CN104307039B - 一种同时固定rgd和ha纤维膜的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种同时固定两种生物活性物质精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽（RGD）和羟基磷灰石（HA）的纤维膜的制备方法。聚乙交酯-丙交酯（PLGA）是一种重要的制备生物可吸收的引导骨再生膜材料，但其生物性能较差；RGD是一种重要的细胞粘附序列，细胞对RGD三肽序列的亲和力极强，使黏附面积增加，增强聚酯纤维膜的生物性能；HA是人和动物骨的主要无机成分，有良好的生物相容性和骨传导作用，与骨组织结合能力强，是优良的骨组织缺损填充材料。对RGD和HA进行修饰后，引入到PLGA纤维膜，纤维膜由PLGA、HA-g-PLLA和RGD-PEG-PCL三种成分组成。本发明的优点是加强纤维膜的生物性能，促进细胞黏附，使细胞获得较好的生长环境，有利于细胞增殖。
Description
技术领域
本发明涉及一种同时固定RGD和HA纤维膜的制备方法。
背景技术
引导骨再生（Guideboneregeneration,GBR）是一种手术治疗骨缺损的有效手段，利用多孔膜作为机械屏障，在骨缺损处营造一个独立的空间，屏蔽其他组织的竞争，完成新骨重建。生物可降解聚合物，如聚乳酸（PLA），聚己内酯（PCL），聚丙交酯-乙交酯（PLGA），具有柔韧性，良好的生物相容性和可调谐的生物降解性已广泛用于膜材料，然而因为没有促进细胞黏附和增殖的生物学效应，生物可降解的GBR膜只拥有有限的临床疗效。
固定细胞识别位到生物可降解聚合物，增强细胞和聚合物之间的生物作用，对于成功应用GBR膜修复受损骨是至关重要的。RGD三肽序列是细胞基质中的许多黏附蛋白共有的细胞识别位点，研究发现许多细胞外基质蛋白，如胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维蛋白原和玻连蛋白与细胞外基质（Extracellularmatrix,ECM）通过整联蛋白的结合刺激特定的细胞的行为。羟基磷灰石（HA）具有与人体骨中无机成分相似的结构和组成，优良的骨传导性能，植入体内后，钙和磷会游离出材料表面被身体组织吸收，并促进新组织生成，但是HA与生物可降解聚酯的界面结合力较差，当复合材料植入体内，HA与聚酯基体的界面首先遭到破坏，HA纳米粒子很快就从基体中分离出来。
电纺丝是一种简单的制备合成和天然聚合物纳米纤维膜的方法。纳米纤维膜有高的比表面积和孔隙率，结构类似于天然EMC，适用于伤口敷料，药物传递，组织工程和GBR膜。本专利分别对RGD、HA进行修饰获得RGD-PEG-PCL和HA-g-PLLA，然后选用PLGA为主体聚合物，将HA-g-PLLA、RGD-PEG-PCL与其均匀共混，电纺成同时固定两种生物功能物质的纤维膜。
发明内容
本发明提供一种同时固定RGD和HA的纤维膜的制备方法。所述纤维膜是将接枝聚合物RGD-PEG-PCL和HA-g-PLLA通过电纺丝引入到PLGA纤维基体，因为固定了RGD和HA，刺激细胞在合成材料表面粘附，增强了纤维膜与细胞间的相互作用。
本发明中同时固定RGD和HA的电纺丝膜的制备方法包括如下步骤：
所述的一种接枝HA-g-PLLA的制备方法和步骤，请参阅论文，纳米羟基磷灰石表面接枝聚合左旋丙交酯，高分子学报，（1）2013。
所述的一种接枝RGD-PEG-PCL的步骤和条件如下：
PCL端羧基活化（PCL-COOH）。PCL5000的合成，以异丙醇为引发剂，甲苯为溶剂，合成分子量为5000的PCL。0.2g异丙醇为引发剂，16.7gε-己内酯以辛酸亚锡为催化剂，50mL甲苯为溶剂，115℃，N2环境下反应24h，乙醇沉降，真空干燥。PCL的端基羧化，5gPCL与20mg丁二酸酐、24.4gDMAP（4-二甲氨基吡啶）、20.2mLTEA（三乙胺）加入到的30mL二氯甲烷中，在氮气环境下室温反应24h，乙醇沉降，真空干燥。得PCL-COOH。PCL-COOH端羧基活化，4g端羧基的PCL溶解在30mL二氯甲烷中，加入0.306gEDC·HCl[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]和0.184gNHS（N-羟基琥珀酰亚胺）搅拌，在室温下反应12h。反应结束后乙醇沉降，真空干燥，得PCL-NHS。
PEG端基氨化。PEG400使用甲苯共沸除水后，真空干燥后待用。15gPEG以30mL二氯甲烷为溶剂，加入三乙胺（物质的量为甲基磺酰氯物质的量的1.1倍）和15mL的甲基磺酰氯（物质的量为PEG上羟基物质的量的20倍以上，须缓慢滴加，过快易产生副反应），在室温下反应3天。G4砂芯漏斗过滤，去除三乙胺的盐酸盐。饱和食盐水洗五次后，加入无水硫酸镁除水后过滤，使用旋转蒸发仪浓缩，乙醚沉降，真空干燥。18g酰氯处理过的样品放入到500mL的烧瓶中，加入22g氯化铵和400mL的浓氨水在40℃条件下氨解三天，加入氯化钠使溶液饱和，用三氯甲烷萃取五次，再用饱和食盐水洗两次，浓缩后乙醚沉降，真空干燥，获得端氨基的PEG。
制备RGD-PEG-PCL。PCL-PEG-NH2的合成，2.5gPCL-NHS和3g双端氨基的PEG（Mn=4000）加入到30mL二氯甲烷中，在常温下反应24h，乙醇沉降，真空干燥，得PCL-PEG-NH2。RGD-PEG-PCL的合成，将材料3gPCL-PEG-NH2溶于二氯甲烷，加入的0.067g丁二酸酐，在常温下搅拌反应24h，乙醇沉降三次，真空干燥，得PCL-PEG-COOH。将2gPCL-PEG-COOH和0.085gEDC·HCl（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）和0.051gNHS（N-羟基琥珀酰亚胺）搅拌，在室温下反应12h。反应结束后乙醇沉降，真空干燥，得PCL-PEG-NHS。0.3gPCL-PEG-NHS和12mgRGD加入到10mLDMF中在室温下反应24h，放入Mw=3500的透析袋中透析48h，冻干，得RGD-PEG-PCL。
所述的固定RGD和HA的纤维膜的步骤和条件如下：
纺丝溶液的配制，将PLGA、HA-g-PLLA、PCL-PEG-RGD按质量比1:0:0,95:5:0，90:5:5以氯仿为溶剂配置成浓度为7%、8%、8%的混合溶液，超声分散30min后，搅拌10h。在室温下，在注射器中装入纺丝溶液后将其固定在微量注射泵上，使注射器活塞与泵的推进部分紧密接触，将静电发生器的输出电缆接到注射器前端的9号金属针头上并将接收装置（铝箔）接地，调节针头与接收装置的距离为15cm。启动微量注射泵，流速设为0.2mL/h，使纺丝溶液在毛细管口形成半球形液滴。电源电压为20kV。纺丝完成后将纤维膜取下，真空干燥，获得同时固定RGD和HA的纤维膜。
纤维膜生物性能的测量。各种纤维膜（纯PLGA，HA-g-PLLA/PLGA和PCL-PEG-RGD/HA-g-PLLA/PLGA的）被分别涂到15mm的圆玻片上，圆玻片已用2％的二甲基二氯硅烷预处理并在180℃加热4h后使用。制备好的样品，在室温下真空干燥48h，然后用紫外辐射灭菌30min。
细胞黏附实验：将培养好的成骨细胞接种在24孔细胞培养板上，每孔为2×104个细胞。在37℃，5％CO2细胞培养箱中分别培养12、24和48h。在不同的时间间隔取出样品，吸弃培养基，用PBS缓冲液洗涤三次。然后将样品分别用4％多聚甲醛溶液固定10min，并用PBS洗涤三次。加入浓度为0.2mg/mL-1的异硫氰酸荧光素，染色10min，用PBS缓冲液洗涤5次，细胞成功着色。用荧光倒置显微镜对每个样品的细胞黏附的形态进行观察。使用数码相机对每个样品9个位置拍照然后用NIHJ图像分析软件得到每个样品上的成骨细胞的平均黏附率。
增殖实验：上述材料中的细胞存活率评价使用噻唑蓝（MTT）法。将样品放置在24孔培养板中，在紫外线辐射下灭菌30min。每个样品做6个平行样。在37℃，5％CO2的细胞培养箱中分别培养为1、3和7天，分别在24孔板中培养成骨细胞（每孔2×104个细胞）。培养基每2天更换一次。每孔加入50μL的MTT溶液并孵育4h。吸弃培养基每孔加入500μL的盐酸异丙醇溶液，充分震荡各孔中的溶液。每孔取出200μL溶液并转移至另一个96孔板中，然后在540nm的波长上使用酶标仪测定溶液的吸光值。使用6个样品的读数的平均值作为最终结果。
有益效果：本发明通过固定接枝修饰的RGD和HA调整纤维膜的生物性能，增强细胞黏附，使细胞获得较好的生长环境，有利于细胞增殖。
附图说明：图1：实施例2RGD的400M核磁氢谱。
图2：实施例2所制得RGD-PEG-PCL的1HNMR图谱。
图3：实施例3所制得PLGA纤维膜、HA-g-PLLA/PLGA纤维膜、HA-g-PLLA/RGD-PEG-RGD/PLGA纤维膜的SEM图片。
图4：实施例3所制得PLGA纤维膜、HA-g-PLLA/增加PLGA纤维膜、HA-g-PLLA/RGD-PEG-PCL/PLGA纤维膜的水接触角数据图。
图5：实施例3所制得PLGA、HA-g-PLLA/PLGA和HA-g-PLLA/PCL-PEG-RGD/PLGA表面MC3T3细胞黏附面积图。
图6：实施例3所制得PLGA、PLGA/HA-g-PLLAandPLGA/HA-g-PLLA/PCL-PEG-RGD表面细胞在不同时间的MTT实验数据。
如图1所示，实施例2RGD的400M核磁氢谱。
如图2所示，实施例2所制得RGD-PEG-PCL的1HNMR图谱，图中b=1.78处为RGD中-CH2CH(NH2)CO-中亚甲基的氢振动峰，e=2.55处为RGD中-CHCH2CO-中亚甲基的氢振动峰，f=3.88处为RGD中-NHCH2CO-中亚甲基的氢振动峰，说明RGD成功接枝。
如图3所示，实施例3所制得PLGA纤维膜、HA-g-PLLA/PLGA纤维膜、HA-g-PLLA/RGD-PEG-RGD/PLGA纤维膜的SEM图片，三种纤维膜中的纤维分布比较均匀，纤维表面较光滑，没有明显的结点出现，纤维的直径在1μm左右。
如图4所示，实施例3所制得PLGA纤维膜、HA-g-PLLA/增加PLGA纤维膜、HA-g-PLLA/RGD-PEG-PCL/PLGA纤维膜的水接触角数据图，固定RGD-PEG-PCL的纤维膜比HA-g-PLLA/PLGA和PLGA纤维膜呈现出了亲水性增加的趋势。
如图5所示，随着培养时间的增长，实施例3所制得三种纤维膜表面的细胞逐渐伸展，细胞面积不断增大。培养24h时，RGD-PEG-PCL/HA-g-PLLA/PLGA纤维膜和HA-g-PLLA/PLGA纤维膜的细胞面积比（Areafraction）都明显高于PLGA纤维膜并有显著性差异（P＜0.05）。在培养48h时，RGD-PEG-PCL/HA-g-PLLA/PLGA纤维膜的细胞面积比高于HA-g-PLLA/PLGA纤维膜和PLGA纤维膜。表明同时固定RGD和HA的纤维膜更有利于细胞黏附。
如图6所示，实施例3所制得PLGA、HA-g-PLLA/PLGA和RGD-PEG-PCL/HA-g-PLLA/PLGA表面细胞在不同时间的MTT实验数据，随着培养时间的增长，各种纤维膜上的细胞活力和细胞个数在增加，RGD-PEG-PCL/HA-g-PLLA/PLGA和HA-g-PLLA/PLGA纤维膜的增殖情况优于PLGA纤维膜。培养3天时，HA-g-PLLA/PLGA与RGD-PEG-PCL/HA-g-PLLA/PLGA有显著性差异。培养7天时，RGD-PEG-PCL/HA-g-PLLA/PLGA纤维膜的细胞数量明显多于其他两种纤维膜。这表明成骨细胞在固定RGD和HA纤维膜上的增殖能力和细胞活性优于HA-g-PLLA/PLGA和PLGA纤维膜。
具体实施方式：实施例1：HA-g-PLLA纳米粒子的制备
在HA表面接枝PLLA的制备方法和结构参阅专利发明人论文，纳米羟基磷灰石表面接枝聚合左旋丙交酯，高分子学报，（1）2013。
实施例2：RGD-PEG-PCL的制备
2.5gPCL端羧基活化后，与3g含双端氨基PEG反应，获得PCL-PEG-NH2。3gPCL-PEG-NH2溶于二氯甲烷，加入的0.067g丁二酸酐反应，得PCL-PEG-COOH。2gPCL-PEG-COOH和0.085gEDC·HCl（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）和0.051gNHS（N-羟基琥珀酰亚胺）搅拌，得PCL-PEG-NHS。0.3gPCL-PEG-NHS和12mgRGD加入到10mLDMF中在室温下反应24h，放入Mw=3500的透析袋中透析48h，冻干，得RGD-PEG-PCL。
实施例3：固定RGD-PEG-PCL和HA-g-PLLA的PLGA纤维膜的制备
PLGA、HA-g-PLLA和RGD-PEG-PCL按质量比1:0:0,95:5:0，90:5:5，以氯仿为溶剂配制成浓度为7%，8%，8%的混合纺丝溶液，超声分散30min后，搅拌10h。在室温下，在注射器中装入纺丝溶液后将其固定在微量注射泵上，使注射器活塞与泵的推进部分紧密接触，将静电发生器的输出电缆接到注射器前端的9号金属针头上并将接收装置（铝箔）接地，调节针头与接收装置的距离为15cm。启动微量注射泵，流速设为0.2mL/h，使纺丝溶液在毛细管口形成半球形液滴。电源电压为20kV。纺丝完成后将纤维膜取下，真空干燥，获得RGD体相改性纤维膜。
Claims (3)
1.一种同时固定RGD和HA的纤维膜的制备方法，其特征在于分别对RGD、HA进行修饰制备RGD-PEG-PCL和HA-g-PLLA，然后将PLGA、HA-g-PLLA和RGD-PEG-PCL均匀共混，电纺成纤维膜，由于PLLA、PCL与PLGA具有良好的相容性，因而使HA和RGD固定于PLGA纤维上，促进细胞粘附于合成材料表面，增强纤维膜的生物性能，所述PLGA由80％丙交酯和20％乙交酯组成，数均分子量120,000。
2.根据权利要求1所述方法制备得到的同时固定RGD和HA的纤维膜，其特征在于用于组织工程。
3.根据权利要求2所述的同时固定RGD和HA的纤维膜，其特征在于用于引导骨再生。
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