CN102293690B - 冻融脱细胞激光微孔辐照异种真皮基质制备方法及其产品 - Google Patents

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本发明属于脱细胞异种皮基质及其制备方法领域。冻融脱细胞激光微孔辐照异种真皮基质制备方法，其特征在于，取小猪皮切取皮片，拉皮；激光打孔；采用缓冲液清洗；冻融，加入足够浸没上述皮片量的上述缓冲液超声波震荡，用以去除已被破坏死亡细胞及细胞碎片保持异种真皮中结构和基地膜的完整性；用纯化水清洗，加入每平方厘米小于或等于0.12毫克的磺胺嘧啶锌，在摄氏负20度冷冻；密封后消毒灭菌。由上述方法得到的冻融脱细胞激光微孔辐照异种真皮基质，其特征在于，厚0.3-0.4mm，孔距1.0-2.0mm，孔径500-808um。

Description

冻融脱细胞激光微孔辐照异种真皮基质制备方法及其产品
技术领域
本发明属于脱细胞异种皮基质及其制备方法领域。
背景技术
“微粒皮+大张异体皮”技术是目前国内修复覆盖大面积深度烧伤患者创面常用的有效手段，该技术可有效的利用患者的残留皮肤，结合异体皮移植暂时覆盖了大面积深度烧伤切痴后的创面，解决了皮源匾乏的难题。但由于真皮组织的扩展不能同步于表皮上皮化的形成，缺乏真皮组织，皮肤愈合质量难以达到功能和外观的要求，患者创面愈合后瘫痕挛缩严重，皮肤弹性差，瘫痕增生、痛痒等，影响外观功能，究其原因与真皮成分的缺乏有关。利用脱细胞异种(猪)真皮做真皮替代物，与自体微粒皮加异体皮覆盖深度烧伤切削痴后的创面，较好的解决了上述难题。
用于烧伤创面治疗的有各种生物材料，如异体皮、异种皮、各种生物膜及合成的胶原纤维膜，存在的问题是有排异反应，可能携带潜在的病原体；而异体皮来源又非常困难，各种合成的材料价格昂贵，临床应用受到限制。大面积烧伤病人因自体皮的缺乏，即使创面能修复，因缺乏自体真皮层，会遗留严重瘢痕。国外Lifecell公司及国内杰雅公司研制的脱细胞异体真皮已商品化，其昂贵的价格和来源有限在临床使用受限，因此寻求能植入人体内，组织相容好，免疫性低的用于烧伤、整形美容及作为组织填充物的异种真皮是目前国内外研究的热点。因猪皮最接近人体皮肤，来源广，价格低，是普遍研究的材料。
以往的脱细胞方法主要有酶消化法和化学去污剂法等，这些方法极易造成真皮三维结构的破坏，使真皮的物理性能下降，并且难以彻底去除细胞碎片；利用戊二醛来增加真皮韧性，会导致胶原变性结构的破坏，增加真皮支架的细胞毒性，也会抑制正常细胞的生长。
发明内容
本发明旨在克服现有技术存在的问题，提供一种冻融脱细胞激光微孔辐照异种皮制备方法及其产品。
冻融脱细胞激光微孔辐照异种真皮基质制备方法，其特征在于，取小猪皮切取皮片，拉皮；激光打孔；采用缓冲液清洗；冻融，加入足够浸没上述皮片量的上述缓冲液超声波震荡，用以去除已被破坏死亡细胞及细胞碎片保持异种真皮中结构和基地膜的完整性；用纯化水清洗，加入每平方厘米小于或等于0.12毫克的磺胺嘧啶锌，在摄氏负20度冷冻；密封后消毒灭菌。
由上述方法得到的冻融脱细胞激光微孔辐照异种真皮基质，其特征在于，厚0.3-0.4mm，孔距1.0-2.0mm，孔径500-808um。
我们采用先激光打微孔，再反复冻融+缓冲液清洗+超声振荡，再加磺胺嘧啶锌，最后钴60照射制备的异种脱细胞真皮避免了采用其他方法制备脱细胞真皮的不足，脱细胞彻底，胶原结构完整，物理性能接近新鲜人皮，免疫抗原性低，其锌离子可促使人体细胞生长，并具有抗感染作用，有望应用于临床。
利用本发明冻融脱细胞激光微孔辐照异种真皮做真皮替代物，与自体微粒皮加异体皮覆盖深度烧伤切削痴后的创面，较好的解决了上述难题，经动物实验与临床应用发现该技术可明显改善深度烧伤创面的愈合质量；能达到无菌无排斥拉伸强度亲水性符合人体需要做的永久性真皮支架保存在体内。本发明产品色白、柔韧、弹性好；抗拉强度、应力-应变、蠕变性能接近人体皮肤；亲水性好，含水量能达到60％，符合人体皮肤特征。
具体实施方式
冻融脱细胞激光微孔辐照异种真皮基质制备方法，其特征在于，取小猪皮切取皮片，拉皮；激光打孔；采用缓冲液清洗；冻融，加入足够浸没上述皮片量的上述缓冲液超声波震荡，用以去除已被破坏死亡细胞及细胞碎片保持异种真皮中结构和基地膜的完整性；用纯化水清洗，加入每平方厘米小于或等于0.12毫克的磺胺嘧啶锌，在摄氏负20度冷冻；密封后消毒灭菌。
所述的拉皮是在4mPa，10mm/min拉伸速度下拉伸皮片。
所述的激光打孔是采用CO2激光器，以输出功率30W，波长10600mm输出方式，连续激光打孔。
所述的冻融是将打孔后的猪皮放入负75度的冰箱内6小时，取出，摄氏37°下放置50分钟，反复3-8次。
所述的缓冲液是由NaCL8.00g+KCL 0.20g+KH2PO4 0.20g+Na2HPO43.49g+1000mL蒸馏水配置而成。
所述的超声震荡时间是30-50小时。
为了更好地保持异种皮中胶原的结构和基地膜的完整性，所述的加入上述缓冲液超声波震荡过程是换上述缓冲液1-6次超声振荡；每次20分钟。
所述的用纯化水清洗次数为3～5次。
所述的消毒灭菌是于20-30万居里钴60辐照量200-300万拉德辐照，采用旋转辐照法，辐照时间15-20小时。
由上述方法得到的冻融脱细胞激光微孔辐照异种真皮基质，其特征在于，厚0.3-0.4mm，孔距1.0-2.0mm，孔径500-808um。
针对上述方法得到的冻融脱细胞激光微孔辐照异种真皮基质，做如下实验：
一、组织学检测：
取本发明脱细胞真皮基质置于10％甲醛溶液和3％戊二醛溶液中固定并送去作光镜和透视电镜检测。光镜标本作石蜡包埋和HE染色、弹力纤维W eigert染色，观察细胞成分和皮肤附件是否完全去除，脱细胞真皮的基底膜是否破坏及其连续性，胶原纤维和弹力纤维的结构和排列等。
弹力纤维W eigert染色显示表皮均完全去除，脱细胞真皮基底膜基本没有被破坏，连续性好，无细胞成分，但可见细胞被消化后遗留下的空泡，胶原纤维和弹力纤维结构排列整齐
在透视电镜下，脱细胞真皮未见表皮成分，脱细胞真皮的乳头层表面有连续的基底膜成分，无细胞成分，胶原纤维结构排列整齐，在更高倍镜下基底膜的微细结构较为清楚，可见致密层以及从致密层向外垂直伸出的锚着纤维，胶原纤维横纹结构清晰可见，并可见弹力纤维也正常存在。
二、动物实验：
1.取健康SD大鼠15只，雌雄不限，体重205一209g，3％戊巴比妥钠按50mg/Kg浓度腹腔麻醉，背部去毛后，100℃水浴12秒造成背部直径约3cm大小的III度烫伤。切除全层皮肤至深筋膜，创面止血后，将其四角皮肤各缝合一针与肌层固定。将本发明冻融脱细胞激光微孔辐照异种真皮基质做创面移植后用凡士林纱布，无菌敷料覆盖，打包固定。实验鼠术后单笼饲养，10天后换药。
2.取健康兔子15只，雌雄不限，体重2000-4000g，，手术方法与SD大鼠实验方法一致。
3.创面愈合情况的大体观察：手术后2，4，6周动态观察植皮成活情况。
4.组织学观察：每个时间点处死5只动物做以下检查：(1)活检组织常规制成石蜡
切片，苏木素一伊红(HE)染色。(2)兔抗人Lamnini抗体免疫组化染色。
结果：
1.创面大体观察
本发明冻融脱细胞激光微孔辐照异种真皮基质均成活良好，未观察到急性排斥反应出现，深层的微孔脱细胞异种(猪)真皮已与肌肉组织之间建立血运且连接紧密，呈红白相间，4周微孔脱细胞异种(猪)真皮与深层组织结合紧密，创面收缩不明显，无毛发生长。术后6周皮片有脱屑，无毛发生长，柔韧性较好，创面较平整。
2组织学检查
术后2周移植物均以炎性细胞浸润为主。术后4周，表皮层有分层结构，真皮层内胶原纤维排列稍混乱，间质炎性细胞浸润，可见丰富的毛细血管结构垂直于创面生长，有较多的成纤维细胞增生，表皮真皮连接区的乳头结构明显。术后6周，表皮及真皮结构基本正常，胶原纤维排列比较规则，小血管周围慢性炎细胞浸润，未见皮肤附件。抗laminin染色显示在基底膜区及真皮血管束周围呈阳性反应，连续性好。
三、临床实验：
1一般资料
在知情同意的前提下，自2009年1月一2010年1月应用本发明冻融脱细胞激光微孔辐照异种真皮基质加自体微粒皮加同种异体皮复合移植，治疗III度烧伤患者6例，8个创面，男性5例，女性1例；年龄26一35岁，烧伤面积30％一40％，其中上肢切痴创面4处，下肢4处，移植时间为伤后3一10天，移植面积约为3×3cm2。
2.移植方法
取自体刃厚皮，剪碎其成为皮微粒，同种异体皮打洞后将皮微粒均匀涂抹于异体皮的真皮面，同时削除或切除坏死组织至脂肪层或深筋膜；将本发明冻融脱细胞激光微孔辐照异种真皮基质皮面接触创面，用可吸收线四周缝合固定并有适当张力，将涂抹有微粒皮的异体皮覆盖于本发明冻融脱细胞激光微孔辐照异种真皮基质之上，适当加压包扎。
3.结果
术后2周可见大部分异体皮成活良好，色红湿润，局灶性表皮脱落，真皮红润。微孔脱细胞异种(猪)真皮覆盖区与其他异体皮区无明显差别。4一6周左右，微孔脱细胞异种(猪)真皮覆盖区表面的异体皮逐渐排斥脱落，自体微粒皮已基本覆盖创面，外观平整、饱满，色淡红。术后10周，8处移植区微孔脱细胞异种(猪)真皮覆盖区较周围未使用微孔脱细胞异种(猪)真皮区弹性较好，未出现水疱。

Claims (9)

1.冻融脱细胞激光微孔辐照异种真皮基质制备方法，其特征在于，取小猪皮切取皮片，拉皮；激光打孔，孔距1.0—2.0mm，孔径500—808um；采用缓冲液清洗；冻融，所述的冻融是将打孔后的猪皮放入负75度的冰箱内6小时，取出，摄氏37°下放置50分钟，反复3-8次；加入足够浸没上述皮片量的上述缓冲液超声波震荡，用以去除已被破坏死亡细胞及细胞碎片保持异种真皮中结构和基底膜的完整性；用纯化水清洗，加入每平方厘米小于或等于0.12毫克的磺胺嘧啶锌，在摄氏负20度冷冻；密封后消毒灭菌。
2.根据权利要求1所述的冻融脱细胞激光微孔辐照异种真皮基质制备方法，所述的拉皮是在4mPa，10mm/min拉伸速度下拉伸皮片。
3.根据权利要求1所述的冻融脱细胞激光微孔辐照异种真皮基质制备方法，其特征在于，所述的激光打孔是采用CO2激光器，以输出功率30W，波长10600mm输出方式，连续激光打孔。
4.根据权利要求1所述的冻融脱细胞激光微孔辐照异种真皮基质制备方法，所述的缓冲液是由NaCL8.00g+KCL 0.20g+KH2PO4  0.20g +Na2HPO4  3.49g+1000mL蒸馏水配置而成。
5.根据权利要求1所述的冻融脱细胞激光微孔辐照异种真皮基质制备方法，所述的超声震荡时间是30—50小时。
6.根据权利要求1所述的冻融脱细胞激光微孔辐照异种真皮基质制备方法，所述的加入上述缓冲液超声波震荡过程是换上述缓冲液1—6次超声振荡；每次20分钟。
7.根据权利要求1所述的冻融脱细胞激光微孔辐照异种真皮基质制备方法，所述的用纯化水清洗次数为3~5次。
8.根据权利要求1所述的冻融脱细胞激光微孔辐照异种真皮基质制备方法，所述的消毒灭菌是于20—30万居里钴60辐照量200—300万拉德辐照，采用旋转辐照法，辐照时间15—20小时。
9.根据权利要求1所述的方法制取的冻融脱细胞激光微孔辐照异种真皮基质，其特征在于，厚0.3—0.4mm，孔距1.0—2.0mm，孔径500—808um。
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