KR102502522B1 - 지방조직에서 세포외기질 및 콜라겐을 추출하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지방조직에서 세포외기질 및 콜라겐을 추출하는 방법에 관한 것으로, a) 지방조직에서 세포외기질을 분리하는 과정과, b) 지방조직에서 분리된 세포외기질에서 콜라겐을 추출하는 과정을 포함하되, 상기 a) 과정은, a-1) 혈액이 제거된 지방조직을 분쇄하는 단계와, a-2) 분쇄된 상기 지방조직을 알코올 및 3차 증류수에 혼합 교반한 후, 밀도차를 이용하여 세포외기질을 분리하는 단계를 포함할 수 있다.

Description

지방조직에서 세포외기질 및 콜라겐을 추출하는 방법{Method for extracting extracellular matrix and collagen from adipose tissue}

본 발명은 지방에서 콜라겐을 추출하는 방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 고순도의 콜라겐을 안정적이고, 용이한 방법을 통해 세포외기질 분리 및 콜라겐을 추출할 수 있는 방법에 관한 것이다.

콜라겐(collagen)은 몸속에서 결합조직을 이루는 주요한 단백질로, 신체구성 단백질 중 25 ~ 35 %의 매우 많은 부분을 차지한다. 인체 부분별 콜라겐 구성비를 보면, 이의 상아질 18%, 피부표피 아래 진피의 70%, 관절 연골의 50%, 뼈의 유기물 중 80%, 뼈와 근육을 이어주는 힘줄의 80% 그리고, 눈의 각막과 결막에서 주성분을 이루고 있다.

콜라겐은 나이가 들수록 체내에서 합성하는 능력을 잃게 되는데, 18세 정도가 되면 콜라겐 생성 속도는 급속히 떨어지기 시작하여 40세에는 18세에 비해 절반 이하가 되는 것으로 알려져 있다. 또한 나이가 들게 되면 신진대사가 둔해져, 오래된 콜라겐이 분해되지 않고 계속 축적되면 콜라겐을 합성하는 재료도 부족해짐으로써 노화가 촉진되는 것으로 알려져 있다.

이러한 이유로 인해, 식품이나 화장품, 의약 관련 분야 등에서는 콜라겐 개발과 이를 이용한 화장품, 식용 및 생체 소재 개발 등에 대해 지속적으로 연구되고 있다.

콜라겐은 주로 닭발, 돼지나 소, 오징어의 내피 부분등에서 추출하고 있지만 원료에 있어서 동물유래이어서 인체에 대한 의료용으로 사용하기 부적합한 면이 있었다.

인체 유래 콜라겐을 수득하는 방법으로, 태반과 탯줄에 함유되어 있는 콜라겐을 펩신 처리 및 염 침전에 의한 분획법 및 카르복시 메틸레이션을 거쳐 다시 펩신을 처리하는 4 단계 과정을 통하여 콜라겐을 분리한 후, 크로마토그래피로 정제하는 방법이 보고되어 있다(GLANVILLE, RW et al., Eur J Biochem, 95:383, 1979).

하지만 인체 유래 콜라겐을 추출하기 위한 태반 및 탯줄의 공급량이 부족하기 때문에 인체 유래 콜라겐에 대한 수요를 충족시키기 어렵다는 문제점이 있다.

이러한 문제를 해결하기 위해 인체 지방으로부터 세포외기질을 분리하고 콜라겐을 추출하는 공정이 개발되었지만, 종래의 기술 (초음파, 감마선, 원심분리, 초임계 등)을 사용한 공정은 대용량의 지방(10 kg 이상)에서 세포외기질 분리할 때 소요되는 시간이 길고, 콜라겐 추출 과중 중에 여과 과정을 사용하지 않기 때문에 순도가 저하되는 문제점이 있었다.

상기와 같은 문제점을 감안한 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 상대적으로 간단한 공정을 사용하면서 세포외기질을 빠르게 분리함과 아울러 순도 높은 콜라겐을 추출할 수 있는 방법을 제공함에 있다.

상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위한 본 발명 지방조직에서 세포외기질 및 콜라겐을 추출하는 방법은, a) 지방조직에서 세포외기질을 분리하는 과정과, b) 지방조직에서 분리된 세포외기질에서 콜라겐을 추출하는 과정을 포함하되, 상기 a) 과정은, a-1) 혈액이 제거된 지방조직을 분쇄하는 단계와, a-2) 분쇄된 상기 지방조직을 알코올 및 3차 증류수에 혼합 교반한 후, 밀도차를 이용하여 세포외기질을 분리하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 상기 알코올은, 에틸 알코올, 이소프로필 알코올 또는 메틸 알코올일 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 상기 a-2) 단계는, 원심분리를 통해 세포외기질을 분리하거나, 교반 후 상분리를 기다리는 것일 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 상기 세포외기질은, 상기 세포외기질은 일부가 침전되고, 다른 일부는 침전되지 않으며, 침전되지 않은 세포외기질은 여과를 통해 분리하고, 침전된 세포외기질을 획득할 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 상기 b) 과정은, 염처리와 산처리를 통해 콜라겐을 추출하되, 다중여과를 통해 고순도의 콜라겐 추출할 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 상기 b) 과정은, b-1) 0.1M ~ O.5M의 NaOH에 24시간 침지시켜 바이러스 및 불순물을 제거한 후, pH7의 증류수로 세척하는 단계와, b-2) 상기 b-1) 단계의 결과물을 50~80% 에탄올 용액으로 전기전도성이 20 ~ 100μS/cm 가 될 때까지 세척한 후 24시간 침지시키는 단계와, b-3) 상기 b-2) 단계의 결과물을 0.5M ~ 1.OM의 펩신(pepsin) 함유 아세트산(acetic acid)에 48시간 동안 침지시키는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 상기 b) 과정은, b-4) 상기 b-3) 단계 후, 다중여과를 통해 콜라겐을 추출하는 단계와, b-5) 상기 b-4) 단계의 결과물을 0.5 ~ 1.0M 아세트산에 용해시킨 후 50,000 ~ 100,000 MWCO(Molecular Weight Cut Off) 여과를 수행하여 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 알코올 용액과 표준체를 이용하여 지방조직으로부터 세포외기질을 분리하여, 세포외기질의 분리 속도를 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

아울러 본 발명은 분리된 세포외기질에서 콜라겐을 추출할 때, 다중 여과를 통해 이물질을 제거하여 콜라겐의 순도를 높일 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 지방조직에서 세포외기질 및 콜라겐을 추출하는 방법의 순서도이다.
도 2는 알코올 혼합 및 세포외기질을 분리하는 과정의 상세 순서도이다.
도 3은 분쇄된 지방조직의 사진이다.
도 4는 지방조직과 알코올 용액을 혼합한 상태의 사진이다.
도 5는 지방층과 혈액층이 분리된 상태의 사진이다.
도 6은 여과된 세포외기질의 사진이다.
도 7은 침전된 세포외기질의 사진이다.
도 8은 S20단계의 상세 순서도이다.
도 9와 도 10은 각각 S30단계의 일실시 순서도이다.
도 11은 종래 돈피유래 콜라겐과 본 발명으로 추출된 콜라겐의 전기영동 결과이다.
도 12는 여과하지 않은 콜라겐과 다중여과한 콜라겐의 순도 비교도이다.

본 발명의 구성 및 효과를 충분히 이해하기 위하여, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예들을 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라, 여러가지 형태로 구현될 수 있고 다양한 변경을 가할 수 있다. 단지, 본 실시예에 대한 설명은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위하여 제공되는 것이다. 첨부된 도면에서 구성요소는 설명의 편의를 위하여 그 크기를 실제보다 확대하여 도시한 것이며, 각 구성요소의 비율은 과장되거나 축소될 수 있다.

'제1', '제2' 등의 용어는 다양한 구성요소를 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소는 위 용어에 의해 한정되어서는 안 된다. 위 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 권리범위를 벗어나지 않으면서 '제1구성요소'는 '제2구성요소'로 명명될 수 있고, 유사하게 '제2구성요소'도 '제1구성요소'로 명명될 수 있다. 또한, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 표현하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 발명의 실시예에서 사용되는 용어는 다르게 정의되지 않는 한, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 통상적으로 알려진 의미로 해석될 수 있다.

이하에서는, 도면을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 지방조직에서 세포외기질 및 콜라겐을 추출하는 방법에 대하여 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 순서도이다.

도 1을 참조하면, 본 발명은 지방조직을 처리하여 지방과 세포외기질을 분리하는 단계(S10)와, 분리된 세포외기질에서 콜라겐을 추출하는 단계(S20)와, 추출된 콜라겐을 제품화하는 단계(S30)로 이루어진다.

본 발명에서 사용하는 지방조직은 동물 유래 또는 인체 유래 지방조직일 수 있다.

인체 유래 지방조직은 최근 증가하고 있는 지방흡입시술을 통해 적출된 것으로 할 수 있다.

도 2는 세포외기질을 분리하는 단계(S10)의 상세 순서도이다.

도 2를 참조하면, 지방조직을 준비하는 단계(S11)와, 지방조직을 분쇄하는 단계(S12)와, 분쇄된 지방조직을 알코올에 혼합하고 원심분리하는 단계(S13)와, 세포외기질을 추출하는 단계(S14)와, 추출된 세포외기질을 동결건조하는 단계(S15)를 포함한다.

먼저, S11단계에서는 혈액을 제거한 지방조직을 준비한다. 이때의 지방조직은 인체유래 지방조직일 수 있으며, 인체유래 지방조직은 지방흡입 시술에 의해 얻어진 것으로 할 수 있다.

그 다음, S12단계에서 지방조직을 균질기로 분쇄한다. 이때 분쇄는 10,000rpm에서 60초간 수행되는 것일 수 있다.

도 3은 분쇄된 지방조직의 사진이다.

그 다음, S13단계와 같이 분쇄된 지방조직에 에틸 알코올, 이소프로필 알코올 또는 메틸 알코올인 알코올과 3차 증류수를 혼합한다.

이때의 알코올과 3차 증류수의 첨가량은 특정되지 않는다.

도 4에 알코올과 3차 증류수 용액이 혼합된 지방조직의 사진을 도시하였다.

그 다음, 알코올 용액이 혼합된 지방조직을 원심분리기에서 분리한다. 분리과정은 원심분리기를 4,000rpm에서 10분간 가동하는 것일 수 있다. 원심분리기를 사용하지 않고 교반기를 이용하여 교반 후, 상분리가 일어날 때까지 5 내지 30분 기다리는 방법을 사용할 수 있다.

이와 같은 분리과정을 통해, 밀도차이에 의해 지방과 세포외기질을 분리할 수 있다.

밀도차이에 의해 분리된 상태의 사진을 도 5에 도시하였다.

그 다음, S14단계와 같이 알코올 용액 내에서 분리된 세포외기질을 추출한다.

앞서 설명한 바와 같이 밀도차이에 의해 세포외기질은 지방과 분리되어 용액 내에서 일부는 침전되며, 다른 일부는 침전되지 않고 지방과 함께 상부에 위치할 수 있다.

양측에 각각 위치하는 세포외기질을 추출하기 위하여 침전되지 않은 세포외기질은 표준체에 여과시켜 추출한 후, 다시 침전된 세포외기질을 추출할 수 있다.

도 6과 도 7에 각각 여과를 통해 획득한 세포외기질과 침전된 세포외기질의 사신을 도시하였다.

이처럼 얻어진 세포외기질을 S15단계와 같이 동결건조한다.

세포외기질을 분리하기 위하여 본 발명은 알코올 용액에 세포조직을 혼합하고, 밀도차를 이용하여 쉽게 분리할 수 있기 때문에 공정 시간을 단축할 수 있다.

즉, 위의 과정을 통해 지방층과 혈액층이 분리되며, 혈액층에는 세포외기질이 침전되고, 상층인 지방층에는 세포외기질의 일부가 포함될 수 있으며, 지방층에 포함된 세포외기질은 여과를 통해 분리할 수 있다.

그 다음, S20단계와 같이 동결건조된 세포외기질에서 콜라겐을 추출한다.

도 8은 S20단계의 상세 순서도이다.

먼저, S21단계와 같이 1차 바이러스 불활성화 및 불순물을 제거한다. 이때의 불순물은 콜라겐이 아닌 다른 성분인 것으로 한다.

1차 바이러스 불활성화 및 불순물 제거 과정은 0.1 ~ 0.5M의 NaOH에 24시간 침지시켜 바이러스 및 불순물을 제거한 후, pH7의 증류수로 pH가 7.5 이하가 될 때까지 세척한다.

그 다음, S22단계는 2차 바이러스 불활성화 및 콜라겐을 추출한다.

2차 바이러스 불활성화 공정은 산 및 효소 처리과정이며, 0.5 ~ 1.OM의 펩신(pepsin) 함유 아세트산(acetic acid)에 48시간 동안 침지시켜 처리한다.

2차 바이러스 불활성화 및 추출된 콜라겐 용액은 S23단계에서는 다중 여과 과정을 통해 불순물을 제거하고, S24 단계에서 NaCl을 첨가하여 콜라겐을 추출한다.

S23단계는 다중여과를 실시하여 콜라겐의 순도를 향상시킨다.

그 다음, S25 단계에서 50 ~ 80% 에탄올 용액으로 3차 바이러스 불활성화 및 불순물 제거를 수행한다.

50 ~ 80% 에탄올 용액으로 전기전도성이 20 ~ 100μS/cm가 될 때까지 세척한 후 70% 에탄올 용액에 24시간 침지시켜 처리할 수 있다.

추출된 콜라겐은 S26단계와 같이 0.5 ~ 1.OM 아세트산에 용해시킨 후, 정제한다.

이때의 정제는 50,000 ~ 100,000 MWCO(Molecular Weight Cut Off) 여과를 수행하는 것이며, 증류수에서 24시간 수행될 수 있다.

이와 같은 과정을 통해 보다 안전하고 순도 높은 콜라겐을 추출할 수 있다.

그 다음, S30단계와 같이 정제된 콜라겐을 제품화한다.

S30단계는 필요에 따라 액상형 또는 고체형으로 제품화할 수 있다.

도 9는 S30단계의 일예의 순서도로서, S27단계에서 정제된 콜라겐을 0.5 ~ 1.0 M 아세트산에 용해시켜 여과한 후(S31), 솔루션 제형 콜라겐(S32)을 얻을 수 있다.

도 10은 S30단계의 다른 예의 순서도이다.

S33단계에서와 같이 상기 S25단계에서 정제된 콜라겐을 동결건조한다.

그 다음, S34단계에서는 EO가스 또는 전자빔(1 ~ 25 kGy) 처리된 멸균 전용팩에 동결건조된 콜라겐을 포장한 후, S35단계와 같이 EO가스로 멸균처리하여 고체형의 콜라겐 제품을 얻을 수 있다.

이후의 과정에서는 시험 및 분석을 수행할 수 있다.

도 11은 종래 돈피유래 콜라겐과 본 발명으로 추출된 콜라겐의 전기영동 결과이다.

본 발명의 방식은 여과를 하지 않은 콜라겐과 다중여과를 수행한 콜라겐을 함께 비교하였다.

전기영동(SDS-page, Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)의 결과 다중여과를 수행한 본 발명의 콜라겐이 알파1(α1), 알파2(α2) 및 베타(β) 분획이 선명하게 나타나는 것을 확인할 수 있다.

도 12는 여과하지 않은 콜라겐과 다중여과한 콜라겐의 순도 비교도이다.

이에 도시한 바와 같이 본 발명에서 다중여과를 수행한 콜라겐이 더 높은 순도를 나타낸다.

이상에서 본 발명에 따른 실시예들이 설명되었으나, 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 분야에서 통상적 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 범위의 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 다음의 청구범위에 의해서 정해져야 할 것이다.

Claims (7)

1. a) 지방조직에서 세포외기질을 분리하는 과정과, b) 지방조직에서 분리된 세포외기질에서 콜라겐을 추출하는 과정을 포함하되,
   상기 a) 과정은,
   a-1) 혈액이 제거된 지방조직을 분쇄하는 단계; 및
   a-2) 분쇄된 상기 지방조직을 알코올 및 3차 증류수에 혼합 교반한 후, 밀도차를 이용하여 세포외기질을 분리하는 단계를 포함하는 지방조직에서 세포외기질 및 콜라겐을 추출하고,
   상기 b) 과정은,
   b-1) 0.1 ~ 0.5M의 NaOH에 24시간 침지시켜 세포외기질에서 바이러스 및 불순물을 제거한 후, pH7의 증류수로 세척하여 pH7.5가 될 때까지 세척하는 단계;
   b-2) 상기 b-1) 단계의 결과물을 50 ~ 80% 에탄올 용액에 전기전도성이 20 ~ 100μS/cm가 될 때까지 세척한 후 24시간 침지시키는 단계;
   b-3) 상기 b-2) 단계의 결과물을 0.5 ~ 1.0M의 펩신(pepsin) 함유 아세트산(acetic acid)에 48시간 동안 침지시키는 단계;
   b-4) 상기 b-3) 단계 후, 다중여과를 통해 콜라겐을 추출하고, 단계; 및
   b-5) 상기 b-4) 단계의 결과물을 0.5 ~ 1.0M 아세트산에 용해시킨 후 50,000 내지 100,000 MWCO(Molecular Weight Cut Off) 여과를 수행하여 정제하는 단계를 더 포함하는 지방조직에서 세포외기질 및 콜라겐을 추출하는 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 알코올은,
   에틸 알코올, 이소프로필 알코올 또는 메틸 알코올인 것을 특징으로 하는 지방조직에서 세포외기질 및 콜라겐을 추출하는 방법.
3. 제2항에 있어서,
   상기 a-2) 단계는,
   원심분리를 통해 세포외기질을 분리하거나, 교반 후 상분리를 기다리는 것을 특징으로 하는 지방조직에서 세포외기질 및 콜라겐을 추출하는 방법.
4. 제3항에 있어서,
   상기 세포외기질은,
   상기 세포외기질은 일부가 침전되고, 다른 일부는 침전되지 않으며,
   침전되지 않은 세포외기질은 여과를 통해 분리하고, 침전된 세포외기질을 획득하는 것을 특징으로 하는 지방조직에서 세포외기질 및 콜라겐을 추출하는 방법.
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