CN104998299A - 一种脱细胞抗钙化心脏补片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种脱细胞抗钙化心脏补片的制备方法。主要包括原料心包组织经有机试剂脱脂后，通过高盐与表面活性剂、碱的混合溶液处理，最后经灭菌处理得到脱细胞抗钙化心脏补片。本发明所制备的心脏补片由于其特殊的脱细胞抗钙化工艺，保留了原材料的胶原纤维三维孔隙结构，同时有效的去除了材料本身所含有的细胞，降低了免疫原性；材料可引导自体细胞长入，减少瘢痕组织的生成,并且具有较好的抗钙化能力；具有优异的力学性能，可抵抗心室间的动静脉压差，保证了修复效果。本发明适用于先天性心脏病所引起的房间隔缺损、室间隔缺损及主动脉狭窄等。

Description

一种脱细胞抗钙化心脏补片及其制备方法

技术领域

本发明属于组织工程学之生物材料技术，具体涉及一种脱细胞抗钙化心脏补片及其制备方法。

背景技术

    据统计，我国先天性心脏病患者超过200万人，并且每年有大约16万左右的先心病患儿出生，而80%的患儿需要使用补片进行心脏修复手术。

由于先天性心脏病所引起的心脏缺损主要为房间隔缺损、室间隔缺损及动脉导管未闭等症状，所以心脏修补材料具有一定的性能要求：1）良好的力学性能，以抵抗由于心房或心室间的血压差；2）可降解性，由于心脏部位血液丰富，因此补片置于修复部位后1周左右便会完成纤维包裹，此时补片已经完成了前期的缺损修复，补片长期留置在心脏内会有较大的可能性发生钙化，需二次手术更换补片，因此补片在完成纤维包裹后应能逐步降解，降低组织钙化的风险；3）生物相容性，减少补片植入后所引起的机体免疫反应，降低修复部位术后感染的风险。

目前临床上多使用涤纶补片或以牛心包/猪心包为原料的补片材料进行心脏修复。涤纶补片具有良好的力学强度及生物相容性，可满足心脏修复中的力学及相容性要求，但涤纶补片在体内不可降解，长期存在于体内极易引起钙化，因此使用寿命有限，钙化后需再次手术取出。牛心包/猪心包是目前临床上使用最广泛的心脏修复材料，因其良好的生物相容性以及力学强度，该材料已经适用于临床多个适应症。但目前无论同类的心脏补片产品还是医生术前处理的心包材料，均采用戊二醛处理，以降低原材料的免疫原性，但戊二醛具有较高的毒性，经戊二醛处理的心包材料在体内降解过程中,材料内胶原蛋白经戊二醛交联过的部位在裂解时会游离出戊二醛分子,影响了术后的安全性；同时戊二醛处理后的心包材料，其胶原结构发生改变，植入后易引起瘢痕组织的生成，并且材料的降解时间延长，更容易发生钙化。

发明内容：

针对现有心脏补片工艺技术存在的不足，本发明的目的在于：提供一种脱细胞抗钙化心脏补片及其制备方法。

本发明是这样实现的：

本发明的脱细胞抗钙化心脏补片的制备方法，包括牛心包/猪心包的预处理，脱细胞抗钙化处理，终末灭菌，具体方法步骤如下：

步骤一、心包材料的预处理：将新鲜的牛心包/猪心包材料，清除其表面的血污及脂肪组织后，按质量比1:5～1:20加入异丙醇或丙酮，90rpm～150rpm震荡处理8～16小时，纯化水清洗。

原料心包中附带有较多的附属脂肪组织，其材料本身的脂肪含量也较高，若工艺中不清除多余的脂肪，那么在植入人体后，异体的脂肪组织会引起的严重的免疫反应。异丙醇和丙酮均具有良好的脱脂效用，能充分的溶解脂肪。适当的震荡处理，能更好的让脱脂剂与材料接触，提高脱脂的效率。

步骤二、脱细胞抗钙化处理：将步骤一得到的牛心包/猪心包，置于0.05%～0.5%SDS、0.05%～1%氢氧化钠的1M～3M氯化钠混合溶液，或者是0.05%～0.5%SDS、0.05%～1%氢氧化钾的1M～3M氯化钠混合溶液中，37℃条件下，90rpm～150rpm震荡处理5～20分钟，再经纯化水90rpm～150rpm震荡处理30～90分钟，以此作为一个循环，共循环处理1～3次，最后用纯化水清洗至中性。

原料心包中的抗原成分主要为材料中的异体细胞及其他有机成分，高浓度的氯化钠混合溶液加以纯化水循环交替处理，可使原料中的细胞随溶液的渗透压改变而呈现收缩—溶胀的交替状态，细胞膜发生裂解进而导致细胞破碎。同时表面活性剂以及碱的存在，更有利于细胞膜磷脂双分子层结构的破碎以及细胞残片的去除。相较于戊二醛对于蛋白的交联作用来降低原料的抗原性，本发明的脱细胞效果更为彻底，材料的免疫原性更低。

由于心脏解剖结构的特殊性，修复材料若不经特殊处理很容易出现钙化的现象。而SDS等表面活性剂其亲水基团作用于胶原膜材料后，可以抑制脂质及磷脂渗入组织而阻断钙化的发生。本发明中采用的SDS、氢氧化钠/氢氧化钾、氯化钠混合溶液对心包进行处理，经纯化水清洗至溶液pH中性后，通过对SDS残留检测，表明本发明获得的脱细胞抗钙化心脏补片SDS残留量低于200ppm，符合其残留量不得高于0.05%的标准值，说明脱细胞抗钙化心脏补片具有可靠的安全性。同时通过犬心房缺损植入实验，对长期观察的实验动物取材组织进行钙含量的测定，其结果也说明了本发明制备的脱细胞抗钙化心脏补片用于心脏修复具有明显的抗钙化能力。

本发明所采用的脱细胞抗钙化工艺得到的心包补片，其胶原结构改变程度较戊二醛处理的心包材料更轻微，更接近于天然的胶原结构，因此在植入心脏缺损部位后，更有利于成纤维细胞的长入，减少了瘢痕组织生成的可能性，且脱细胞抗钙化心脏补片具有更适宜的降解周期，降低了术后钙化的风险。

步骤三、终末灭菌：将步骤二获得的心包材料，使用10KGy～25KGy Co⁶⁰辐照处理或使用环氧乙烷灭菌6小时～12小时或100keV～300keV电子束灭菌。

与现有技术相比，本发明采用了SDS与碱的氯化钠溶液作为工艺中的脱细胞抗钙化处理，相较于现有技术中使用戊二醛处理，本发明中的方法对材料结构的影响更小，且溶液的高低渗交替变化能以物理溶胀的方法脱除细胞，对胶原蛋白的结构影响也达到最小,进而降低了植入后瘢痕组织生成的概率。同时本发明中的脱细胞抗钙化处理，能有效的增强材料在心脏部位的抗钙化能力，提高了材料的修复效果。

通过动物实验证明，本发明制备的脱细胞抗钙化心脏补片具有良好的生物相容性以及抗钙化能力：

将本发明制备的脱细胞抗钙化心脏补片进行大鼠皮下植入实验，分别于术后1周，2周，4周，8周及12周取材观察材料的修复情况。结果表明，术后1周、2周取材时，植入部位附近有少量的炎症细胞；4周取材时，炎症反应减轻，并可见有少量成纤维细胞长入；8周、12周取材时，已观察不到炎症细胞存在，植入部位材料内明显可见有成纤维细胞，植入部位无瘢痕组织形成；在12周的取材中可见材料有一定的降解趋势，说明材料的生物相容性良好，并且具有可降解性。

同时将本发明制备的脱细胞抗钙化心脏补片及经戊二醛处理后的心包材料进行犬左心房植入对比实验，术后24周取材，测定修复部位组织的钙含量。结果表明，本发明制备的脱细胞抗钙化心脏补片相较于传统戊二醛处理后的心包材料，具有更好的抗钙化能力，其修复部位的组织钙含量明显低于戊二醛处理组，说明本发明制备的脱细胞抗钙化心脏补片有良好的抗钙化能力。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

    图1.为采用本发明制备的脱细胞抗钙化牛心包心脏补片与经戊二醛制备的牛心包材料的扫描电镜图片

图中，A为脱细胞抗钙化牛心包心脏补片的扫描电镜图片，B为戊二醛制备的牛心包材料的扫描电镜图片。由图中可见，脱细胞抗钙化牛心包心脏补片的微观结构相比戊二醛处理的牛心包材料更为疏松，孔隙结构更明显。

图2.为脱细胞抗钙化牛心包心脏补片的大鼠皮下植入实验组织学结果

图中，A为脱细胞抗钙化牛心包心脏补片植入大鼠皮下术后1周的取材结果，B为术后2周的取材结果，C为术后4周的取材结果，D为术后8周的取材结果，E为术后12周的取材结果。由图中可见，随着取材时间的延长，植入部位的炎症反应逐渐减轻并消失，植入部位无明显瘢痕形成。在术后12周时，已观察到材料有降解的迹象，说明脱细胞抗钙化牛心包心脏补片具有极低的免疫原性和良好的降解性能。

图3.为脱细胞抗钙化牛心包心脏补片与经戊二醛制备的牛心包材料、牛心包原料的力学性能对比

图中，A为未经处理的牛心包原料的顶破强度，B为脱细胞抗钙化牛心包心脏补片，C为经戊二醛处理的牛心包材料。对比结果表明，脱细胞抗钙化牛心包心脏补片的力学强度与原料牛心包差异不大，略低于经戊二醛处理的牛心包材料。

图4.为脱细胞抗钙化猪心包心脏补片与经戊二醛处理的猪心包材料在犬左心房植入后24周取材的钙含量对比

图中，A为脱细胞抗钙化猪心包心脏补片植入24周后的钙含量，B为经戊二醛处理的猪心包材料植入24周后的钙含量。对比结果表明，脱细胞抗钙化猪心包心脏补片相较于戊二醛处理的猪心包材料，在心房修复过程中，抗钙化的能力更加明显。

图5.为脱细胞抗钙化猪心包心脏补片与经戊二醛处理的猪心包材料在相同条件下的体外降解情况

图中可看出，脱细胞抗钙化猪心包心脏补片的降解速度较快，16小时后，其降解率已接近100%，24小时候已完全降解；而经戊二醛处理的猪心包材料在32小时后，降解率接近100%，36小时后完全降解。

具体实施方式

   以下例举本发明脱细胞抗钙化心脏补片制备方法的多个实施例。均包括心包材料的预处理，脱细胞抗钙化处理，终末灭菌的方法步骤。

实施例1：制备脱细胞抗钙化牛心包心脏补片

步骤一、心包材料的预处理：将新鲜的牛心包材料，清除其表面的血污及脂肪组织后，按质量比1:10加入异丙醇，120rpm震荡处理12小时，纯化水清洗。

步骤二、脱细胞抗钙化处理：将步骤一得到的牛心包，置于0.5%SDS、0.75%氢氧化钠的3M氯化钠混合溶液中，37℃条件下，120rpm震荡处理10分钟，再经纯化水120rpm震荡处理90分钟，以此作为一个循环，共循环处理3次，最后用纯化水清洗至中性。

步骤三、终末灭菌：使用15KGy剂量的Co⁶⁰辐照处理步骤二所得的牛心包。

牛心包材料结构较致密，本实施例中使用较高浓度的SDS、氢氧化钠的氯化钠混合溶液，加以纯化水多次循环处理，混合溶液能充分作用于材料内部的细胞，有效的去除牛心包材料的免疫原性物质。将本实施例制备的心脏补片，与经戊二醛处理制备的牛心包材料进行扫描电镜观察（图1）以及顶破强度检测（图3），并将脱细胞抗钙化牛心包心脏补片进行大鼠皮下植入实验（图2）。根据以上实验结果可得，脱细胞抗钙化牛心包心脏补片的微观结构更疏松，孔隙结构明显；其力顶破强度与原料牛心包差异不明显，略低于戊二醛处理的牛心包材料；皮下植入实验表明，脱细胞抗钙化牛心包心脏补片具有极低的免疫原性和良好的降解性能。

实施例2：制备脱细胞抗钙化猪心包心脏补片

步骤一、心包材料的预处理：将新鲜的猪心包材料，清除其表面的血污及脂肪组织后，按质量比1:15加入丙酮，120rpm震荡处理12小时，纯化水清洗。

步骤二、脱细胞抗钙化处理：将步骤一得到的猪心包，置于0.3%SDS、0.5%氢氧化钠的1.5M氯化钠混合溶液中，37℃条件下，100rpm震荡处理10分钟，再经纯化水100rpm震荡处理60分钟，以此作为一个循环，共循环处理2次，最后用纯化水清洗至中性。

步骤三、终末灭菌：使用100keV电子束处理步骤二所得的猪心包。

猪心包结构较牛心包疏松，脂肪含量也更高，因此在步骤一中，使用了更高比例的脱脂剂，以提高脱脂效果。在步骤二中，也使用了相对适中的处理强度，对猪心包胶原结构的影响更小，同时也有效的去除了材料内的细胞。将本实施例制备的脱细胞抗钙化猪心包心脏补片与经戊二醛处理的猪心包进行I型胶原酶体外降解对比（图5），结果表明经戊二醛处理的猪心包材料较本实施例制备的心脏补片，降解时间更长，说明经戊二醛处理后的材料其胶原结构的变化影响了材料的降解性能；同时将二者进行犬左心房植入，24周后处死实验动物，对植入材料部位进行钙含量测定，结果表明本实施例制备的心脏补片具有明显的抗钙化能力，优于经戊二醛处理的猪心包材料。

实施例3

步骤一、心包材料的预处理：将新鲜的牛心包材料，清除其表面的血污及脂肪组织后，按质量比1:5加入丙酮，120rpm震荡处理16小时，纯化水清洗。

步骤二、脱细胞抗钙化处理：将步骤一得到的牛心包，置于0.2%SDS、0.4%氢氧化钾的2.5M氯化钠混合溶液中，37℃条件下，130rpm震荡处理20分钟，再经纯化水130rpm震荡处理90分钟，以此作为一个循环，共循环处理2次，最后用纯化水清洗至中性。

步骤三、终末灭菌：将步骤二获得的牛心包材料，使用环氧乙烷灭菌8小时。

实施例4

步骤一、心包材料的预处理：将新鲜的猪心包材料，清除其表面的血污及脂肪组织后，按质量比1:10加入异丙醇，140rpm震荡处理10小时，纯化水清洗。

步骤二、脱细胞抗钙化处理：将步骤一得到的猪心包，置于0.25%SDS、0.6%氢氧化钠的2M氯化钠混合溶液中，37℃条件下，120rpm震荡处理20分钟，再经纯化水120rpm震荡处理90分钟，最后用纯化水清洗至中性。

步骤三、终末灭菌：使用10KGy剂量的Co⁶⁰辐照处理步骤二所得的猪心包。

Claims (2)

1.一种脱细胞抗钙化心脏补片的制备方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

1）步骤一、心包材料的预处理：将新鲜牛心包或猪心包材料经过清洗及脱脂处理，纯化水清洗;

2）步骤二、脱细胞抗钙化处理：将步骤一得到的牛心包/猪心包材料，置于表面活性剂与碱性的高浓度氯化钠溶液中，37℃条件下，90rpm～150rpm震荡处理5～20分钟，再经纯化水90rpm～150rpm震荡处理30～90分钟，以此作为一个循环，共循环处理1～3次，最后用纯化水清洗至中性;

3）步骤三、终末灭菌：将步骤二获得的牛心包/猪心包材料使用10KGy～25KGy Co⁶⁰辐照处理或使用环氧乙烷灭菌6小时～12小时或100keV～300keV电子束灭菌。

2.根据权利要求1所述的脱细胞抗钙化心脏补片制备方法，其特征在于：所述表面活性剂与碱性的高浓度氯化钠溶液，是指0.05%～0.5%SDS、0.05%～1%氢氧化钠的1M～3M氯化钠混合溶液，或者是0.05%～0.5%SDS、0.05%～1%氢氧化钾的1M～3M氯化钠混合溶液。