CN109078222A - 一种新型的鱼皮源口腔修复膜及其制备方法 - Google Patents

一种新型的鱼皮源口腔修复膜及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型的鱼皮源口腔修复膜及其制备方法，采用鱼皮脱细胞真皮基质与EDC/NHS交联剂进行交联得到，包括如下步骤：采用新鲜鱼皮为原料，去除鱼肉、清洗，并进行酶法脱脂、双氧水脱色，碱法与超声辅助破碎细胞，并脱除杂质，得到鱼皮脱细胞真皮基质；配制EDC/NHS交联剂；将鱼皮脱细胞真皮基质浸泡在EDC/NHS交联剂中，并将其冰浴超声，间歇1‑2min，反复数次，然后放置在磁力搅拌器中搅拌，得到交联后的口腔修复膜；无菌洗涤，干燥与包装、灭菌，本发明公开的鱼皮源口腔修复膜机械性能和热稳定性优良、抗降解能力强且安全性高。

Description

一种新型的鱼皮源口腔修复膜及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料制备技术领域，特别涉及一种新型的鱼皮源口腔修复膜及其制备方法。
背景技术
组织工程(Tissue Engineering)是近年来正在兴起的一门新学科，具有良好的发展前景和广阔的应用市场。脱细胞真皮基质(ADM)是一种优良的生物医学材料，因其具有良好的生物相容性而被广泛应用。目前的脱细胞真皮基质主要来源于陆生动物，而由于口蹄疫、疯牛病等疾病的传播和宗教信仰的限制，从水生生物中寻找医用胶原作为替代来源则变得越来越重要。
脱细胞真皮基质的主要成分是胶原蛋白，已有研究证实水生生物胶原可以被利用，具有制备生物材料的潜能。但是水生生物胶原具有机械性能差，热稳定性差，抗降解能力弱等缺点，这极大地限制了其在医用材料上的进一步发展。目前，已有研究用戊二醛(GA)交联的脱细胞真皮基质，具有优良的机械性能，热稳定性和抗降解能力，但是由于戊二醛(GA)具有毒性，用于人体皮肤修复受到限制。因此，需要制备一种安全性更高且性能良好的膜材料。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种新型的鱼皮源口腔修复膜及其制备方法，以达到机械性能和热稳定性优良、抗降解能力强且安全性高的口腔修复膜的目的。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种新型的鱼皮源口腔修复膜，采用鱼皮脱细胞真皮基质与EDC/NHS交联剂进行交联得到。
一种新型的鱼皮源口腔修复膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)预处理：采用新鲜鱼皮为原料，去除鱼肉、清洗，并进行酶法脱脂、双氧水脱色，碱法与超声辅助破碎细胞，并脱除杂质，得到鱼皮脱细胞真皮基质；
(2)配制EDC/NHS交联剂：将EDC与NHS以体积比为2:1-3:1的比例混合，配制交联剂溶液；
(3)交联：将鱼皮脱细胞真皮基质浸泡在EDC/NHS交联剂中，并将其冰浴超声，间歇1-2min，反复数次，然后将浸泡在交联剂中的鱼皮脱细胞真皮基质放置在磁力搅拌器中搅拌，得到交联后的口腔修复膜；
(4)无菌洗涤：将已交联的口腔修复膜在无菌电解质水中浸泡清洗，期间多次换水，直至溶液清亮；
(5)干燥与包装：将交联后的口腔修复膜在-40℃条件下进行冷冻，然后将其冻干，并对其进行包装、灭菌。
上述方案中，所述步骤(1)中，新鲜鱼皮采用鲟鱼皮、巴沙鱼皮、鲶鱼皮、鳗鱼皮中的一种。
上述方案中，所述步骤(3)中，将鱼皮脱细胞真皮基质修剪成1cm×1cm大小的正方形，浸泡在EDC/NHS交联剂中，将其冰浴超声10-20s，间歇1-2min，反复5-8次超声。
上述方案中，所述步骤(3)中，磁力搅拌器功率250W，转速100转/分钟，低温搅拌6-8小时。
上述方案中，所述步骤(4)中，浸泡12-48小时，期间进行5-8次换水，直至溶液清亮。
上述方案中，所述步骤(5)中，冷冻12-18小时，然后将其冻干10-12小时。
上述方案中，所述步骤(5)中，采用Co60辐照法对口腔修复膜进行灭菌。
通过上述技术方案，本发明提供的新型的鱼皮源口腔修复膜的制备方法具有以下优点：
(1)本产品的来源广泛，采用了一种新的原料，打破了以哺乳动物为原料的口腔修复膜的限制，消除了由疯牛病引起的安全隐患，使得产品安全性更高。
(2)本发明采用了一种“零长度”的交联剂--碳化二亚胺(EDC)，交联毒性低，生物相容性好。
(3)碳化二亚胺的交联作用使得口腔修复膜的机械强度、热稳定性显著性的提高，具有良好的生物相容性，与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)联用，提高了偶联效率。
(4)本发明研究的口腔修复膜制备过程中，采用了简单的方法组合，工艺简单，周期短，价格低廉，适合工业化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例所公开的交联前后巴沙鱼皮口腔修复膜在干态条件下的拉伸强度图；
图2为本发明实施例所公开的交联前后巴沙鱼皮口腔修复膜在湿态条件下的拉伸强度图；
图3为本发明实施例所公开的交联前后巴沙鱼皮口腔修复膜在干态条件下的断裂伸长率示意图；
图4为本发明实施例所公开的交联前后巴沙鱼皮口腔修复膜在湿态条件下的断裂伸长率图；
图5为本发明实施例所公开的交联前后巴沙鱼皮口腔修复膜在干态条件下的DSC图谱；
图6为本发明实施例所公开的交联前后巴沙鱼皮口腔修复膜在湿态条件下的DSC图谱；
图7为本发明实施例所公开的交联前后巴沙鱼皮脱细胞真皮基质在不同时间点的相对剩余质量示意图；
图8为本发明实施例所公开的不同植入时间的大鼠背部恢复情况和植入物示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明提供了一种鱼皮源口腔修复膜的制备方法，具体实施例如下：
实施例一：
(1)预处理：以鲟鱼皮为原料，采用物理法将其鱼肉残渣去除，并清洗干净，并进行酶法脱脂，双氧水脱色，碱法与超声辅助破碎细胞并脱除杂质，得到鱼皮脱细胞真皮基质(FSADM)。
(2)配制EDC/NHS交联剂：制备40mM EDC与NHS以2:1的比例混合的溶液。
(3)FSADM交联：将FSADM修剪成1cm*1cm大小的正方形，浸泡在EDC/NHS交联剂中并将其冰浴超声20s，间歇2min，反复5次。然后将浸泡在交联剂的FSADM放置在磁力搅拌器中搅拌6h，使其低温搅拌，其中磁力搅拌器功率250W，转速100转/分钟。
(4)无菌洗涤：将已交联的FSADM样品在无菌电解质水中浸泡清洗，为了清洗干净，期间换水5次，至溶液清亮。
(5)冷冻干燥：将交联后的口腔修复膜在-40℃条件下进行冷冻16h，然后将其冻干12h，并将其进行包装。
(6)Co60辐照灭菌：按照组织工程医用材料要求，对口腔修复膜进行Co60灭菌。
实施例二：
(1)预处理：以鲶鱼皮为原料，采用物理法将其鱼肉残渣去除，并清洗干净，并进行酶法脱脂，双氧水脱色，碱法与超声辅助破碎细胞并脱除杂质，得到鱼皮脱细胞真皮基质(FSADM)。
(2)配制EDC/NHS交联剂：制备35mM EDC与NHS以3:1的比例混合的溶液。
(3)FSADM交联：将FSADM修剪成1cm*1cm大小的正方形，浸泡在EDC/NHS交联剂中并将其冰浴超声15s，间歇1min，反复6次。然后将浸泡在交联剂的FSADM放置在磁力搅拌器中搅拌7h，使其低温搅拌，其中磁力搅拌器功率250W，转速100转/分钟。
(4)无菌洗涤：将已交联的FSADM样品在无菌电解质水中浸泡清洗，为了清洗干净，期间换水8次，至溶液清亮。
(5)冷冻干燥：将交联后的口腔修复膜在-40℃条件下进行冷冻15h，然后将其冻干12h，并将其进行包装。
(6)Co60辐照灭菌：按照组织工程医用材料要求，对口腔修复膜进行Co60灭菌。
实施例三：
(1)预处理：以巴沙鱼皮为原料，采用物理法将其鱼肉残渣去除，并清洗干净，并进行酶法脱脂，双氧水脱色，碱法与超声辅助破碎细胞并脱除杂质，得到鱼皮脱细胞真皮基质(FSADM)。
(2)配制EDC/NHS交联剂：制备30mM EDC与NHS以2.5:1的比例混合的溶液。
(3)FSADM交联：将FSADM修剪成1cm*1cm大小的正方形，浸泡在EDC/NHS交联剂中并将其冰浴超声15s，间歇1min，反复7次。然后将浸泡在交联剂的FSADM放置在磁力搅拌器中搅拌10h，使其低温搅拌，其中磁力搅拌器功率250W，转速100转/分钟。
(4)无菌洗涤：将已交联的FSADM样品在无菌电解质水中浸泡清洗，为了清洗干净，期间换水6次，至溶液清亮。
(5)冷冻干燥：将交联后的口腔修复膜在-40℃条件下进行冷冻18h，然后将其冻干10h，并将其进行包装。
(6)Co60辐照灭菌：按照组织工程医用材料要求，对口腔修复膜进行Co60灭菌。
测试实验：
将本发明实施例三制得的EDC交联的巴沙鱼皮口腔修复膜(EDC-BADM)与未交联的巴沙鱼皮口腔修复膜(BADM)、氧化壳寡糖(OCOS)交联的巴沙鱼皮口腔修复膜(OCOS-BADM)，戊二醛(GA)交联的巴沙鱼皮口腔修复膜(GA-BADM)，未脱细胞巴沙鱼皮口腔修复膜(DM)进行性能测试，测试结果见图1至图4。不同交联剂的交联方法一致。
从图1至图2可以看出，交联后样品的湿态拉伸强度由1.0-1.5MPa提高到了3.5-4.0MPa，拉伸强度提高了将近2.1-4.0倍、交联后的样品拉伸强度显著增高，说明交联可以提升样品的机械性能，EDC-BADM与GA-BADM的拉伸强度明显高于BADM和OCOS-BADM。
从图3至图4可以看出，从断裂伸长率来看，交联后样品的湿态拉伸强度由1.0-1.5MPa提高到了3.5-4.0MPa，拉伸强度提高了将近2.1-4.0倍，交联后的机械强度显著增加。
从图5至图6的结果来看，湿热条件下的热收缩温度由58-68℃提高到了90-107℃，热收缩温度提高了1.5-3.0倍，交联后的热吸收温度显著增加，说明热稳定性性显著增强。EDC-BADM与GA-BADM的热吸收温度比较接近，明显高于BADM和OCOS-BADM。
从图7的结果来看，交联后的样品巴沙鱼皮口腔修复膜具有较好的抗降解能力。在经过48小时后，BADM和OCOS-BADM已经完全降解，EDC-BADM与GA-BADM在168小时后，相对剩余质量为65-75％，仍然有比较高的相对剩余质量。
从图8的结果来看，将材料植入大鼠体内，EDC-FSADM组逐渐含有血管的薄纤维状组织完全包裹，与大鼠结缔组织紧密结合，大鼠背部恢复情况良好，说明该修复膜与生物体具有良好的相容性。
从上面的结果明显可以看出，EDC-BADM与GA-BADM的性能比较接近，但是由于戊二醛(GA)具有毒性，因此，本发明选择了碳化二亚胺(EDC)作为交联剂，制成了一种安全性高，机械性能和热稳定性优良、抗降解能力强的鱼皮源口腔修复膜。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种新型的鱼皮源口腔修复膜，其特征在于，采用鱼皮脱细胞真皮基质与EDC/NHS交联剂进行交联得到。
2.一种新型的鱼皮源口腔修复膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)预处理：采用新鲜鱼皮为原料，去除鱼肉、清洗，并进行酶法脱脂、双氧水脱色，碱法与超声辅助破碎细胞，并脱除杂质，得到鱼皮脱细胞真皮基质；
(2)配制EDC/NHS交联剂：将EDC与NHS以体积比为2:1-3:1的比例混合，配制交联剂溶液；
(3)交联：将鱼皮脱细胞真皮基质浸泡在EDC/NHS交联剂中，并将其冰浴超声，间歇1-2min，反复数次，然后将浸泡在交联剂中的鱼皮脱细胞真皮基质放置在磁力搅拌器中搅拌，得到交联后的口腔修复膜；
(4)无菌洗涤：将已交联的口腔修复膜在无菌电解质水中浸泡清洗，期间多次换水，直至溶液清亮；
(5)干燥与包装：将交联后的口腔修复膜在-40℃条件下进行冷冻，然后将其冻干，并对其进行包装、灭菌。
3.根据权利要求2所述的一种新型的鱼皮源口腔修复膜的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，新鲜鱼皮采用鲟鱼皮、巴沙鱼皮、鲶鱼皮、鳗鱼皮中的一种。
4.根据权利要求2所述的一种新型的鱼皮源口腔修复膜的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，将鱼皮脱细胞真皮基质修剪成1cm×1cm大小的正方形，浸泡在EDC/NHS交联剂中，将其冰浴超声10-20s，间歇1-2min，反复5-8次超声。
5.根据权利要求2所述的一种新型的鱼皮源口腔修复膜的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，磁力搅拌器功率250W，转速100转/分钟，低温搅拌6-8小时。
6.根据权利要求2所述的一种新型的鱼皮源口腔修复膜的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，浸泡12-48小时，期间进行5-8次换水，直至溶液清亮。
7.根据权利要求2所述的一种新型的鱼皮源口腔修复膜的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，冷冻12-18小时，然后将其冻干10-12小时。
8.根据权利要求2所述的一种新型的鱼皮源口腔修复膜的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，采用Co60辐照法对口腔修复膜进行灭菌。
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