CN103520780A - 一种生物羊膜及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物羊膜及其制备方法。该生物羊膜为三层，自上而下分别是缓释层、羊膜层、胶原层。缓释层是由胶原和生物活性因子组成，羊膜层由经过脱细胞处理的羊膜组成,胶原层是胶原蛋白经过冷冻干燥复合而成。该生物羊膜通过原料预处理、病毒灭活、脱细胞处理、制备胶原层、制备缓释层、灭菌等步骤完成。本发明所制备的生物羊膜具有活性因子缓释功效、去除上皮细胞抗原性低、产品操作方便、不易卷曲、与周围组织黏附性好、不易滑动等特点。同时，本发明的羊膜脱细胞处理工艺有效保留了羊膜中天然的致密胶原结构，应用在肌腱修复术后能够充分发挥物理屏障作用，动物实验证明能有效起到预防发生组织粘连的作用。

Description

一种生物羊膜及其制备方法

技术领域

本发明属于医用生物材料技术，具体涉及一种生物羊膜及其制备方法。

背景技术

组织粘连是结缔组织纤维带与相邻的组织或器官结合在一起而形成的异常结构，可引起各种术后并发症：例如，肌腱修复术后粘连，严重的影响手术部位功能的恢复，甚至会造成局部功能的丧失。

羊膜，是人胎膜的内层，包含人体中最厚的基底膜及无血管的间质，羊膜免疫原性低，具有减轻炎性反应、抑制纤维组织增生等作用，可作为一种理想的组织工程修复材料。

专利CN1369555A和CN102327640A分别使用胰蛋白酶、TBS-SDS（含有十二烷基硫酸钠的TBS缓冲液）等试剂对羊膜进行脱细胞，制备得到的羊膜材料比较薄、易卷曲、黏附性较差、使用时易滑动脱落。为了克服上述缺点，专利CN100368534C采用交联技术制备复合生物衍生羊膜以改善其可操作性，但处理时使用了氯仿、甲醇、戊二醛等多种有机试剂，处理强度大，经过脱脂等多个步骤后对羊膜的天然结构破坏很大，造成胶原束排列不规则，胶原纤维断裂，同时大量的生物活性因子失活试剂残留风险高，且。针对生物衍生羊膜的不足，专利CN1943796A公开了一种辐照交联多孔网状脱细胞羊膜水凝胶辅料的制作方法，提出了水凝胶敷料的概念，但采用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸（EDTA）对羊膜进行脱细胞，极易破坏羊膜的天然结构，造成胶原纤维断裂、降低材料的力学性能，而且该专利中使用了高剂量的辐照交联和辐照消毒步骤，辐照交联过程中往往会伴随着一些副反应的发生降低产品的安全性，两次辐照过程会大大破坏天然羊膜的空间胶原结构。专利CN101040616A将羊膜与生长因子浸泡后制得药物羊膜，但仍未改善单层羊膜较薄、易卷曲的操作缺点，而且浸泡后的生长因子仅仅附着在羊膜表面，缓释性较差。

发明内容

本发明的目的在于克服现有羊膜防粘连材料及制备工艺的不足，提供一种具有缓释功能的生物羊膜及其制备方法。

本发明是这样实现的：

本发明所提出的生物羊膜，其特征在于，具有三层结构，自上而下分别为缓释层、羊膜层、胶原层。其中，缓释层是由胶原蛋白和生物活性因子组成，较薄，约为0.5～1.0μm；羊膜层为经过脱细胞处理的羊膜，保留了羊膜天然的致密胶原结构；胶原层是胶原蛋白组成，与缓释层相比较厚，约为10.0～50.0μm。三者之间通过冷冻干燥复合而成。

本发明提出的缓释生物羊膜的制备方法，其主要步骤如下：

步骤一、原料预处理：将新鲜羊膜去除表面血污，用磷酸盐缓冲液或生理盐水或纯化水清洗干净；

步骤二、病毒灭活：将步骤一的羊膜，室温25℃，浸泡于75%乙醇溶液中1～3h，或浸泡于0.1%～0.5%过氧乙酸溶液中10～30min，再用纯化水清洗3～5次；

步骤三、脱细胞处理：将步骤二的羊膜，室温25℃，置于高渗溶液中震荡0.5～3h后，用纯化水清洗干净；再采用纯化水室温震荡0.5～3h。重复1～5次，制备获得羊膜层；

所述高渗溶液为1M～5M NaCl与0.01M～0.5M NaOH的混合溶液。

上述三个步骤实现了羊膜脱细胞基质即羊膜层的制备，对羊膜进行前处理后选用了灭活的步骤，保证产品的生物安全性。通过溶胀作用破坏基质中的上皮细胞，达到去除细胞抗原性的目的。上述各步骤工艺中没有采用酶、去污剂等破坏程度强烈的工艺，充分保留了羊膜细胞外基质中天然的致密结构。

步骤四、胶原层的制备：将步骤三制得的羊膜层清洗后上皮面（光滑面）朝下置于尺寸与羊膜大小一致的容器底部，加入胶原蛋白溶液，-20℃下预冻2h后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥4～8h；

本步骤将羊膜和胶原蛋白复合制成复合生物羊膜，通过冷冻复合胶原过程增加了产品的厚度，改善了单层羊膜较薄、易卷曲的缺点。

步骤五、缓释层的制备：制备具有抑制炎症、促进伤口愈合的活性因子bFGF、EGF的一种或两种因子任意浓度混合的胶原溶液，两种活性因子的浓度范围均为2000ng/ml～20000ng/ml，通过超声雾化喷涂方式将活性溶液喷涂在羊膜的上皮面，迅速-20℃预冻2h后冷冻干燥6～12h。冷冻过程使胶原形成具有一定空隙的空间结构，而活性因子能够附着在支架空隙中形成缓释作用，最终制备得到生物羊膜。

肌腱断裂术后粘连发生的主要因素是：外源性成纤维细胞由周围组织向肌腱断端生长，形成肌腱与周围组织的粘连，同时炎症反应重亦会加重粘连程度。同类产品的作用机理大多表现为材料的物理屏障作用，隔离外源性愈合细胞向手术部位延伸，这对于预防术后粘连来说是远远不够的。研究表明bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）、EGF（表皮细胞生长因子）均能够参与并促进肌腱的内源性愈合过程，因此本步骤能够使羊膜材料不仅具有物理屏障作用，隔绝成纤维细胞向手术部位生长，同时可通过缓释生长因子刺激促进肌腱的内源性愈合修复过程。

步骤六、灭菌：将步骤五制备得到的生物羊膜经过裁剪包装后，进行钴60辐照灭菌。

本发明之生物羊膜，制备方法简单，原料来源广泛，可实现大规模的产业化生产。所制备的脱细胞羊膜处理强度低、脱细胞效果良好，能够充分保留天然羊膜的致密胶原结构。经大量动物实验证明所制备的生物缓释羊膜具有预防粘连、促进组织愈合的作用。

本发明的生物缓释羊膜具有三层结构，由缓释层、羊膜层、胶原层复合而成.以经过脱细胞处理的羊膜为支架合理分布复合胶原及活性因子，其优点在于，解决了现有单层羊膜产品薄、易卷曲、黏附性差、应用后易脱落的缺点，去除细胞后产品免疫原性低，同时赋予生物羊膜药物缓释特性、主动参与植入部位的愈合过程。本发明之制备方法，利用高低渗作用，去除羊膜中的细胞后制备羊膜层，同时完整保留羊膜中的天然胶原结构，应用在肌腱修复部位能够充分发挥材料的物理屏障作用，不会引起免疫排斥反应；复合胶原层显著的增加了产品厚度和可操作性，同时胶原与周围组织黏附性好，植入后不易产生滑动；缓释层中生物活性因子的加入则使得产品具有能够主动参与促进植入部位愈合的优点。

通过对不同羊膜脱细胞方法的组织学对比研究，结果表明本发明中羊膜脱细胞方法能够有效防止溶剂对于羊膜胶原层的破坏，去除免疫原性物质同时保留其天然的胶原致密结构。运用模拟生理缓冲液对本发明产品的缓释特性进行验证，48h内活性因子释放量能够达到总量的69.9±5.9%，具有缓慢释放的特性。同时对鸡趾深屈肌腱修复术后的防粘连有效性进行试验，结果显示与空白对照组相比，本发明产品能够在肌腱植入部位有效的发挥物理屏障及促进愈合的作用，显著的降低手术部位肌腱与周围组织粘连的发生。

以下结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的详细说明。

附图说明

图1本发明制备的缓释生物羊膜外观图

本图显示的为生物羊膜缓释层表面。

图2是采用胰酶、去污剂、和本发明脱细胞工艺对羊膜原料进行脱细胞处理后的羊膜组织学对比照片，

图中，A是采用胰酶进行脱细胞处理的羊膜组织学照片，可以看出羊膜原料经过胰酶脱细胞处理后不能完全去除上皮层的细胞，在材料边缘或较厚的部位依然后有细胞残留，同时经过酶解后的羊膜胶原层结构开始出现松散现象。B是采用而经过去污剂EDTA进行脱细胞处理的羊膜原料组织学照片，可以看出虽然EDTA能够较为完整的去除上皮细胞层，但是与本发明工艺相比，羊膜的胶原层有明显的分离和松散出现。C是本专利工艺处理的脱细胞羊膜组织学照片，可见通过溶液对于上皮细胞壁的溶胀作用去除胞内基质等可能的免疫原性物质，同时能够有效防止溶液对于羊膜胶原层的破坏，保留其天然的致密结构。

图3是在模拟生理缓冲液中体外检测本发明制备的生物羊膜活性因子缓释率时间图

通过模拟生理缓冲液生物羊膜中活性因子的释放情况，横坐标为缓释时间（h），纵坐标为活性因子释放率（%）。从图中的释放曲线图中可以看出，前期24h之内活性因子的累积释放量约为48.6±3.3%，48h释放量能够达到总量的69.9±5.9%，此后整个释放过程趋于逐渐缓慢，96h之后释放量能够达到总量的82.4±4.1%。表明本发明所制备的生物羊膜中能够缓慢释放活性因子，同时与现有发明专利中使用浸泡的方式仅使活性因子保留在羊膜表面相比，本发明产品的缓慢释放特性更加明显和持久，从而有效的促进植入部位的内源性愈合过程。

图4是将本专利发明制备的生物羊膜产品应用于鸡趾深屈肌腱修复后防粘连的有效性图片

图中A、C为空白对照组修复鸡屈肌腱3W的大体外观和组织学结果照片；图中B、D为空白对照组修复鸡屈肌腱8W的大体外观和组织学照片结果；图中E、G为生物羊膜组修复鸡屈肌腱3W的大体外观和组织学结果照片；图中F、H为生物羊膜组修复鸡屈肌腱8W的外观和组织学照片。从图中可以看出空白对照组在术后3W取材缝线部位即有明显的粘连现象出现，肌腱与周围组织粘连部位较多无法钝性分离，肌腱滑动部分受限；术后8W取材时粘连程度进一步加深，向缝合处的近、远端蔓延，肌腱滑动明显受限。而生物羊膜组术后3W取材时手术部位缝线处有少量束带状粘连，肌腱滑动轻微受限，术后8W取材时发现材料包裹部位与肌腱组织整合，肌腱可自由滑动。大体外观结果表明与空白对照组相比，生物羊膜组能够有效的预防肌腱修复术后粘连的发生。

从图之组织学图片可以看出：空白对照组在3W取材时肌腱损伤部位有大量的修复细胞，这些修复细胞从腱内和腱旁组织向损伤部位迁入，使得损伤肌腱和周围组织整合到一起，无法区分肌腱与周围组织的界限；空白对照组8W取材，肌腱损伤部位由于炎症细胞和修复细胞的迁入使得肌腱与周围组织部分粘连在一起，无法分离。而生物羊膜组3W取材时炎症反应比较轻，损伤肌腱周围无增生，肌腱与周围组织界限明显，无粘连现象；生物羊膜组8W取材时损伤肌腱内发现大量的修复细胞，肌腱内源性愈合症状明显表现，且肌腱与周围组织界限明显，无粘连发生。组织学图片结果表明与空白对照组相比，生物羊膜组能够有效的预防肌腱修复术后粘连的发生。

具体实施方式

实施例1、

步骤一、原料预处理：将新鲜羊膜去除表面血污，磷酸盐缓冲液清洗；

步骤二、病毒灭活：将步骤一的羊膜，室温25℃，浸泡于75%乙醇溶液中2h，纯化水清洗4次；

步骤三、脱细胞处理：将步骤二的羊膜，室温25℃，置于高渗溶液中(高渗溶液为4M NaCl与0.05M NaOH的混合溶液)，室温震荡2.5h后，迅速纯化水清洗，再采用纯化水室温震荡2.5h；重复1次，制备获得羊膜层；

步骤四、胶原层的制备：将步骤三制得的羊膜层清洗后上皮面（光滑面）朝下置于尺寸与羊膜大小一致的容器底部，加入胶原蛋白溶液，厚度约为10.0μm，-20℃下预冻2h后冷冻干燥4h。

步骤五、缓释层的制备：制备具有抑制炎症、抑制成纤维细胞的活性因子bFGF、EGF两种因子混合的胶原蛋白溶液，bFGF和EGF的浓度均为3000ng/ml，通过超声雾化喷涂方式将活性溶液喷涂在羊膜的上皮面，迅速-20℃预冻2h后冷冻干燥8h。

步骤六、灭菌：将步骤五制备得到的生物羊膜经过裁剪包装后，进行钴60辐照灭菌。

本实施例制备的生物羊膜厚度约为20.0μm，比单层羊膜厚度增加了约一倍，克服了单层羊膜比较薄、易卷曲的缺点，提高了产品可操作性；同时胶原蛋白与组织黏附效果好，材料植入后不易出现滑动。此实施例制备的材料适用于较细的肌腱部位，应用于肌腱修复术后，经动物实验表明该产品具有良好的防止肌腱与周围组织粘连的效果（见附图4）。

实施例2、

步骤一、原料预处理：将新鲜羊膜去除表面血污，纯化水清洗；

步骤二、病毒灭活：将步骤一的羊膜，室温25℃，浸泡于0.5%过氧乙酸溶液中10min，纯化水清洗4次；

步骤三、脱细胞处理：将步骤二的羊膜，室温25℃，置于高渗溶液中（高渗溶液为1M NaCl与0.10M NaOH的混合溶液）室温震荡0.5h后，迅速纯化水清洗，再采用纯化水室温震荡0.5h；重复5次，制备获得羊膜层；

步骤四、胶原层的制备：将步骤三制得的羊膜层清洗后上皮面（光滑面）朝下置于尺寸与羊膜大小一致的容器底部，加入胶原蛋白溶液，厚度约为40.0μm，-20℃下预冻2h后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥8h。

步骤五、缓释层的制备：制备活性因子bFGF、EGF的混合胶原溶液，bFGF和EGF的浓度均为8000ng/ml，通过超声雾化喷涂方式将活性溶液喷涂在羊膜的上皮面，迅速-20℃预冻2h后冷冻干燥10h。

步骤六、灭菌：将步骤五制备得到的生物羊膜经过裁剪包装后，进行钴60辐照灭菌。

本实施例制备的生物羊膜厚度约为50.0μm，增加材料厚度后产品操作更加方便；经过组织学检测本实施例步骤三制备的羊膜脱细胞效果良好，与其它脱细胞方法相比能够保留天然羊膜的致密胶原纤维结构（见附图2），有利于充分发挥材料的物理屏障作用，同时去除细胞后材料具有较低的免疫原性，能够有效预防术后粘连的发生。

实施例3、

步骤一、原料预处理：将新鲜羊膜去除表面血污，生理盐水清洗；

步骤二、病毒灭活：将步骤一的羊膜，室温25℃，浸泡于75%乙醇溶液中3h，纯化水清洗5次；

步骤三、脱细胞处理：将步骤二的羊膜，室温25℃，置于高渗溶液中（高渗溶液为3M NaCl与0.01M NaOH的混合溶液）室温震荡1h后，迅速纯化水清洗，再采用纯化水室温震荡1h；重复4次，制备获得羊膜层；

步骤四、胶原层的制备：将步骤三制得的羊膜层清洗后上皮面（光滑面）朝下置于尺寸与羊膜大小一致的容器底部，加入胶原蛋白溶液，厚度约为30.0μm，-20℃下预冻2h后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥8h。

步骤五、缓释层的制备：制备活性因子bFGF、EGF的混合胶原溶液，bFGF和EGF的浓度分别为8000ng/ml和12000ng/ml，通过超声雾化喷涂方式将活性溶液喷涂在羊膜的上皮面，迅速-20℃预冻2h后冷冻干燥10h。

步骤六、灭菌：将步骤五制备得到的生物羊膜经过裁剪包装后，进行钴60辐照灭菌。

本实施例制备的生物羊膜厚度约为40.0μm，材料厚度适中，易于操作，适用于多种肌腱修复术后应用；材料植入后不易滑动脱落、产品免疫原性、其中所含的活性因子能够主动参与修复部位的愈合进程，具有良好的预防组织粘连的效果。

实施例4、

步骤一、原料预处理：将新鲜羊膜去除表面血污，纯化水清洗；

步骤二、病毒灭活：将步骤一的羊膜，室温25℃，浸泡于0.1%过氧乙酸溶液中30min，纯化水清洗4次；

步骤三、脱细胞处理：将步骤二的羊膜，室温25℃，置于高渗溶液中（所述高渗溶液为5M NaCl与0.05M NaOH的混合溶液）室温震荡2.5h后，迅速纯化水清洗，再采用纯化水室温震荡2.5h；重复1次，制备获得羊膜层；

步骤四、胶原层的制备：将步骤三制得的羊膜层清洗后上皮面（光滑面）朝下置于尺寸与羊膜大小一致的容器底部，加入胶原蛋白溶液，厚度约为20.0μm，-20℃下预冻2h后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥6h。

步骤五、缓释层的制备：制备活性因子bFGF的胶原溶液，其浓度为20000ng/ml，通过超声雾化喷涂方式将活性溶液喷涂在羊膜的上皮面，迅速-20℃预冻2h后冷冻干燥6h。

步骤六、灭菌：将步骤五制备得到的生物羊膜经过裁剪包装后，进行钴60辐照灭菌。

本实施例制备的生物羊膜厚度约为30.0μm，产品操作方便、植入后不易滑动脱落、免疫原性低，可同时用于多种肌腱修复术、神经修复术后，能有效促进组织愈合，具有良好的预防粘连的效果。

实施例5、

步骤一、原料预处理：将新鲜羊膜去除表面血污，磷酸盐缓冲液清洗；

步骤二、病毒灭活：将步骤一的羊膜，室温25℃，浸泡于0.3%过氧乙酸溶液中20min，纯化水清洗3次；

步骤三、脱细胞处理：将步骤二的羊膜，室温25℃，置于高渗溶液中（所述高渗溶液为2.5M NaCl与0.10M NaOH的混合溶液）室温震荡2h后，迅速纯化水清洗，再采用纯化水室温震荡2h；重复2次，制备获得羊膜层；

步骤四、胶原层的制备：将步骤三制得的羊膜层清洗后上皮面（光滑面）朝下置于尺寸与羊膜大小一致的容器底部，加入胶原蛋白溶液，厚度约为30.0μm，-20℃下预冻2h后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥8h。

步骤五、缓释层的制备：制备活性因子EGF的胶原溶液，其浓度为15000ng/ml，通过超声雾化喷涂方式将活性溶液喷涂在羊膜的上皮面，迅速-20℃预冻2h后冷冻干燥6h。最终制备得到生物缓释羊膜。

步骤六、灭菌：将步骤五制备得到的生物羊膜经过裁剪包装后，进行钴60辐照灭菌。

本实施例制备的生物羊膜厚度约为40.0μm，产品厚度适中、操作方便、植入后不易滑动脱落、免疫原性低，其中的活性因子能够主动参与植入部位组织的愈合，可应用肌腱、神经等组织的防粘连及多种软组织的修复。

实施例6、

步骤一、原料预处理：将新鲜羊膜去除表面血污，纯化水清洗；

步骤二、病毒灭活：将步骤一的羊膜，室温25℃，浸泡于75%乙醇溶液中1h，纯化水清洗3次；

步骤三、脱细胞处理：将步骤二的羊膜，室温25℃，置于高渗溶液中（所述高渗溶液为5M NaCl与0.05M NaOH的混合溶液）室温震荡3h后，迅速纯化水清洗，再采用纯化水室温震荡3h；制备获得羊膜层；

步骤四、胶原层的制备：将步骤三制得的羊膜层清洗后上皮面（光滑面）朝下置于尺寸与羊膜大小一致的容器底部，加入胶原蛋白溶液，厚度约为20.0μm，-20℃下预冻2h后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥6h。

步骤五、缓释层的制备：制备活性因子EGF的胶原溶液，其浓度为10000ng/ml，通过超声雾化喷涂方式将活性溶液喷涂在羊膜的上皮面，迅速-20℃预冻2h后冷冻干燥6h。最终制备得到生物缓释羊膜。

步骤六、灭菌：将步骤五制备得到的生物羊膜经过裁剪包装后，进行钴60辐照灭菌。

本实施例制备的生物羊膜厚度约为30.0μm，产品厚度适中、操作方便、植入后不易滑动脱落、免疫原性低，能够促进植入部位组织的愈合，可应用肌腱、神经等组织的防粘连及多种软组织的修复。

实施例7、

步骤一、原料预处理：将新鲜羊膜去除表面血污，清洗干净；

步骤二、病毒灭活：将步骤一的羊膜，室温25℃，浸泡于75%乙醇溶液中2h，生理盐水清洗4次；

步骤三、脱细胞处理：将步骤二的羊膜，室温25℃，置于高渗溶液中（所述高渗溶液为1M NaCl与0.10M NaOH的混合溶液）室温震荡0.5h后，迅速纯化水清洗，再采用纯化水室温震荡0.5h；重复3次，制备获得羊膜层；

步骤四、胶原层的制备：将步骤三制得的羊膜层清洗后上皮面（光滑面）朝下置于尺寸与羊膜大小一致的容器底部，加入胶原蛋白溶液，厚度约为10.0μm，-20℃下预冻2h后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥4h。

步骤五、缓释层的制备：制备活性因子bFGF的胶原溶液，其浓度为12000ng/ml，通过超声雾化喷涂方式将活性溶液喷涂在羊膜的上皮面，迅速-20℃预冻2h后冷冻干燥6h。最终制备得到生物缓释羊膜。

步骤六、灭菌：将步骤五制备得到的生物羊膜经过裁剪包装后，进行钴60辐照灭菌。

本实施例制备的生物羊膜厚度约为20.0μm，产品操作方便、植入后不易滑动脱落、免疫原性低，可应用肌腱、神经等组织的防粘连及多种软组织的修复。

Claims (3)

1.一种生物羊膜,其特征在于：具有三层结构，自上而下依次有缓释层、羊膜层和胶原层，缓释层是由胶原蛋白和生物活性因子组成；羊膜层为经过脱细胞处理的羊膜；胶原层是胶原蛋白;三层之间通过冷冻干燥复合而成。

2.根据权利要求1所述生物羊膜,其特征在于：缓释层为0.5～1.0μm;羊膜层为10.0～50.0μm。

3.一种生物羊膜的制备方法，其特征在于,其方法步骤如下：

步骤一、原料预处理：将新鲜羊膜去除表面血污，用磷酸盐缓冲液或生理盐水或纯化水清洗干净；

步骤二、病毒灭活：将步骤一的羊膜，室温25℃，浸泡于75%乙醇溶液中1～3h，或浸泡于0.1%～0.5%过氧乙酸溶液中10～30min，再用纯化水清洗3～5次；

步骤三、脱细胞处理：将步骤二的羊膜，室温25℃，置于高渗溶液中震荡0.5～3h后，用纯化水清洗干净；再采用纯化水震荡0.5～3h。重复1～5次，获得羊膜层；

所述高渗溶液为1M～5M NaCl与0.01M～0.5M NaOH的混合溶液；

步骤四、胶原层的制备：将步骤三制得的羊膜层清洗后的光滑面上皮面朝下置于尺寸与羊膜大小一致的容器底部，加入胶原蛋白溶液，-20℃下预冻2h后.放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥4～8h；

步骤五、缓释层的制备：制备具有抑制炎症、促进伤口愈合的活性因子bFGF、EGF的一种或两种因子混合的胶原溶液，两种活性因子的浓度范围均为2000ng/ml～20000ng/ml，通过超声雾化喷涂方式将活性溶液喷涂在羊膜的上皮面，迅速-20℃预冻2h后冷冻干燥6～12h。

步骤六、灭菌：将步骤五制备得到的生物羊膜经过裁剪包装后，进行钴60辐照灭菌。

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