CN116554304A - 一种胶原蛋白及其纯化方法、提取方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种胶原蛋白及其纯化方法、提取方法和应用，属于生物材料领域，制备方法包括：将提取的胶原蛋白粗品在0.1％～0.8％的磷酸溶液中重悬，高速离心，去上清，获得胶原蛋白沉淀，所述沉淀为凝胶状液体。本发明运用磷酸与其它蛋白和胶原蛋白的特殊溶解关系，有效的分离非胶原蛋白及不需要的肽键断裂的小分子胶原蛋白；处理过程简单，周期短，除离心机等通用设备外，不需要购置其它的大型设备，磷酸安全无毒，成本低，得率高，所提取的胶原蛋白纯度高，免疫原性低，能用于化妆品、食品、医疗器械等产品。

Description

一种胶原蛋白及其纯化方法、提取方法和应用

技术领域

本发明涉及生物材料领域，具体涉及一种胶原蛋白及其纯化方法、提取方法和应用。

背景技术

现有的动物组织胶原蛋白提取纯化方法，有的涉及盐析、透析，例如透析袋，通常需要数天时间，周期较长，要么采用类似于超滤等技术，涉及大型设备，投入较大，有的涉及亲和层析，采用多肽与胶原结合，多肽等生物基材料保存条件苛刻，制作成本高。

现有技术在从动物组织以牛跟腱为例，牛跟腱经清洗、脱脂、除杂蛋白、胃蛋白酶去端肽(免疫原)处理后，基本是盐析、透析、亲和层析、流动的超滤等，周期长、设备投入大，有的采用有一定毒性的试剂，需要去除而不能直接用于化妆品和医用领域。

发明内容

发明目的

为克服上述不足，本发明的目的在于提供一种胶原蛋白及其纯化方法、提取方法和应用，该胶原蛋白周期短，提取工艺过程简单，不使用有毒试剂，不添加大型设备，运用磷酸与其它蛋白和胶原蛋白的特殊溶解关系，有效的分离非胶原蛋白及不需要的肽键断裂的小分子胶原蛋白。

解决方案

为实现本发明目的，本发明采用的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种胶原蛋白的纯化方法，将提取的胶原蛋白粗品在0.1％～0.8％的磷酸溶液中重悬，高速离心，去上清，获得胶原蛋白沉淀。

进一步地，所述沉淀可以为凝胶状液体。

进一步地，将所述胶原蛋白沉淀在0.1％～0.8％的磷酸溶液中重悬，高速离心，去上清，获得进一步纯化的胶原蛋白沉淀；可选地，采用0.1％～0.8％的磷酸溶液重复多次纯化的胶原蛋白沉淀。

进一步地，所述磷酸溶液的浓度为0.2％～0.6％，可选地为0.3％～0.5％。

进一步地，高速离心的转速为5000～15000rpm/min，离心3～15min；可选地高速离心的转速为8000～15000rpm/min，离心4～10min；可选地高速离心的转速为9000～12000rpm/min，离心4～8min。

进一步地，将胶原蛋白沉淀浓缩，去除磷酸，得到胶原蛋白。

进一步地，浓缩方法为调pH至5～8，使胶原蛋白析出浓缩；或者，浓缩方法为冷冻干燥浓缩。

进一步地，去除磷酸的方法为：缓冲液洗、水洗、透析或微滤；可选地，所述缓冲液为DPBS缓冲液。

进一步地，所述胶原蛋白粗品的来源为动物组织；可选地，所述动物组织选自牛跟腱或鼠尾、猪皮、猪跟腱、牛皮、鱼皮等中的一种或几种。

进一步地，所述胶原蛋白粗品为从动物组织中提取的胶原蛋白粗品或含有胶原蛋白的溶液。

进一步地，所述胶原蛋白沉淀中胶原蛋白浓度为1mg/ml以上，可选地为1.8mg/ml以上。

再一方面，提供一种胶原蛋白的提取方法，包括胶原蛋白粗品的提取和所述的纯化方法。

进一步地，所述胶原蛋白粗品的提取方法为：将动物组织进行前处理，生理盐水清洗，氢氧化钠浸泡，脱脂，Tris-HCl除杂蛋白，酸泡胀，胃蛋白酶处理去除端肽，调pH至中性，离心取沉淀得到含胃蛋白酶的胶原蛋白粗品；可选地，所述动物组织为牛跟腱或鼠尾。

进一步地，所述胶原蛋白粗品的提取方法为：将动物尾扒皮，截断，截断的动物尾用酒精和PBS浸泡，然后抽取胶原蛋白丝，将胶原纤维丝用乙酸溶液浸泡溶解得胶原蛋白粗品。

另一方面，提供一种胶原蛋白，采用所述的纯化方法或所述的提取方法获得的胶原蛋白。

又一方面，提供一种所述的胶原蛋白在制备化妆品、食品或药品中的应用。

有益效果

本发明运用磷酸与其它蛋白和胶原蛋白的特殊溶解关系，有效的分离非胶原蛋白及不需要的肽键断裂的小分子胶原蛋白；处理过程简单，周期短，除离心机等通用设备外，不需要购置其它的大型设备，磷酸安全无毒，成本低，得率高，所提取的胶原蛋白纯度高，免疫原性低，能用于化妆品、食品、医疗器械等产品。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

图1为本发明的实施例1、实施例2及市售牛胶原蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中，酶指的胶原蛋白酶，酶与胶原①为采用胶原蛋白酶处理实施例1的牛胶原蛋白4h后的样品；①为实施例1提取的牛胶原蛋白；酶与胶原②为采用胶原蛋白酶处理实施例2的牛胶原蛋白4h后的样品；②为实施例2提取的牛胶原蛋白；酶与胶原③为采用胶原蛋白酶处理市售某高纯牛胶原蛋白4h后的样品；③为市售某高纯牛胶原蛋白。

图2为不同样品的SDS-PAGE电泳图；其中，1、为实施例1步骤⑦的胶原蛋白粗品，以非还原型上样缓冲液处理后上样；2、为实施例1步骤⑦的胶原蛋白粗品，以还原型上样缓冲液处理后上样；3、为实施例1步骤⑦的胶原蛋白粗品中加入0.1％乙酸重悬后，高速离心弃上清，将蛋白沉淀以非还原型上样缓冲液处理后上样；4、为实施例1步骤⑦的胶原蛋白粗品中加入0.1％乙酸重悬后，高速离心弃上清，将蛋白沉淀以还原型上样缓冲液处理后上样；5、为实施例1步骤⑦的胶原蛋白粗品中加入0.01mol/LHCL重悬后，高速离心弃上清，将蛋白沉淀以非还原型上样缓冲液处理后上样；6、为实施例1步骤⑦的胶原蛋白粗品中加入0.01mol/LHCL重悬后，高速离心弃上清，将蛋白沉淀以还原型上样缓冲液处理后上样；7、为实施例1步骤⑦的胶原蛋白粗品中加入0.5％磷酸重悬后，高速离心弃上清，将蛋白沉淀以非还原型上样缓冲液处理后上样；8、为实施例1步骤⑦的胶原蛋白粗品中加入0.5％磷酸重悬后，高速离心弃上清，将蛋白沉淀以还原型上样缓冲液处理后上样；9、为实施例1步骤⑦的胶原蛋白粗品中加入0.5％磷酸重悬后高速离心弃上清，重复处理2次，即磷酸共洗3次，将蛋白沉淀以非还原型上样缓冲液处理后上样；10、为实施例1步骤⑦的胶原蛋白粗品中加入0.5％磷酸重悬后高速离心弃上清，重复处理2次，即磷酸共洗3次，将蛋白沉淀以还原型上样缓冲液处理后上样；高速离心是指1万转离心。

图3本发明的实施例3鼠尾胶原蛋白的SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

本发明中所说的百分比均为体积百分比。

实施例1

①前处理牛蹄筋经纯水浸泡72h，每24h更换纯水；用剪刀、镊子、手术刀等工具将牛跟腱从牛蹄筋中分离，分离的牛跟腱浸泡在0.9％氯化钠溶液中，用手术刀将残余筋膜尽量剔除干净，再将牛跟腱用剪刀剪至4mm薄片，分多次用粉碎机绞碎，P档5-10s/次，绞碎物用0.9％氯化钠溶液浸泡4h。(注：粉碎机每次工作时间不超过10s，时间过长，刀片会发烫，高温会降低活性成分)。

②除非胶原蛋白100目筛网过滤步骤①的盐溶液，用0.1mol/L氢氧化钠溶液浸泡牛跟腱绞碎物，于4℃搅拌24h，中间换液一次。

③脱脂处理过滤步骤②的碱溶液，用纯水反复漂洗牛跟腱至中性，滤水后加入0.9％氯化钠溶液，浸泡10min测pH值，过滤盐溶液，加入75％乙醇在4℃下搅拌2h，中间换液一次。

④除杂蛋白过滤步骤③的醇溶液，用含4.5mol/L氯化钠的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液反应24h。过滤缓冲溶液，牛跟腱绞碎物用0.9％氯化钠溶液清洗6次，每次10min。

⑤酸泡胀取步骤④牛跟腱绞碎物，加入少量的0.5mol/L乙酸，用匀浆机搅拌为粘稠状混合物，按液料比30-50:1加入0.5M乙酸溶液于4℃溶胀24h。

⑥酶解按料质比10:1加入胃蛋白酶至步骤⑤混合溶液中，4℃下搅拌72h。4℃，10000rpm离心2h，收集上清。

⑦析出经NaOH调PH至中性，胶原析出呈白色，有分层，离心取沉淀得牛胶原蛋白粗品。

⑧纯化牛胶原蛋白粗品，采用0.5％的磷酸溶液充分溶解(搅拌或震荡或移液管等吹吸)分散胶原，1万转/分钟，5分钟，离心，对光找出分层，弃上清，得凝胶状胶原蛋白液体。

实施例2

①磷酸继续纯化取实施例1的牛胶原蛋白液体，采用0.2％～0.6％的磷酸溶液充分重悬，再经1万转/分钟，5分钟离心，对光找出分层，弃上清，得凝胶状胶原蛋白液体。

②重复步骤①的方法用0.5％的磷酸溶液重复清洗多次(也可只进行一次)，重复多次，得到的沉淀量减少基本不明显，即损失较小，得到含胶原的凝胶状液体，即纯化后胶原蛋白，经双缩脲法测量，离心分层沉淀胶原浓度约为2mg/ml。

为了验证磷酸纯化胶原蛋白的效果，用Ⅰ型胶原酶分别对实施例1的胶原蛋白粗品、实施例2纯化后胶原蛋白、某市售高纯胶原蛋白进行了酶解，经7％SDS-PAGE120伏凝胶电泳，结果见图1，结果表明，实施例1、2的胶原蛋白和市售胶原蛋白在酶解后未发现杂蛋白，α链后未见明显的条带，与市售的某款牛跟腱胶原同法处理，小分子的的含量更加不明显。即本发明通过多次磷酸溶液重悬清洗，可以去除不需要的杂蛋白，如胃蛋白酶，可能也能去除不需要的小分子胶原蛋白(约小于130Kda,130Kda为Ⅰ型胶原蛋白最小的α链)，从而进一步降低免疫原性。

本发明的发明人还进一步比较了乙酸与盐酸的处理效果，经7％SDS-PAGE120伏凝胶电泳，结果见图2，结果表明，0.1％乙酸重悬高速离心处理后的蛋白沉淀(图2，泳道3、4)虽然也能保留胶原蛋白，但有较多的絮状条带，且未去除胃蛋白酶(35KDa)，0.01mol/LHCL重悬高速离心处理后蛋白沉淀(图2，泳道5、6)也是具有较多的絮状条带，且未去除胃蛋白酶(35KDa)。而经过0.5％磷酸重悬处理后的蛋白沉淀没有絮状条带和蛋白酶条带，说明0.5％磷酸能选择性的去除杂蛋白，从而纯化胶原蛋白。图2泳道7～10中虽然也有些小分子量的蛋白条带，可能是因为胶原蛋白粗品存放较久发生了断裂或降解，但依然可以看出0.5％磷酸能选择性的去除杂蛋白及胃蛋白酶，从而纯化胶原蛋白。

本发明的发明人发现0.1～0.8％的磷酸均能较好的选择性去除杂蛋白，优选为0.2～0.6％的磷酸溶液，优选为0.3～0.5％的磷酸溶液，更优选为0.5％的磷酸溶液。

实施例3

按照实施例1、2的方法处理鼠尾，得到鼠尾胶原蛋白。鼠尾胶原蛋白不同于牛跟腱胶原蛋白，鼠尾胶原蛋白参照实施例1的步骤⑦调PH不能完全析出，但通过磷酸溶液清洗，离心后分层更好，呈白色沉淀。经还原型上样缓冲液(含β巯基乙醇)反应，10％SDS-PAGE凝胶电泳，结果见图2，结果表明，通过多次磷酸溶液重悬清洗，可以去除不需要的杂蛋白，如胃蛋白酶，不需要的小分子胶原蛋白，从而进一步降低免疫原性。

通过磷酸清洗纯化胶原蛋白是发明人无意中发现的，在胶原蛋白的考马斯亮蓝染色实验(含有磷酸溶液)中发现了蛋白沉淀，发明人经过进一步探索发现，磷酸中的氢离子能破坏使胶原聚集的氢键，从而使析出的胶原溶解，但是低浓度的磷酸溶液却不能使大分子的胶原完全溶解成溶液，而磷酸溶液能溶解大部分的蛋白质形成均一溶液(不能通过离心使该类蛋白分离)，由于磷酸与胶原蛋白的溶解关系不同于其它蛋白，通过磷酸溶液溶解胶原蛋白粗品后，其它大部分蛋白不能离心沉淀，而胶原蛋白能够离心成为凝胶状或非凝胶状的沉淀。另外，发明人还发现，如果取较高浓度的用乙酸溶解的胶原蛋白置于磷酸溶液中，胶原蛋白会析出。通过不断的摸索研究，发明人发现采用低浓度的磷酸溶液(0.1％～0.8％，优选为0.2％～0.6％)可以恰到好处的得到纯度较高的凝胶状胶原蛋白液体或非凝胶状的胶原沉淀。

实施例4

将实施例2或3的凝胶状胶原蛋白液体经浓缩，干燥后可获得纯度较高(按YY0954-2015附录B测试)的胶原蛋白。浓缩可以采用加碱调PH析出浓缩，浓缩后可以用缓冲液水洗去除磷酸和不需要的磷酸盐；也可以直接冷冻干燥浓缩。

本发明利用磷酸与胶原蛋白的溶解关系不同于其它蛋白，可以很好的去除不需要的杂蛋白，如胃蛋白酶，不需要的小分子胶原蛋白(小于约130Kda,Ⅰ型胶原蛋白最小的α链)，从而进一步降低免疫原性。并且已有食品级磷酸上市销售，安全无毒，可以直接用于胶原面膜、食品、药品等产品，增加了胶原蛋白的适用范围。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种胶原蛋白的纯化方法，其特征在于，将提取的胶原蛋白粗品在0.1％～0.8％的磷酸溶液中重悬，高速离心，去上清，获得胶原蛋白沉淀。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，将所述胶原蛋白沉淀在0.1％～0.8％的磷酸溶液中重悬，高速离心，去上清，获得进一步纯化的胶原蛋白沉淀；可选地，采用0.1％～0.8％的磷酸溶液重复多次纯化的胶原蛋白沉淀。

3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，所述磷酸溶液的浓度为0.2％～0.6％，可选地为0.3％～0.5％；

和/或，高速离心的转速为5000～15000rpm/min，离心3～15min；可选地高速离心的转速为8000～15000rpm/min，离心4～10min；可选地高速离心的转速为9000～12000rpm/min，离心4～8min。

4.根据权利要求1至3任一所述的纯化方法，其特征在于，将胶原蛋白沉淀浓缩，去除磷酸，得到胶原蛋白；

可选地，浓缩方法为调pH至5～8，使胶原蛋白析出浓缩；或者，浓缩方法为冷冻干燥浓缩；

可选地，去除磷酸的方法为：缓冲液洗、水洗、透析或微滤，可选地，所述缓冲液为DPBS缓冲液。

5.根据权利要求1至4任一所述的纯化方法，其特征在于，所述胶原蛋白粗品的来源为动物组织；可选地，所述动物组织选自牛跟腱、鼠尾、猪皮、猪跟腱、牛皮和鱼皮中的一种或几种；

和/或，所述胶原蛋白粗品为从动物组织中提取的胶原蛋白粗品或含有胶原蛋白的溶液。

6.根据权利要求1至5任一所述的纯化方法，其特征在于，所述胶原蛋白沉淀中胶原蛋白浓度为1mg/ml以上，可选地为1.8mg/ml以上；

和/或，所述胶原蛋白为I型胶原蛋白；

和/或，所述胶原蛋白沉淀为凝胶状液体或白色固态沉淀。

7.一种胶原蛋白的提取方法，其特征在于，包括胶原蛋白粗品的提取和权利要求1至6任一所述的纯化方法。

8.根据权利要求7所述的提取方法，其特征在于，所述胶原蛋白粗品的提取方法为：将动物组织进行前处理，生理盐水清洗，氢氧化钠浸泡，脱脂，Tris-HCl除杂蛋白，酸泡胀，胃蛋白酶处理去除端肽，调pH至中性，离心取沉淀得到含胃蛋白酶的胶原蛋白粗品；可选地，所述动物组织为牛跟腱或鼠尾；

或者，所述胶原蛋白粗品的提取方法为：将动物尾扒皮，截断，截断的动物尾用酒精和PBS浸泡，然后抽取胶原蛋白丝，将胶原纤维丝用乙酸溶液浸泡溶解得胶原蛋白粗品。

9.一种胶原蛋白，其特征在于，采用权利要求1至6任一所述的纯化方法或权利要求7或8所述的提取方法获得的胶原蛋白。

10.一种权利要求9所述的胶原蛋白在制备化妆品、食品或药品中的应用。