KR100703947B1 - 콜라겐의 제조방법 - Google Patents

Abstract

콜라겐의 제조방법, 구체적으로는 고 순도의 저분자량 콜라겐을 고효율로 제조할 수 있는 제조방법이 개시된다.

상기 제조방법은 (a) 돈피를 염기처리와 산 처리를 순차적으로 실시하여 이물질을 제거하는 전 처리 단계; (b) 전 처리한 돈피를 효소처리 하여 가수 분해물을 얻는 가수분해 단계; (c) 얻어진 가수 분해물에 분산용액을 첨가하여 전 처리한 후, 염기성 용액을 첨가하여 고분자량의 가수 분해물을 저분자량으로 파쇄 하는 단계; (d) 얻어진 저분자량의 가수 분해물을 물질별로 분리하여 이물질을 제거하는 정제단계; (e) 정제된 분획 물을 열처리한 후 여과하는 단계; 및 (f) 여과 물을 농축한 후 저분자량 콜라겐을 정제하는 단계를 포함한다.

콜라겐, 콜라겐의 제조방법, 돈피 콜라겐

Description

콜라겐의 제조방법 {Process for preparing collagen}

본 발명은 콜라겐의 제조방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 고 순도의 저분자량 콜라겐을 고효율로 제조할 수 있는 제조방법에 관한 것이다.

일반적으로 콜라겐은 섬유상태의 단백질로서 피부와 뼈, 힘줄을 구성하는 단백질 중 하나이다. 이들은 신체의 결합 조직에 특히 많이 분포하고 있으며, 특히 우리 몸속에는 단백질이 약 20% 포함되어 있는데, 이중 콜라겐이 약 30%를 차지하고 있다. 상기 콜라겐의 분자 구조는 2개의 폴리펩티드 사슬이 감겨 수소 결합으로 서로 결합된 콜라겐 형 구조를 갖는다. 이러한 구조를 갖는 콜라겐은 세포의 접착, 몸과 장기의지지, 세포기능 활성화, 세포증식작용, 지혈, 면역력 등의 기능을 가지고 있으며, 신체를 형성함과 동시에 유기적 기능을 부여하므로 신체에서 반드시 필요로 하는 단백질이다.

이러한 특성을 갖는 콜라겐은 현재 미용, 건강음료, 건강식품, 의약품 및 화장품 분야를 포함하여 다양한 분야에서 원료나 첨가제로 사용되고 있으며, 그 기능적 특성으로 인하여 점차 그 활용분야가 확대되고 있는 추세이다.

이와 같은 콜라겐은 일반적으로 소나 돼지의 뼈와 가죽을 수집한 후, 콜라겐 을 조직으로부터 분리하기 위하여 유기용매 추출, 산/염기 처리 후 트립신, 히알루로니다아제를 작용시켜 불용성 물질로 콜라겐을 얻을 수 있으나, 이들의 분자량이 높아 인체에서의 소화 흡수가 곤란할 뿐만 아니라, 원료에 포함되어 있는 다양한 불순물 들로 인해 순도가 저하되므로 그 사용분야가 제한된다는 문제가 있다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는, 고 순도의 저분자량 콜라겐을 고효율로 얻을 수 있는 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은,

(a) 돈피를 염기처리와 산 처리를 순차적으로 실시하여 이물질을 제거하는 전 처리 단계;

(b) 전 처리한 돈피를 효소 처리하여 가수 분해물을 얻는 가수분해 단계;

(c) 얻어진 가수 분해물에 분산용액을 첨가하여 전 처리한 후, 염기성 용액을 첨가하여 고분자량의 가수 분해물을 저분자량으로 파쇄 하는 단계;

(d) 얻어진 저분자량의 가수 분해물을 물질별로 분리하여 이물질을 제거하는 정제단계;

(e) 정제된 분획 물을 열처리한 후 여과하는 단계; 및

(f) 여과 물을 농축한 후 저분자량 콜라겐을 정제하는 단계를 포함하는 콜라겐의 제조방법을 제공한다.

상기 제조방법은 상기 저분자량 콜라겐을 정제하여 얻어진 용액을 건조시켜 분말 화시키는 단계를 더 포함함으로써 분말상의 콜라겐을 용이하게 수득할 수 있다.

상기 (b) 단계의 효소처리는 전 처리한 돈피를 가수분해효소와 함께 산성용액에 첨가하여 가수 분해물을 얻는 공정을 의미하며, 이때 사용가능한 가수분해 효소로서는 펩신, 트립신, 파파인, 렐린, 콜라게나제 또는 카텝신 등을 사용할 수 있다.

상기 (c) 단계의 염기성 용액은 알칼리 금속을 포함하는 염기성 물질로서, 수산화나트륨, 수산화칼슘, 수산화칼륨 또는 수산화마그네슘 등의 수용액을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 (d) 단계의 물질별 분리 및 이물질 제거 공정은 화산석,규조토, 탈크, 퍼라이트, 셀룰로스 분말, 또는 미분말 이온교환수지를 사용하여 저분자량의 가수 분해물을 현탁시킨 후 이를 여과하는 단계;

산성 조건하에 염화나트륨을 첨가하여 상기 가수 분해물을 용해시키고 균질 화 시킨 후, 이를 정치시켜 얻어진 상청을 여과하여 회수하는 단계; 및

세파덱스-지(Sephadex-G) 겔로 충진 된 컬럼에 분리된 상청 액을 가한 후 완충액으로 분리시켜 탈염 및 초산을 제거하는 단계를 포함한다.

상기 (f) 단계의 저분자량 콜라겐의 정제 공정은 세파덱스-지 겔이 충진된 컬럼에 농축된 저분자량 콜라겐을 가한 후, 완충액을 사용하여 분획 화 시키는 단계를 포함한다.

이하에서 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다.

상술한 바와 같이 본 발명은 비교적 많은 함량의 콜라겐을 함유하고 있는 돈피로부터 적절한 살균, 추출 및 정제 여과 공정 등을 사용하여 고 순도의 저분자량 콜라겐을 고효율로 제조할 수 있게 된다.

이와 같은 본 발명의 콜라겐 제조공정은, (a) 돈피를 염기처리와 산 처리를 순차적으로 실시하여 이물질을 제거하는 전처리 단계; (b) 전 처리한 돈피를 효소 처리하여 가수 분해물을 얻는 가수분해 단계; (c) 얻어진 가수 분해물에 분산용액을 첨가하여 전 처리한 후, 염기성 용액을 첨가하여 고분자량의 가수 분해물을 저분자량으로 파쇄 하는 단계; (d) 얻어진 저분자량의 가수 분해물을 물질별로 분리하여 이물질을 제거하는 정제단계; (e) 정제된 분획 물을 열처리한 후 여과하는 단계; 및 (f) 여과 물을 농축한 후 저분자량 콜라겐을 정제하는 단계로 이루어진다.

상기 (a) 공정은 전 처리 단계로서 돈피로부터 세균 등을 제거 및 소독하고, 잔량의 털이나 색상 및 각질 등을 제거하기 위한 전 처리 공정으로서 염기 처리 및 산 처리를 순차적으로 실시하게 된다. 이와 같은 과정은 돈피의 부패 등을 방지하고 신선도를 유지하기 위하여 깨끗한 환경 및 냉장 상태에서 진행하는 것이 바람직하다.

이와 같은 전 처리를 위하여 깨끗한 비닐 포에 담아 냉장상태를 유지한 상태의 돈피에서 과도한 지질층을 제거하여 작업에 편리한 크기로 절단한다. 이어서 염기처리를 위하여 0.01M 내지 2.0M 농도의 염기성 용액, 예를 들어 수산화나트륨, 수산화칼슘, 수산화칼륨, 또는 소듐 하이포클로라이트 냉장 용액에 돈피를 충분히 잠기도록 하고, 이를 1 내지 48시간 침적하여 박테리아 등의 세균을 제거하고 소독하였다. 다음으로는 돈피의 표면상에 존재하는 잔털 등을 제거하기 위하여 상기 염기성 용액을 제거하고 0.01M 내지 2.0M의 산 용액, 예를 들어 포름산 냉장 용액에 충분히 잠기도록 하여 1 내지 48시간 동안 침적한다. 이 과정에서 발생할 수 있는 지질층은 물 등을 사용하여 수회 세척함으로써 제거하는 것이 가능하다.

상기 전 처리 과정 중 일부인 산 처리는 약 0.01 내지 1M 농도의 염산 용액, 예를 들어 Tris-HCl을 함유한 EDTA 용액에 세척된 돈피를 충분히 잠기도록 하여 냉장 상태에서 12 내지 72시간 동안 침적하여 색상 및 각질을 제거할 수 있다. 이어서 상기 침적 용액을 제거하고 물로 수회 세척한 후 물기를 제거한다. 상기 돈피의 추출이 지연될 경우 비닐 포에 담아 냉동 보관하여 추후 공정을 위하여 신선도를 유지하는 것이 바람직하다.

상기 전 처리 과정에서 추가적인 산 처리를 통해 지질층을 더 제거하는 것이 가능한 바, 이를 위해 돈피 중량의 약 1 내지 10 배 용량을 갖는 0.01 내지 2M 농도의 산 용액, 예를 들어 초산 용액에 상기 돈피를 냉장상태에서 1 내지 72시간 동안 침적시킨 후 분리된 지질을 1차적으로 제거하게 된다. 이때 침적 상태에서 매 3시간마다 교반하면서 분리된 지질을 체로 걸러 제거하는 것이 바람직하다.

상기한 1차 지질 추출 공정만으로는 불충분한 경우, 추가적으로 2차 지질 추출공정을 진행할 수 있으며, 균질화기(예를 들어 knife Homogenizer)를 이용하여 돈피를 갈아 균질 화시키고, 0.01M 내지 2.0M 농도의 산 용액, 예를 들어 초산용액 을 상기 돈피 중량의 약 1 내지 10배 함량으로 더 첨가한 후, 이 용액을 냉장 조건에서 12 내지 72시간 동안 교반한 후, 분리된 지질을 제거할 수 있다. 이때 침적 상태에서 매 3시간마다 교반하면서 분리된 지질을 체로 걸러 제거하는 것이 보다 바람직하다.

전술한 산 처리나 염기처리는 처리효율을 보다 증가시키기 위하여 가온하여 처리하는 것이 바람직하나, 가급적 단백질 변성의 우려가 없는 약 50℃ 이하에서 수행하는 것이 좋다.

이와 같은 세균, 이물질, 및 지질층의 제거를 통해 목적하는 콜라겐의 제품 순도를 증가시킬 수 있으며, 각종 악취 및 부패의 원인을 제거하여 보다 안정성이 향상된 제품을 제공할 수 있게 된다.

상술한 바와 같이 염기처리 및 산 처리 등을 순차적으로 실시하여 전 처리함으로써 세균 및 각종 이물질 등을 제거하고, 지질층을 추출하여 얻어진 전 처리된 돈피에 대하여 다음의 (b) 단계의 효소 처리를 수행하게 된다.

이와 같은 효소 처리는 상기 전 처리 과정에서 지질층을 제거한 추출액에 산, 예를 들어 초산을 첨가하여 pH 2.0 내지 3.0으로 조절한 후, 총 추출액의 가수분해 효소를 예를 들어 초산에 용해하여 첨가하게 된다. 이와 같은 효소 처리는 항온수조에서 1 내지 48시간 교반하고, 이 과정에서 분리된 지질을 체로 걸러 제거하는 것이 좋다. 상기 항온 수조의 온도는 높은 것이 바람직하나 단백질 변성을 막기 위하여 가급적 30 내지 70℃로 유지하는 것이 보다 바람직하다.

상기 효소 처리에 사용가능한 가수분해 효소로서는, 펩신, 트립신, 파파인, 렐린, 콜라게나제 또는 카텝신 등을 사용할 수 있다. 이들은 돈피에 포함되어 있는 근기질 단백질을 가수 분해시켜 분해하는 역할을 수행하며, 이때 가수분해 산물로서는 저분자량의 콜라겐 뿐 만 아니라 고분자량의 콜라겐도 생성된다.

상기 효소처리에 사용되는 가수분해 효소의 함량은 분해 시간과 처리효율을 고려하여 적절하게 선택할 수 있는 바, 본 발명에서는 상기 돈피 추출액의 0.0001 내지 0.01(W/V)%의 함량을 가하는 것이 보다 바람직하다. 상기 함량이 부족한 경우에는 충분한 가수분해를 달성하기 곤란하며, 초과하는 경우에는 초과되는 함량으로 인한 추가적인 가수 분해율이 미미하여 경제성이 없어 바람직하지 않다.

이와 같은 효소 처리에 의해 얻어진 가수 분해물은 저분자량 뿐만 아니라 고분자량의 가수 분해물도 함유하고 있어 이들을 저분자량 화 시킬 필요가 있다. 이를 위해서는 하기 (c) 단계의 분산용액 첨가 및 분자량 파쇄 공정을 수행하게 된다.

상기 가수 분해물에 분산용액을 첨가하는 것은 고분자량 가수분해물의 전 처리를 위한 것으로서, 우선 염기성 용액, 예를 들어 수산화나트륨 용액을 첨가하여 pH를 5.0 내지 5.5로 조절한 후, 약 1 내지 10.0(V/V)%의 알코올류, 예를 들어 이소프로필알콜을 첨가하고 상온에서 0.5 내지 10시간 교반한다. 분리된 지질은 체로 걸러 제거한 후, 냉장 상태에서 24시간 이상 방치하여 전 처리 단계를 수행한다.

다음으로는 정치 후 상청 용액의 지질층을 제거하고, 수욕 조에서 용액을 교반하여 균질 화시킨다. 염기성 용액, 예를 들어 수산화나트륨 수용액을 더 첨가하여 pH를 중성으로 1차 조정하여 교반하고 균질 화시킨 후, 상술한 염기성 용액을 더 첨가하여 pH를 11.5 내지 12.5로 2차 조절한다. 수욕 조에서 내부 용액의 온도를 40 내지 70℃ 정도로 증가시킨 상태에서 1 내지 10시간 동안 교반한 후, 용액을 여과하여 이물질 및 불용물을 제거한다. 산 용액, 예를 들어 초산용액으로 pH를 중성으로 조절하고, 냉장상태에서 1 내지 72시간 동안 방치함으로써 분자량 파쇄 공정을 수행하게 된다. 이와 같은 분자량 파쇄 공정에 의해 고분자량의 가수분해물이 저분자량으로 전환되므로 인체에 의한 소화 흡수가 보다 개선되어 품질이 향상된 콜라겐을 제조할 수 있게 된다.

이와 같이 분자량 파쇄 공정을 거친 가수 분해물은 (d) 단계의 물질별 분리 정제 및 이물질 제거 공정을 거침으로써 보다 고 순도의 품질을 얻게 된다. 이와 같은 정제는 간단한 마이크로 필터 및 울트라 필터 등을 이용한 일반적인 여과 공정만으로도 수행될 수 있으나, 본 발명에서는 인체에 무해한 보다 고 순도의 품질을 갖는 목적물을 얻기 위하여 3차 정제 공정을 거치는 것이 보다 바람직하다.

우선 1차 정제로서, 상기 분자량 파쇄 공정에서의 정치 후, 상청용액의 지질층을 제거한 후, 30 내지 50℃의 수욕 조에서 용액을 균질 화시킨다. 화산석,규조토, 탈크, 퍼라이트, 셀룰로스 분말, 또는 미분말 이온교환수지를 사용하여 저분자량의 가수 분해물을 현탁 시킨 후 이를 여과하여 이물질 및 불용성 물질을 제거하여 1차 정제를 수행하게 된다. 상기 화산석 등은 사용하기 전에 미리 물로 여러번 세척하여 오염물을 제거하고, 물기를 완전히 제거한 후, 추출용액 대비 0.1 내지 5.0(W/W)% 농도로 현탁 시키는 것이 바람직하다.

다음은 2차 정제공정으로서, 상기 1차 공정을 거친 여과액에 산 용액, 예를 들어 초산용액을 첨가하여 pH 5.0 내지 5.5로 조절한 후, 0.1 내지 5.0M 수산화나트륨을 첨가하여 고형 분을 완전 용해시킨 후 균질 화시킨다. 이를 냉장 상태에서 1 내지 72시간 동안 방치하고 상청을 여과하여 회수한다. 이와 같은 공정을 수차례 반복하여 2차 정제공정을 수행하게 되는 바, 바람직하게는 상기 산 용액 첨가, 수산화나트륨 첨가, 냉장 방치 및 여과 공정을 2 내지 5차례 더 수행하는 것이 바람직하다.

상기 2차 정제공정을 마친 후에는 3차 정제 공정을 수행하게 되는 바, 이 공정은 탈염 및 초산의 제거를 위해 수행된다. 우선 겔, 예를 들어 세파덱스-지 겔(Sephadex-G gel)을 물로 충분히 부풀리고 미세한 입자를 제거한 후, 준비된 컬럼에 상기 겔을 충진 하고 물로 충분히 흘려주어 세척한다. 완충액, 예를 들어 0.01M 소듐 포스페이트 완충액(pH 7.4)으로 충분히 세척한 후, 분리된 상청 액을 가급적 충진 물의 1/2이 넘지 않도록 하여 컬럼에 가한다. 0.01M 소듐 포스페이트 pH 7.4 완충액으로 분리하여 탈염 및 초산이 제거된 분획 물을 회수하게 된다.

상기 분획 물에는 추가적으로 열처리 공정을 수행하여 용액 내에 포함될 수 있는 바이러스 등을 불활성 화시키는 공정을 추가적으로 수행할 수 있으며, 이를 위해서는 온도를 40 내지 80℃로 유지한 수 욕조를 준비한 후, 상기 정제 공정을 거친 정제 액을 유리 용기에 담아 수 욕조에 침적한 후, 정제 액의 내부 온도를 약 60℃로 유지한 후 1 내지 48시간 항온 처리하여 용액 내에 포함된 바이러스 등을 불활성 화시켜 제품의 안전성을 보다 개선하게 된다. 상기 열처리가 완료된 용액은 실온까지 급랭 시킨 후, 열처리 중 생성된 이물질 등을 여과하여 제거하게 된다.

다음으로는 (f) 단계의 농축 및 추가 정제공정을 거쳐 최종 제품의 순도를 향상시키게 된다. 이를 위해 농축기를 최소한의 오염을 방지할 수 있도록 설치한 후, 상기 정제 액을 충진 하고 신속하게 농축한다.

농축이 완료되면, 최종적인 4차 정제 공정을 거치게 되는 바, 이를 위해서는 분자량별 분리가 가능한 겔을 컬럼에 충진 하고, 완충액, 예를 들어 소듐 포스페이트 완충액으로 겔을 충분히 세척한다. 이어서 상기 정제 액을 적당량 충진 하고 유속을 적당히 하여 분획 처리한다. 분획을 시작하여 최초 단백물질을 확인하고 분획 액을 수집한다. 분획물의 수집은 단백질이 확인되는 모두를 회수하는 것이 효율적인 측면에서 바람직하다.

상기 4차 정제 공정을 마친 후에는 최종 제품 무균 처리를 위해 제균 여과 공정을 더 수행할 수 있다. 이 경우 0.2 마이크로미터 카트리지 필터 제균 여과세트를 설치하고 리크 테스트를 실시하여 이상 유무를 확인한 후, 무균 상태가 되도록 고압증기 멸균기로 제균 여과 세트를 처리한다. 양압을 이용하여 분획 물을 여과한다. 여과가 끝나면 제균 여과 세트의 이상 유무를 확인한다. 이상이 발생하면 재 여과하는 것이 무균적인 제품 확보에 필수적이다

본 발명에 따른 콜라겐은 상기 정제공정을 수행하여 액상의 형태로 사용하는 것도 가능하나, 이를 건조하여 분말 화시킨 후 이를 사용하는 것도 가능하다. 분말 화시킨 경우 제품의 부패나 변질을 보다 억제할 수 있어 장기간 보관에 유리하다는 장점이 있다.

이와 같은 공정을 거쳐서 얻어진 물질은 콜라겐 순수 물질로서, 미용, 건강음료, 건강식품, 의약품 및 화장품 분야를 포함하여 다양한 분야에서 원료나 첨가제로서 유용하게 사용할 수 있다. 특히 본 발명의 제조방법에 따라 얻어진 콜라겐은 분자량이 낮고 순도가 높아 그 유용성이 보다 크다 할 것이다.

이하에서는 실시 예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명하지만 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

(a) 돈피의 전 처리 단계

깨끗한 비닐 포에 담아 냉장상태를 유지한 상태의 돈피에서 과도한 지질층을 제거하여 작업에 편리한 크기로 절단한다. 0.1(W/V)%의 소듐 하이포클로라이트 냉장 용액에 돈피를 충분히 잠기도록 하여 약 24시간 동안 침적하여 박테리아를 제거하고 소독하였다. 상기 소듐 하이포클로라이트 용액을 제거하고 0.1(W/V)%의 포름산 냉장 용액에 충분히 잠기도록 하여 1일간 침적시켜 잔량의 털을 제거하였다. 이어서 물로 수회 세척하여 지질층을 제거하였다. 약 50mMol Tris-HCl(pH 7.6)을 함유한 0.1mMol EDTA 용액에 세척된 돈피를 충분히 잠기도록 하여 냉장 상태에서 12시간 이상 침적하여 색상 및 각질을 제거하였다. 이어서 상기 침적 용액을 제거하고 물로 수회 세척한 후 물기를 제거하였다.

상기 돈피 중량의 약 2배 용량을 갖는 0.5몰 초산 용액에 상기 돈피를 냉장상태에서 2일간 침적하였다. 이때 침적 상태에서 매 3시간마다 교반하면서 분리된 지질을 체로 걸러 제거하여 1차 추출공정을 수행하였다.

균질화기(Knife Homogenizer)를 이용하여 돈피를 갈아 균질 화시키고, 0.5몰 초산용액을 총 중량의 약 2배 함량으로 더 첨가하였다(중량의 총 6배). 이어서 상기 용액을 냉장 조건에서 24시간 이상 교반하였다. 교반 중 분리된 지질을 체로 걸러 제거하여 2차 추출 공정을 수행하였다.

(b) 효소 처리 단계

상기 추출액에 초산을 첨가하여 pH 2.0으로 조절한 후, 총 추출액의 약 0.001(W/V)%에 해당하는 펩신을 초산에 용해하여 첨가하였다. 이어서 약 37℃ 항온수조에서 3시간 항온 교반하고, 분리된 지질을 체로 걸러 제거하였다.

(c) 분산용액 첨가 및 분자량 파쇄 단계

상기 효소 처리된 용액에 10N NaOH를 첨가하여 pH 5.0으로 조절한 후, 2.0(V/V)%의 이소프로필알콜을 첨가하고 상온에서 1.5시간 교반하였다. 분리된 지질은 체로 걸러 제거한 후, 냉장 상태에서 24시간 이상 방치하였다.

정치 후 상청 용액의 지질층을 제거하고, 약 37℃ 수욕 조에서 용액을 교반하여 균질 화시켰다. 10N NaOH를 더 첨가하여 pH를 중성으로 1차 조정하여 교반하고 계속 균질 화시켰다. 10N NaOH를 더 첨가하여 pH를 11.5 내지 12.5로 2차 조절하였다. 60℃ 수욕 조에서 내부 용액의 온도가 60℃에 도달한 후 3시간 동안 교반한 후, 용액을 여과하여 이물질 및 불용물을 제거하였다. 초산용액으로 pH를 중성으로 조절하고, 냉장상태에서 24시간 동안 방치하였다.

(d) 물질별 분리 및 이물질 제거 단계

1차 정제

정치 후, 상청용액의 지질층을 제거한 후, 37℃ 수욕 조에서 용액을 균질 화시켰다. 화산석을 물로 3회 세척하여 물기를 완전히 제거하고 추출용액 대비 2.0(W/W)% 농도로 현탁 시켰다. 이어서 상기 용액을 여과하여 이물질 및 불용성 물질을 제거하였다.

2차 정제

초산을 첨가하여 pH 5.0으로 조절한 후, 1.0M 수산화나트륨을 첨가하여 완전용해 후 균질 화시켰다. 냉장 상태에서 24시간 이상 방치하고, 상청을 여과하여 회수하였다. 다시 초산을 첨가하여 pH 4.0 내지 4.5로 조정하였다. 2.0M 수산화나트륨을 더 첨가하여 완전 용해시킨 후 균질 화시켰다. 이를 냉장 상태에서 24시간 이상 방치한 후, 상청을 여과하여 회수하였다. 여기에 초산을 첨가하여 pH 3.0 내지 3.5로 조절하였다. 이어서 1.0M 수산화나트륨을 첨가하여 교반함으로써 용액을 균질 화시켰다. 이 용액을 냉장상태에서 24시간 이상 방치한 후, 상청을 여과하여 회수하였다.

3차 정제

세파덱스-지 겔을 물로 충분히 부풀리고 미세한 입자를 제거한 후, 준비된 컬럼에 겔을 충진 하고 물로 충분히 흘려주어 세척하였다. 0.01M 소듐 포스페이트 pH 7.4 완충액으로 충분히 세척한 후, 분리된 상청 액을 충진 물의 1/2이 넘지 않 도록 하여 컬럼에 가하였다. 0.01M 소듐 포스페이트 pH 7.4 완충액으로 분리하여 탈염 및 초산이 제거된 분획 물을 회수하였다.

(e) 열처리 및 여과 단계

항온 수조에 물을 채우고, 온도계를 장치하여 수욕조의 온도를 60℃로 유지하였다. 이어서 상기 정제 액을 유리 용기에 담아 수욕 조에 침적한 후, 정제 액의 내부 온도가 60℃에 도달하도록 하고, 10시간 동안 항온 처리하여 용액의 바이러스 등을 불활성 화시켰다. 열처리가 완료된 용액을 실온까지 급랭시킨 후, 여과 세트를 이용하여 열처리 중 생성된 이물질 등을 여과하여 제거하였다.

(f) 농축 및 4차 정제 단계

농축기를 최소한의 오염을 방지할 수 있도록 설치한 후, 상기 정제 액을 충진 하고 신속하게 농축하였다. 이어서 분자량별 분리가 가능한 겔을 컬럼에 충진 하고, 0.01M 소듐 포스페이트 pH 7.4 완충액으로 겔을 충분히 세척하였다. 이어서 상기 정제 액을 적당량 충진 하고 유속을 적당히 하여 분획 처리하였다. 분획을 시작하여 최초 단백물질을 확인하고 분획 액을 수집하였다. 분획물의 수집은 단백이 확인되는 모두를 회수하여 돈피로부터 유래되는 콜라겐을 제조하였다.

이어서 제균 여과세트를 설치하고 리크 테스트를 실시하여 이상 유무를 확인한 후, 무균 상태가 되도록 제균 여과 세트를 처리한다. 양압을 이용하여 분획 물을 제거하였다. 여과가 끝나면 제균 여과 세트의 이상 유무를 확인한다. 이상이 발 생하면 재 여과하였다.

최종적으로 얻어진 순수 콜라겐에 대하여 HPLC를 이용하여 분자량과 순도를 측정한 결과, 분자량 범위는 20,000 이하이며, 순도는 약 92% 이였다.

본 발명에 따른 콜라겐의 제조방법은 돈피로부터 고 순도의 저분자량 콜라겐을 고효율로 제조할 수 있으며, 이와 같이 얻어진 콜라겐은 미용, 건강음료, 건강식품, 의약품 및 화장품 분야를 포함하여 다양한 분야에서 원료나 첨가제로서 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (7)

1. (a) 돈피를 염기처리와 산 처리를 순차적으로 실시하여 이물질을 제거하는 전 처리 단계;

   (b) 전 처리한 돈피를 효소처리하여 가수 분해물을 얻는 가수분해 단계;

   (c) 얻어진 가수 분해물에 분산용액을 첨가하여 전 처리한 후, 염기성 용액을 첨가하여 고분자량의 가수 분해물을 저분자량으로 파쇄 하는 단계;

   (d) 얻어진 저분자량의 가수 분해물을 물질별로 분리하여 이물질을 제거하는 정제단계;

   (e) 정제된 분획 물을 열처리한 후 여과하는 단계; 및

   (f) 여과물을 농축한 후 세파덱스-지 겔이 충진 된 컬럼에 농축된 저분자량 콜라겐을 가한 후, 완충액을 사용하여 분획화시켜 1,000 이상 20,000 이하 분자량의 콜라겐을 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라겐의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 (f) 단계에서 정제된 1,000 이상 20,000 이하 분자량의 콜라겐 용액을 건조하여 분말화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라겐의 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 효소처리가 전 처리한 돈피를 가수분해효소와 함께 산성용액에 첨가하여 가수 분해물을 얻는 공정임을 특징으로 하는 콜라겐의 제조방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 가수분해 효소는 펩신, 트립신, 파파인, 렐린, 콜라게나제 및 카텝신으로 구성된 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 콜라겐의 제조방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 염기성 용액은 수산화나트륨, 수산화칼슘, 수산화칼륨 및 수산화마그네슘으로 구성된 군중에서 선택된 수용액인 것을 특징으로 하는 콜라겐의 제조방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 물질별 분리 및 이물질 제거 공정이,

   화산석, 규조토, 탈크, 퍼라이트, 셀룰로스 분말, 및 미분말 이온교환수지로 이루어진 군중에서 선택된 것을 사용하여 저분자량의 가수 분해물을 현탁 시킨 후 이를 여과하는 단계;

   산성 조건하에 수산화나트륨을 첨가하여 상기 가수 분해물을 용해시키고 균질 화시킨 후, 이를 정치시켜 얻어진 상청을 여과하여 회수하는 단계; 및

   세파덱스-지 겔로 충진된 컬럼에 분리된 상청 액을 가한 후 완충액으로 분리시켜 탈염 및 초산을 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라겐의 제조방법.
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