074 AA68 AH04 BA03 BA04 BA29 BC14 CA35 CA39 DA03 DA17 DA53

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】生体組織工学用生分解性生適合性多孔性高分子支持体におい
て、（i）高粘性度の高分子溶液を製造するために、生分解性高分子を有機溶媒に
溶解する段階と、（ii）高分子/塩/有機溶媒が混合されたゲルを製造するために、前記高分子溶
液に発泡性の塩を均質するように混合する段階と、（iii）上記高分子/塩/有機溶媒が混合されたゲルから有機溶媒を除去する段
階と、（iv）三次元高分子構造を形成させるため、前記有機溶媒−不在高分子/塩ゲ
ルスラリーを高温水溶液又は酸性溶液に浸漬させ、常温で塩を発泡する段階と、（v）前記高分子構造を蒸溜水に洗った後、乾燥させる段階と、からなることを特徴とする生体組織工学用生分解性生適合性多孔性高分子支持体
の製造方法。
【請求項２】前記製造方法は、上記溶解段階以後に高分子を溶解させない
有機溶媒内に高分子を沈殿及び濃縮させる段階をさらに含むことを特徴とする請
求項１に記載の生体組織工学用多孔性生分解性高分子支持体の製造方法。
【請求項３】生分解性高分子は脂肪族ポリエステル系としてポリ（Ｌ−乳
酸）ポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸−ｃｏ
−グリコール酸）、ポリ（カプロラクトン（ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ））、ポ
リ（ヒドロキシ酪酸塩）の中、選択された一つであったり、それらの共重合体で
あることを特徴とする請求項１に記載の生体組織工学用多孔性生分解性高分子支
持体の製造方法。
【請求項４】生分解性高分子を溶解させる有機溶媒は塩化メチレン、クロ
ロホルム、アセトン、ジメチルスルホキシド、ジメチルメタンアミド、Ｎ−メチ
ルピロリドシ、ジオキサン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、メチルエチルケ
トン、アセトニトリルの中、選択された一つであることを特徴とする請求項１に
記載の生体組織工学用生多孔性生分解性高分子支持体の製造方法。
【請求項５】高濃度の高分子溶液を溶解させない高分子溶液を沈殿及び濃
縮させることに使用する有機溶媒は水、エタノール、メタノール、エタノール水
溶液、エチルエテール、ジエチルエテール、ヘキサン、石油エテール、石油エテ
ール水溶液の中、選択された一つであることを特徴とする請求項２に記載の生体
組織工学用生多孔性生分解性高分子支持体の製造方法。
【請求項６】発泡性塩は炭酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、炭酸ナ
トリウム、重炭酸ナトリウムの中、選択された一つであることを特徴とする請求
項１に記載の生体組織工学用生孔性生分解性高分子支持体の製造方法。
【請求項７】高分子/塩複合ゲルスラリーを発泡させるために、使用され
る酸性水溶液の酸はクエン酸、塩酸、酢酸、ギ酸、酒石酸、サリチル酸、安息香
酸、グルタンミン酸の中、選択された一つであることを特徴とする請求項１に記
載の生体組織工学用多孔性生分解性高分子支持体の製造方法。
【請求項８】生分解性高分子の分子量は５，０００〜５００，０００であ
ることを特徴とする請求項１又は請求項３に記載の生体組織工学用多孔性生分解
性高分子支持体の製造方法。
【請求項９】発泡性塩の大きさは１００〜５００μmであることを特徴と
する請求項１又は請求項６に記載の生体組織工学用多孔性生分解性高分子支持体
の製造方法。
【請求項１０】発泡性塩の添加重量含量は高分子重量含量に対して、１：
１から１００：１であることを特徴とする請求項１又は請求項６に記載の生体組
織工学用多孔性生分解性高分子支持体の製造方法。
【請求項１１】酸性水溶液は酸を水又は生分解性高分子を溶解させる性質
の塩化メチレン、クロロホルム、アセトン、ゾメチルスルホキシド、ジメチルメ
タンアミド、Ｎ−メチルピロリドシ、ジオキサン、テトラヒドロフラン、酢酸エ
チル、メチルエチルケトン、アセトニトリルの中、選択された一つを飽和させた
水に添加して使用することを特徴とする請求項１又は請求項７に記載の生体組織
工学用多孔性生分解性高分子支持体の製造方法。
【請求項１２】酸性水溶液の濃度は１％で過飽和溶液まで使用することを
特徴とする請求項１又は請求項７に記載の生体組織工学用多孔性生分解性高分子
支持体の製造方法。