CN110559485A - 一种生物组织基质材料及其制备方法与应用 - Google Patents

一种生物组织基质材料及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医用生物材料技术领域，具体涉及一种生物组织基质材料及其制备方法与应用。本发明通过对动物源性组织材料依次进行动物组织清洗，脱细胞处理；及使用清洗液进行脱细胞处理后清洗；该清洗液pH为7.5‑12，成分包括清洗剂，碱性盐、中性无机盐中的一种或几种；碱性pH调节剂。本发明方法在去除动物组织抗原性物质的同时，还能够保留材料三维立体结构，利于细胞聚集、增殖和分化的再细胞化过程。体内的再细胞化是生物补片起到引导组织再生能力的重要基础。采用该方法制备的生物组织基质材料生物相容性良好，免疫原性低且利于再细胞化，可用于进一步制备引导组织再生的生物补片。

Description

一种生物组织基质材料及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及医用生物材料技术领域，具体涉及一种生物组织基质材料、制备方法及其应用。
背景技术
动物源性生物材料目前在医药领域有广泛的应用。相比不可吸收材料或者传统的高分子材料，动物源性生物材料具有诱导组织再生的能力，因此是理想的组织修复材料。例如脱细胞小肠粘膜下层材料在腹壁修复、盆底修复、泌尿生殖道修复、神经修复等领域已有临床应用。
动物源性生物材料的风险一方面在于其携带的动物细胞、脂肪等免疫原性物质，在植入人体后会引起免疫反应，另一方面在于其处理过程中使用的试剂容易破坏细胞外基质的三维结构，使其在体内失去了引导组织再生的功能。因此动物源性生物材料处理工艺的难点，在于去除动物组织携带的免疫原性物质的同时，如何采用合理的处理方法将对细胞外基质的破坏尽可能的降低。
常用于动物组织脱细胞的试剂为氢氧化钠，例如专利CN101366975使用0.1-1M的NaOH进行脱细胞，再如专利CN103251987使用高渗盐水与碱溶液联合脱细胞处理。但是由于氢氧化钠为强碱性试剂，对细胞外基质的胶原结构影响较大，同时可能造成细胞外基质中生长因子的失活。
现有的技术多使用超声清洗的方法对动物组织基质材料的细胞残片进行去除。虽然多频超声能够有效的清除细胞残片，但是其并非特异性的清除，在清洗细胞残片的同时，对生物材料携带的生物活性因子也有一定的去除作用。另外，超声处理属于物理过程，对细胞外基质的胶原结构也有一定的破坏。
对细胞外基质结构破坏以及生长因子去除，虽然不影响基质材料的生物相容性，但是会影响到细胞在基质材料上聚集、增殖和分化的再细胞化过程，从而影响到基质材料引导组织再生的能力。而现有技术均未对基质材料的再细胞化进行评价。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种生物组织基质材料的制备方法，在去除动物组织抗原性物质的同时，还能够保留材料三维立体结构，细胞增值率大于160％，利于细胞聚集、增殖和分化的再细胞化过程。体内的再细胞化是生物补片起到引导组织再生能力的重要基础。采用该方法制备的生物组织基质材料生物相容性良好，免疫原性低，细胞外基质的胶原结构完整，利于再细胞化过程，可用于进一步制备引导组织再生的生物补片。
具体而言，本发明提供一种生物组织基质材料的制备方法，包括对动物源性组织材料依次进行：
1)动物组织清洗；
2)脱细胞处理；及
3)脱细胞处理后清洗；
其中，所述脱细胞处理后清洗的步骤包括使用清洗液进行清洗，所述清洗液的主要成分包括：
a)清洗剂；
b)碱性盐、中性无机盐中的一种或几种；及
c)碱性pH调节剂，其用量足以将所述清洗液的pH调至7.5-12。
本发明中，所述清洗剂为表面活性剂，优选离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂中的一种或几种。
本发明中，步骤1)动物组织清洗可采用的方法例如包括异种组织的去病毒处理，目标组织的获取和清洗；其中去病毒处理为用过氧乙酸-乙醇溶液(体积比在1:2～1:10范围内)浸泡1-5小时，或在-80℃环境中冷冻1-10小时。
本发明中，步骤2)脱细胞处理可采用的方法例如包括使用胰蛋白酶(0.05％-2.5％)或胰岛素酶(0.25％-2.5％)浸泡或者震荡处理8-24小时，优选14-18小时。
在本发明的一些实施例中，所述清洗剂选自SDS(十二烷基硫酸钠)、SDC(脱氧胆酸钠)、TritonX-100(100聚乙二醇辛基苯基醚)中的一种或几种。
本发明中，优选所述清洗液中清洗剂的质量百分比浓度为0.1％-2％，更优选为0.5％-1％。
本发明中，所述碱性pH调节剂优选为氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化钙，其用量可根据所述清洗液所期望的pH进行调整。
本发明中，所述清洗液的pH优选为7.5-12，更优选为8-10。
本发明中，所述碱性盐包含但不限于碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、磷酸钠、硫酸钠、乙酸钠、硫化钠等中的一种或几种，优选碳酸钠、碳酸氢钠或碳酸钾。
本发明中，优选所述清洗液中，碱性盐的浓度为0.01M-2M，更优选0.3-1M。
本发明中，所述中性无机盐优选为氯化钠、氯化钾、硝酸钠、硫酸钾等中的一种或几种。
本发明中，优选所述清洗液中，所述中性无机盐的浓度为0.01M-2M，更优选0.3-1M。
在实现本发明目的的情况下，上述清洗液中各组分及其用量可根据需要进行适当调整。
如无特殊说明，本发明所述清洗液的溶剂均为水。
在本发明的一些实施例中，所述清洗液中含有：质量百分比浓度0.1-1.5％的TritonX-100，浓度0.1-1M的碳酸钠；还含有氢氧化钠，通过氢氧化钠的添加量调节该清洗液的pH为7.5-10。
在本发明的一个较佳的实施例中，所述清洗液中含有：质量百分比浓度0.2％的TritonX-100，浓度0.5M的碳酸钠；还含氢氧化钠，通过氢氧化钠的添加量调节该清洗液的pH为9。
在本发明的一些实施例中，所述清洗液中含有：质量百分比浓度0.1-2％的SDS，浓度0.01-2M的氯化钠；还含有氢氧化钙，通过氢氧化钙的添加量调节该清洗液的pH为8-10。
在本发明一个较佳实施例中，所述清洗液中含有：质量百分比浓度1％的SDS，浓度0.8M的氯化钠；还含有氢氧化钙，通过氢氧化钙的添加量调节该清洗液的pH为10。
在本发明的一些实施例中，所述清洗液中含有：质量百分比浓度0.1-1％的SDC，浓度0.08-1.5M的硝酸钠；还含有氢氧化钾，通过氢氧化钾的添加量调节该清洗液的pH为8-10。
在本发明一个较佳实施例中，所述清洗液中含有：质量百分比浓度1％的SDC，浓度0.5M的硝酸钠；还含有氢氧化钾，通过氢氧化钾的添加量调节该清洗液的pH为8。
本发明研究发现，使用本发明所述清洗液对脱细胞处理后的生物组织基质材料进行清洗，既能够有效的清除组织中的细胞和DNA残片，又能够保留生物材料细胞外基质的三维结构，从而利于细胞聚集、增殖和分化的再细胞化过程。体内的再细胞化是生物补片起到引导组织再生能力的重要基础。
通常，可使用本发明所述清洗液对脱细胞处理后的生物组织基质材料恒温震荡清洗。例如，可恒温震荡清洗6-8次，每次20-30分钟。该恒温震荡清洗的温度范围通常可为20-37℃。
进一步地，在使用本发明所述清洗液清洗之后，还包括进行脱脂肪处理的步骤；所述脱脂肪处理可采用脱脂溶液在恒温震荡器中进行处理，脱脂溶液包括甲醇-氯仿混合溶液，异丙醇，石油醚等中的一种或几种。所述脱脂处理是使用上述脱脂溶液清洗1-10次，优选2-6次，每次清洗2-8小时，优选3-5小时。
进一步地，在所述脱脂肪处理之后还包括使用纯化水和/或0.9％氯化钠溶液进行再次清洗，更好的是使用纯化水和0.9％氯化钠溶液交替进行清洗。在本发明一些具体实施方式中，清洗1-15次，每次震荡清洗1-10小时，优选清洗3-10次，每次震荡清洗2-8小时。
本发明中，经过上述脱细胞处理后清洗的动物源性组织材料即为生物组织基质材料，可直接作为支架材料，用于细胞接种；或在液氮中研磨成粉，通过3D打印成不同的形态结构，再用于细胞的接种。
在本发明一些具体实施方式中，还包括将经过上述步骤3)脱细胞处理后清洗后的动物源性组织材料进一步干燥以制成组织修复补片材料。具体干燥方法包括冷冻干燥和真空干燥。
所述冷冻干燥条件为在-10℃至-45℃条件下冷冻120分钟至300分钟，然后在真空条件下，-5℃至37℃条件下进行梯度干燥，每个梯度的干燥时间为60-240分钟。优选冷冻干燥条件为-10℃冷冻95分钟，然后在-30℃冷冻180分钟。在0.5Mpa环境中，分别在-10℃和-5℃条件下干燥180分钟和230分钟。最后分别在-5℃、15℃和30℃分别干燥180分钟、120分钟和120分钟。
所述真空干燥条件为在150Pa环境中，38℃干燥1-6小时，优选2-4小时。
将干燥后的生物组织基质材料进行灭菌，灭菌方式优选辐照灭菌或者环氧乙烷灭菌。
进一步地，上述灭菌后制成组织修复补片材料可用于制作疝补片、阴道组织补片、硬脑膜修补片等。
具体地，上述生物组织基质材料的制备方法，包括：
1)动物组织清洗；包括异种组织的去病毒处理，目标组织的获取，用纯化水或者注射用水冲洗；其中去病毒处理为用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡1-2小时，或在-80℃环境中冷冻2-8小时；该过氧乙酸-乙醇溶液中过氧乙酸与乙醇的体积比为1:3～1:6；
2)脱细胞处理；包括使用胰蛋白酶(0.25％-2％)或胰岛素酶(0.5％-2％)浸泡或者震荡处理12-24小时，优选14-18小时；
3)脱细胞处理后清洗；具体包括：
使用清洗液进行清洗，该清洗液与上文相同；
在使用该清洗液清洗之后，进行脱脂肪处理；所使用的脱脂溶液选自甲醇-氯仿混合溶液，异丙醇，石油醚中的一种或几种；
在脱脂肪处理之后使用纯化水和/或0.9％氯化钠溶液进行再次清洗，优选使用纯化水和0.9％氯化钠溶液交替进行清洗。
本发明所述动物源性组织材料(也称异种组织)包括猪小肠粘膜下层、新鲜的猪皮、牛小肠粘膜下层、猪真皮基质、猪或牛心包膜等。
研究发现，脱细胞处理和清洗处理的顺序对动物组织的处理效果十分关键，这些步骤一方面能够保证动物组织中免疫原性物质被彻底去除，使处理后的材料具有良好的生物相容性和安全性；另一方面能够良好的保留动物组织细胞外基质的三维结构，从而利于再细胞化。若处理步骤的顺序发生改变，则不能保证免疫原性物质的去除效果，也无法保证细胞外基质结构。
本发明还包括上述方法制备的生物组织基质材料。
本发明所述生物组织基质材料包括细胞外基质，利于再细胞化过程。本发明实施方式所提供的生物组织基质材料的细胞增值率大于160％。
有益效果
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：
1.使用酶法进行脱细胞，并使用由清洗剂和碱性或中性盐组成的碱性清洗液对细胞碎片和DNA等免疫原性物质进行去除。
2.清洗液提供的渗透压和离子特性能够特异性的解离细胞对于基质材料的黏附，以及解离DNA的碱基对结构，提高脱细胞效果，且对基质材料的胶原结构破坏性小。
3.现有技术多重视基质材料脱细胞效果和生物相容性，而忽略了基质材料的再细胞化效果。通过本发明制备的基质材料，在具有低免疫原性，良好的生物相容性的同时，细胞增值率大于160％，比现有工艺相比有所的改善。
4.干燥前的基质材料可以用于组织工程支架材料，直接用于细胞接种。干燥后的基质材料可在灭菌后用于疝补片、阴道组织补片或硬脑膜修补片。
附图说明
图1-图2分别为实施例1步骤3脱细胞处理之前所得小肠粘膜下层照片及步骤9处理所得小肠粘膜下层照片。
图3为实施例1经步骤8所制得的生物组织基质材料的扫描电镜图，显示其细胞外基质的超微结构。
图4表示实验2中实施例1-3样品和对照品的细胞增殖率。
图5表示实验3中实施例1样品的在修复犬腹壁缺损区的HE染色结果(×100倍)，可见大量小肠粘膜下层材料与正常组织无明显边界，成纤维细胞浸润小肠粘膜下层材料，说明材料具有优异的再细胞化和引导组织再生效果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1
本实施例所用生物组织基质材料的原料为新鲜的猪小肠。
1.取新鲜的猪小肠，清除小肠周围脂肪组织，进行前处理清洗；
2.使用过氧乙酸-乙醇溶液(体积比1:5)对清洗后的猪小肠进行浸泡。浸泡时间2小时。然后使用纯化水冲洗，至冲洗后纯化水的pH值在5.5-6.5范围内。
3.使用刮层的方法除去猪小肠的粘膜层、肌层的浆膜层，保留的粘膜下层。
4.将小肠粘膜下层使用pH7.2-7.4的磷酸缓冲液清洗3-6次，然后放置于在2-8℃的环境中，加入0.5％胰岛素酶进行脱细胞处理。静置14小时。
5.使用清洗液对小肠粘膜下层进行震荡清洗，每次清洗20分钟，共清洗6次。然后使用0.9％NaCl溶液清洗24小时。
该清洗液中含有：质量百分比浓度0.2％的TritonX-100，浓度0.5M的碳酸钠；还含有氢氧化钠，通过氢氧化钠的添加量调节该清洗液的pH为9。
6.清洗后的小肠粘膜下层使用三氯甲烷溶液在恒温震荡器中进行脱脂肪处理，每次处理3小时，共处理2次。
7.使用纯化水和0.9％NaCl交替对于对步骤6处理后的小肠粘膜下层材料进行清洗，共清洗5次，每次10分钟。
此时所得材料即为生物组织基质材料，可直接作为支架材料，用于细胞接种；或在液氮中研磨成粉，通过3D打印成不同的形态结构，再用于细胞的接种。
8.将步骤7处理后的小肠粘膜下层材料固定在模具上，进行冷冻干燥。冷冻干燥条件为-10℃冷冻60分钟，然后在-30℃冷冻180分钟。在0.5Mpa环境中，分别在-15℃和-10℃条件下干燥120分钟和240分钟。最后分别在-5℃、10℃和15℃分别干燥180分钟、120分钟和60分钟。
9.将干燥的小肠粘膜下层材料进行包装，辐照灭菌。可以用于制作疝补片、阴道组织补片、硬脑膜修补片等。
其中，步骤3脱细胞处理之前所得小肠粘膜下层照片及步骤9处理所得小肠粘膜下层照片分别见图1和图2。可见处理前(图1)含大量细胞，而处理后(图2)无细胞残留，表明细胞处理彻底，无残留。
经步骤8所制得的生物组织基质材料的扫描电镜图见图3，显示其细胞外基质的超微结构。
实施例2
本实施例所用生物组织基质材料的原料为新鲜的猪皮。
1.取新鲜的猪皮，清除猪皮皮下脂肪，进行前处理清洗；
2.将猪皮放入-80℃中冷冻2小时，然后取出放在37℃水浴中震荡1小时。使用纯化水冲洗干净。
3.使用刮层的方法除去猪皮的表皮层和皮下脂肪，保留的真皮层。
4.将经以上处理的猪皮使用pH7.2-7.4的磷酸缓冲液清洗3-6次，然后放置于2-8℃的环境中，加入0.25％胰蛋白酶进行脱细胞处理。静置12小时。
5.使用清洗液对猪皮进行震荡清洗，每次清洗20分钟，共清洗8次。然后使用0.9％NaCl溶液清洗24小时。
该清洗液中含有：质量百分比浓度1％的十二烷基硫酸钠，浓度0.8M的NaCl；还含有氢氧化钙，通过氢氧化钠的添加量调节该清洗液的pH为10。
6.清洗后的猪皮使用甲醇-氯仿混合溶液(1:1)在恒温震荡器中进行脱脂肪处理，每次处理2小时，共处理3次。
7.使用纯化水和0.9％NaCl交替对于对步骤6处理后的猪皮材料进行清洗，共清洗8次，每次20分钟。
此时所得材料即为生物组织基质材料，可直接作为支架材料，用于细胞接种；或在液氮中研磨成粉，通过3D打印成不同的形态结构，再用于细胞的接种。
8.将处理后的猪皮材料固定在模具上，在200Pa真空下，35℃干燥2小时。
9.将干燥的小肠粘膜下层材料进行包装，环氧乙烷灭菌。可以用于制作疝补片、阴道组织补片、硬脑膜修补片等。
实施例3
本实施例所用生物组织基质材料的原料为新鲜的猪小肠。
1.取新鲜的猪小肠，清除小肠周围脂肪组织，进行前处理清洗；
2.使用过氧乙酸-乙醇溶液(体积比1:5)对清洗后的猪小肠进行浸泡。浸泡时间1小时。然后使用纯化水冲洗，至冲洗后纯化水的pH值在5.5-6.5范围内。
3.使用刮层的方法除去猪小肠的粘膜层、肌层的浆膜层，保留的粘膜下层即。
4.将小肠粘膜下层使用pH7.2-7.4的磷酸缓冲液清洗3-6次，然后放置于在2-8℃的环境中，加入0.5％胰蛋白酶进行脱细胞处理。静置14小时。
5.使用清洗液对小肠粘膜下层进行震荡清洗，每次清洗20分钟，共清洗6次。然后使用0.9％NaCl溶液清洗24小时。
该清洗液中含有：质量百分比浓度1％的SDC，浓度0.5M的硝酸钠；还含有氢氧化钾，通过氢氧化钾的添加量调节该清洗液的pH为8。
6.清洗后的小肠粘膜下层使用乙醇溶液在恒温震荡器中进行脱脂肪处理，每次处理3小时，共处理2次。
7.使用纯化水和0.9％NaCl交替对于对步骤6处理后的小肠粘膜下层材料进行清洗，共清洗5次，每次20分钟。
此时所得材料即为生物组织基质材料，可直接作为支架材料，用于细胞接种；或在液氮中研磨成粉，通过3D打印成不同的形态结构，再用于细胞的接种。
也可将上述处理后的小肠粘膜下层保存在PBS缓冲液中，辐照灭菌，以备使用。
实验1
对实施例1(步骤9)制备小肠粘膜下层材料进行理化性能和生物学检测。
(1)力学强度
拉伸强度测试：将样品沿长边或宽边剪成测试样条，保证孔在样条中间部位，常温常压，传感器1000牛顿，加载速度为1mm/min，测定其最大负荷。实验例1样品检测结果均大于100N。
顶破强度测试：测试采用材料力学试验机，将钢球端固定在上方试验机，将环形夹持器固定在下端试验机上，间距为50mm，然后将样品固定夹持器上，并保证试样平整、无张力、不褶皱。测试时以300mm/min速度压缩，直至样品发生破裂为止。记录钢球穿破样品时的力。实验例1样品检测结果均大于130N。
缝合强度测试：将样品用手术缝合针将2-0的不可吸收缝线穿过材料，缝线处距SIS材料边缘至少3mm以上，制备成测试样品。将SIS材料一段固定在力学测试机的下夹具上，不可吸收缝线打结后固定在力学测试机的上夹具上，用拉伸模式进行测试，常温常压，传感器1000牛顿，加载速度为1mm/min，测定其最大负荷。实验例1样品检测结果均大于5N。
(2)DNA残留：使用荧光染色法检测实验例1中样品的DNA含量，均小于10ng/mg。
(3)脂肪含量：使用索氏提取法检测实验例1中样品的脂肪含量，均不大于5％。
(4)化学试剂残留：使用气相色谱法检测实验例1中样品的甲醇和氯仿残留量，结果显示，甲醇不大于0.006％，氯仿不大于0.3％。使用吖啶橙分光光度法检测十二烷基硫酸钠残留，结果均小于0.02％。
(5)组织学检查：将实施例1样品进行石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜观察，未观察到细胞碎片。
(6)生长因子检测：将100mg样品剪碎，液氮冷冻后进行碾磨粉碎，匀浆，并使用3000rpm离心后，取上清液。用ELISA法检测其中VEGF和bFGF含量，结果显示，实验例1中样品VEGF含量为3.27±6.09ng/mg，bFGF含量为27.45±6.09ng/mg。
(7)生物学检测：按照GB/T 16886系列标准，对实验例1中材料进行生物学试验，结果显示样品无细胞毒性，无刺激致敏性，无遗传毒性，无急性和亚慢性全身毒性，对于组织和免疫系统不产生不良反应。
实验2
对实施例1-3干燥并灭菌后的生物组织基质材料进行再细胞化检测。
对照样品1的制备方法与实施例2(包含步骤1-9)的区别仅在于，步骤4采用如下方法进行脱细胞处理：将经步骤1-3处理的猪皮使用10mmol/L NaOH溶液，在45KHZ超声条件下震荡处理20分钟。
对照样品2的制备方法与实施例2(包含步骤1-9)的区别仅在于，将步骤5-7替换为采用如下方法进行脱细胞处理后清洗：将经步骤1-4处理的猪皮在40kHz的超声频率下，使用PBS进行清洗，每次20分钟，清洗3次。然后使用注射用水进一步清洗，每次20分钟，清洗5次。清洗后的注射用水与常规注射用水的电导率之差小于1μS/cm.
分别将以上5种样品裁剪成5mm×5mm大小，放入24孔板中，使用细胞培养基在37℃环境中浸泡30分钟后，吸去培养基。向24孔板中加入104个数量级细胞的培养基，然后放入5％CO2细胞培养箱中，37℃培养6天，每隔2天更换一次细胞培养液。
在培养6天后取出24孔板，各孔加入20ul浓度为5mg/ml的MTT，放入5％CO2细胞培养箱中，37℃培养4h后，用酶标仪测定570nm波长处测定其OD值。每种样品做6个平行。
实施例1-3与对照样品1、2的细胞增值率如图4所示。从图4可以看出，实施例1-3制备的生物组织基质材料，更利于细胞在其表面的生长，再细胞化效果无显著差异。与对照样品1和2相比，实施例1-3的再细胞化效果显著优于对照样品1和2。
实验3
构建犬腹壁缺损动物模型。动物麻醉后，切开皮肤和皮下组织，暴露肌层。使用电刀完整切除带腹膜的腹壁肌肉。将实施例1步骤8制备的生物组织基质材料辐照灭菌后缝合于缺损部位。上述操作完成后，连续缝合皮下组织和皮肤，并给予青霉素预防伤口感染。
术后4周，切除修补区组织，固定后石蜡包埋切片，进行HE染色，观察修复区域的细胞浸润情况。如图5所示，小肠粘膜下层材料与正常组织无明显边界，大量成纤维细胞浸润小肠粘膜下层材料。说明小肠粘膜下层材料在体内的再细胞化效果优异，从而起到促进组织修复和引导组织再生的作用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种生物组织基质材料的制备方法，其特征在于，包括对动物源性组织材料依次进行：
1)动物组织清洗；
2)脱细胞处理；及
3)脱细胞处理后清洗；
其中，所述脱细胞处理后清洗的步骤包括使用清洗液进行清洗，所述清洗液的主要成分包括：
a)清洗剂；
b)碱性盐、中性无机盐中的一种或几种；及
c)碱性pH调节剂，其用量足以将所述清洗液的pH调至7.5-12；
所述清洗剂优选为表面活性剂，更优选为离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)动物组织清洗包括异种组织的去病毒处理，目标组织的获取和清洗，其中去病毒处理优选为用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡1-5小时，或在-80℃环境中冷冻1-10小时；该过氧乙酸-乙醇溶液中过氧乙酸与乙醇的体积比为1:2～1:10；和/或，
步骤2)脱细胞处理包括使用胰蛋白酶(0.05％-2.5％)或胰岛素酶(0.25％-2.5％)浸泡或者震荡处理8-24小时，优选14-18小时。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述清洗剂选自SDS、SDC、TritonX-100中的一种或几种。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述碱性盐包含但不限于碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、磷酸钠、硫酸钠、乙酸钠、硫化钠中的一种或几种；优选所述清洗液中该碱性盐的浓度为0.01M-2M，更优选0.3-1M；或，
所述中性无机盐为氯化钠、氯化钾、硝酸钠、硫酸钾中的一种或几种；优选所述清洗液中该中性无机盐的浓度为0.01M-2M，更优选0.3-1M。
5.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述清洗液选自以下任一种：
i)所述清洗液中含有：质量百分比浓度0.1-1.5％的TritonX-100，浓度0.1-1M的碳酸钠；还含有氢氧化钠，通过氢氧化钠的添加量调节该清洗液的pH为7.5-10；优选地，所述清洗液中含有：质量百分比浓度0.2％的TritonX-100，浓度0.5M的碳酸钠；还含有氢氧化钠，通过氢氧化钠的添加量调节该清洗液的pH为9；或，
ii)所述清洗液中含有：质量百分比浓度0.1-2％的SDS，浓度0.01-2M的氯化钠；还含有氢氧化钙，通过氢氧化钙的添加量调节该清洗液的pH为8-10；优选地，所述清洗液中含有：质量百分比浓度1％的SDS，浓度0.8M的氯化钠；还含有氢氧化钙，通过氢氧化钙的添加量调节该清洗液的pH为10；或，
iii)所述清洗液中含有：质量百分比浓度0.1-1％的SDC，浓度0.08-1.5M的硝酸钠；还含有氢氧化钾，通过氢氧化钾的添加量调节该清洗液的pH为8-10；优选地，所述清洗液中含有：质量百分比浓度1％的SDC，浓度0.5M的硝酸钠；还含有氢氧化钾，通过氢氧化钾的添加量调节该清洗液的pH为8。
6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，在使用所述清洗液清洗之后，还包括进行脱脂肪处理的步骤；所使用的脱脂溶液优选自甲醇-氯仿混合溶液，异丙醇，石油醚中的一种或几种；
或者，在所述脱脂肪处理之后还包括使用纯化水和/或0.9％氯化钠溶液进行再次清洗，优选使用纯化水和0.9％氯化钠溶液交替进行清洗。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于，还包括将步骤3)脱细胞处理后清洗后的动物源性组织材料进一步干燥以制成组织修复补片材料；所述干燥的方法优选为冷冻干燥或真空干燥；
所述冷冻干燥的条件优选为在-10℃至-45℃条件下冷冻120分钟至300分钟，然后在真空条件下，-5℃至37℃条件下进行梯度干燥，每个梯度的干燥时间为60-240分钟；更优选为-10℃冷冻95分钟，然后在-30℃冷冻180分钟；在0.5Mpa环境中，分别在-10℃和-5℃条件下干燥180分钟和230分钟；最后分别在-5℃、15℃和30℃分别干燥180分钟、120分钟和120分钟；
所述真空干燥的条件优选为在150Pa环境中，38℃干燥1-6小时，更优选2-4小时。
8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述动物源性组织材料包括猪小肠粘膜下层、新鲜的猪皮、牛小肠粘膜下层、猪真皮基质、猪、牛心包膜。
9.权利要求1-8任一项所述方法制备的生物组织基质材料；
优选地，所述生物组织基质材料包括细胞外基质，利于再细胞化过程；所述生物组织基质材料的细胞增值率大于160％。
10.权利要求9所述生物组织基质材料在制备用于细胞接种的支架材料、疝补片、阴道组织补片或硬脑膜修补片中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111202081A (zh) * 2020-01-15 2020-05-29 四川大学 一种干燥胶原基生物材料的灭菌方法
WO2021056964A1 (zh) * 2019-09-25 2021-04-01 北京大清生物技术股份有限公司 一种生物组织基质材料及其制备方法与应用

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101496912A (zh) * 2008-01-30 2009-08-05 北京大清生物技术有限公司 一种生物衍生肌腱修复材料及其制备方法
CN202283366U (zh) * 2010-11-19 2012-06-27 北京迈迪顶峰医疗科技有限公司 一种sis软组织修复补片
CN103251987A (zh) * 2013-04-07 2013-08-21 陕西佰傲再生医学有限公司 一种脱细胞生物补片及其制备方法和装置
CN104998299A (zh) * 2015-07-29 2015-10-28 陕西博与再生医学有限公司 一种脱细胞抗钙化心脏补片及其制备方法
CN106362211A (zh) * 2010-07-02 2017-02-01 北卡罗来纳-查佩尔山大学 生物基质支架
WO2017017474A1 (en) * 2015-07-30 2017-02-02 Ucl Business Plc Methods and devices for the production of decellularised tissue scaffolds
CN106474547A (zh) * 2015-08-28 2017-03-08 北京华信佳音医疗科技发展有限责任公司 一种适合细胞生长的生物支架材料及其制备方法
CN107007886A (zh) * 2017-03-03 2017-08-04 北京博辉瑞进生物科技有限公司 一种生物组织基质材料、制备方法及其用途
CN107050520A (zh) * 2017-03-03 2017-08-18 北京博辉瑞进生物科技有限公司 复合生物补片及其制备方法
CN109331228A (zh) * 2018-11-26 2019-02-15 陈德夫 一种抗感染的小肠粘膜下层生物材料的制备方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6734018B2 (en) * 1999-06-07 2004-05-11 Lifenet Process for decellularizing soft-tissue engineered medical implants, and decellularized soft-tissue medical implants produced
CN101433735B (zh) * 2007-11-13 2013-06-12 北京大清生物技术有限公司 一种sis组织修复材料的制备方法
CN103432627B (zh) * 2013-08-26 2015-03-25 北京瑞健高科生物科技有限公司 一种制备动物脱细胞组织基质材料的方法及其制备的组织基质材料
WO2017103930A1 (en) * 2015-12-16 2017-06-22 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Particles comprising decellularized omentum
CN106880872B (zh) * 2016-12-23 2019-10-29 北京大清生物技术股份有限公司 天然细胞外基质生物膜及其制备方法与应用
CN110559485B (zh) * 2019-09-25 2021-02-02 北京大清生物技术股份有限公司 一种生物组织基质材料及其制备方法与应用

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101496912A (zh) * 2008-01-30 2009-08-05 北京大清生物技术有限公司 一种生物衍生肌腱修复材料及其制备方法
CN106362211A (zh) * 2010-07-02 2017-02-01 北卡罗来纳-查佩尔山大学 生物基质支架
CN202283366U (zh) * 2010-11-19 2012-06-27 北京迈迪顶峰医疗科技有限公司 一种sis软组织修复补片
CN103251987A (zh) * 2013-04-07 2013-08-21 陕西佰傲再生医学有限公司 一种脱细胞生物补片及其制备方法和装置
CN104998299A (zh) * 2015-07-29 2015-10-28 陕西博与再生医学有限公司 一种脱细胞抗钙化心脏补片及其制备方法
WO2017017474A1 (en) * 2015-07-30 2017-02-02 Ucl Business Plc Methods and devices for the production of decellularised tissue scaffolds
CN108026509A (zh) * 2015-07-30 2018-05-11 Ucl商业有限公司 用于产生去细胞化组织支架的方法和装置
CN106474547A (zh) * 2015-08-28 2017-03-08 北京华信佳音医疗科技发展有限责任公司 一种适合细胞生长的生物支架材料及其制备方法
CN107007886A (zh) * 2017-03-03 2017-08-04 北京博辉瑞进生物科技有限公司 一种生物组织基质材料、制备方法及其用途
CN107050520A (zh) * 2017-03-03 2017-08-18 北京博辉瑞进生物科技有限公司 复合生物补片及其制备方法
CN109331228A (zh) * 2018-11-26 2019-02-15 陈德夫 一种抗感染的小肠粘膜下层生物材料的制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
孙玉生等: "《现代烧伤整形外科学》", 30 April 2014, 天津：天津科学技术出版社 *
朱庆棠等: "《周围神经缺损修复材料的生物制造与临床评估》", 30 September 2018, 广州：中山大学出版社 *
陈薇等: "脱细胞处理对小肠黏膜下层细胞残留及生长因子含量影响的实验研究", 《干细胞与组织工程》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021056964A1 (zh) * 2019-09-25 2021-04-01 北京大清生物技术股份有限公司 一种生物组织基质材料及其制备方法与应用
CN111202081A (zh) * 2020-01-15 2020-05-29 四川大学 一种干燥胶原基生物材料的灭菌方法
CN111202081B (zh) * 2020-01-15 2021-09-21 四川大学 一种干燥胶原基生物材料的灭菌方法

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