CN113774103A - 海鲷鱼胶原蛋白肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及活性物质提取技术领域，尤其涉及海鲷鱼胶原蛋白肽的制备方法。本发明以鲷鱼的鱼骨为原料，进过原料预处理、脱脂脱钙处理、脱脂脱钙处理、鱼骨胶原蛋白提取、脱腥、脱色处理和制备鲷鱼酸溶性胶原蛋白的工序，采用低温酸溶液提取法，获得鲷鱼小分子胶原蛋白肽，综合利用废弃的鱼骨资源，不仅能够减少环境污染，还可以明显提高鲷鱼加工的附加值，创造良好的经济与社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及活性物质提取技术领域，尤其涉及海鲷鱼胶原蛋白肽的制备方法。
背景技术
胶原蛋白是动物体内含量丰富的蛋白质，所有多细胞动物都含有胶原蛋白，胶原蛋白具有良好的生物相收容性、生物降解性以及弱抗原性，被广泛应用于皮革工业、制药业、生物医学以及食品工业等行业，如制备生物材料和人造皮肤、可食性或可生物降解的胶原膜，促进肌肉组织愈合的伤口敷料以及降解制备生物活性因子和保健食品等，近年来，我国水产养殖和加工产业得到迅猛发展，鱼类加工下脚料等为主要组成的产业副产品产量越来越大。研究表明，鱼加工下脚料，特别是鱼皮、鱼骨，富含胶原蛋白，是非常丰富的胶原蛋白潜在资源，胶原蛋白是细胞外基质的结构蛋白，呈纤维状，在水溶液中的溶解性较差，但易溶于酸性介质，因此在制备过程中经常使用低温酸溶液提取法。此外，研究表明，有机酸低温提取能够最大程度上保留胶原三螺旋结构及其生物活性。
重金属含量和PCB是化妆品的重要卫生指标,由于受环境的影响,生活在沿岸的鱼易受重金属和PCB污染,所以在暖海区域的深海鱼种鲷鱼更适合于用小分子胶原蛋白肽提取原料。鲷鱼属金目鲷目金目鲷科,是分布于暖海区域的深海鱼。研究表明,暖海性鱼类胶原蛋白比寒海性鱼类胶原蛋白的热变性温度高(热变性温度高说明该原料的稳定性强,不易在加工和使用过程中因高温而引起蛋白质发生变性,从而影响使用性能)，鲷鱼的加工主要以制作生鱼片为主，从而产生了大量的下脚料，主要包括鱼头、尾、骨、皮、鳞、内脏及其残留鱼肉，因此，本领域仍在寻求将这些部分回收利用的方案。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供海鲷鱼小分子胶原蛋白肽的制备方法。
本发明提供的海鲷鱼胶原蛋白肽的制备方法，其包括如下步骤：
步骤1：依次以NaOH溶液和水清洗海鲷鱼骨后，将鱼骨碎化制成鱼骨块；
步骤2：将鱼骨块以乙二胺四乙酸二钠盐溶液脱钙、再以正丁醇溶液脱脂，后，以乙酸溶液进行提取，制得提取液；
步骤3：提取液经正丁醇溶液萃取、活性炭脱色后，经盐析取沉淀以乙酸溶液溶解，获得蛋白溶液；
步骤4：所述蛋白溶液经透析后，经酶解制得鲷鱼胶原蛋白肽。
步骤1中：NaOH溶液的浓度为0.1mol/L，海鲷鱼骨与氢氧化钠溶液的料液比为1∶20；所述NaOH溶液进行清洗的条件为搅拌48h，期间每12h更换新鲜NaOH溶液；所述水清洗至中性。
步骤2中：所述乙二胺四乙酸二钠盐溶液中，乙二胺四乙酸二钠盐的浓度为0.5mol/L，pH值为pH7.5；所述鱼骨块与乙二胺四乙酸二钠盐溶液的料液比为1∶20；所述脱钙的条件为搅拌3天，期间每24h更换新鲜乙二胺四乙酸二钠盐溶液。
步骤2中：所述正丁醇溶液中正丁醇的体积分数为10％，所述鱼骨块与正丁醇溶液的料液比为1∶20；所述脱脂的条件为搅拌2天，期间每24h更换新鲜正丁醇溶液。
步骤2中：所述乙酸溶液中乙酸的浓度为0.5mol/L，pH值为2.6，所述鱼骨块与乙酸溶液的料液比为1∶40；所述提取的次数为2次，第一次提取的条件为为搅拌3天，第二次提取的条件为搅拌1天，提取后过滤取滤液，合并两次提取的滤液为提取液。
步骤3中：正丁醇溶液中正丁醇的体积分数为15％，所述正丁醇溶液与提取液的体积比为1∶20；所述萃取后，取水相并加入活性炭至活性炭质量分数为1％，50℃脱色0.6h；
所述脱色后，经离心取上清液，经0.9mol/LNaCl盐析，搅拌过夜后，离心分离沉淀；
所述沉淀以0.5mol/L乙酸溶液溶解，每g沉淀以40mL乙酸溶液溶解。
步骤4中：所述透析的透析袋的分子量为100～300000Da，透析液为去离子水，透析条件为4℃透析2d。
步骤4中所述酶解的包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，每种酶的添加量为碱性蛋白酶400U/mg、中性蛋白酶400U/mg、胰蛋白酶4000U/mg、木瓜蛋白酶400U/mg。
步骤4中所述酶解的条件包括：
依次进行中性蛋白酶、碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶、胰蛋白酶的酶解；其中，
碱性蛋白酶酶解的pH值为8.0,45℃酶解为9h；
木瓜蛋白酶酶解的pH值为8.0,45℃酶解为8h；
中性蛋白酶酶解的pH值为8.0,45℃酶解为6h；
胰蛋白酶酶解的pH值为6.5,45℃酶解为4h。
本发明所述制备方法制得的海鲷鱼胶原蛋白肽。
本发明以鲷鱼的鱼骨为原料，进过原料预处理、脱脂脱钙处理、脱脂脱钙处理、鱼骨胶原蛋白提取、脱腥、脱色处理和制备鲷鱼酸溶性胶原蛋白的工序，采用低温酸溶液提取法，获得鲷鱼小分子胶原蛋白肽，综合利用废弃的鱼骨资源，不仅能够减少环境污染，还可以明显提高鲷鱼加工的附加值，创造良好的经济与社会效益。
附图说明
图1为本发明中的方法流程图。
具体实施方式
本发明提供了海鲷鱼胶原蛋白肽的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
本发明所述的制备方法包括：
将鲷鱼骨置于0.1mol/L NaOH溶液中搅拌除去非胶原物质(2d，每隔12h换液)，清洗至中性，按1∶20加入0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐(pH7.5)搅拌进行脱钙处理(3d，每隔24h换液)，然后按料液比1∶20加入体积分数10％正丁醇溶液搅拌除去鱼骨中的脂肪(2d，每隔24h换液)，最后按1∶40加入0.5mol/LpH2.6乙酸溶液搅拌3d，提取鱼骨胶原蛋白，提取结束后，过滤，按料液比1∶40向残渣中加入0.5mol/L乙酸溶液，搅拌1d进行二次提取，两次滤液合并，合并的滤液进行脱腥、脱色处理，有机溶剂脱腥溶液为正丁醇溶液，滤液与正丁醇溶液体积比1∶20，正丁醇溶液体积分数为15％，脱色活性炭添加量为1.00％，脱腥、脱色温度为50℃，接着在4℃、13000×g离心1h，上清液用0.9mol/LNaCl盐析，搅拌过夜，4℃、13000×g离心15min，沉淀溶于0.5mol/L乙酸，转入透析袋用去离子水透析2d，制备鲷鱼酸溶性胶原蛋白，加入碱性蛋白酶(400U/mg)、中性蛋白酶(400U/mg)、胰蛋白酶(4000U/mg)和木瓜蛋白酶(400U/mg)制备鲷鱼鲷鱼小分子胶原蛋白肽。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：
Sp1:原料预处理：海鲷鱼的鱼骨，按鱼骨与氢氧化钠溶液比1∶20(m/V)，氢氧化钠溶液浓度为0.1mol/L，常温去除时间为48h，去除过程中不断搅拌，每隔12h更换氢氧化钠溶液，处理后通过清水清洗至中性，再将鱼骨进行破碎制成鱼骨块；
Sp2:脱脂脱钙处理：
2.1脱钙处理：鱼骨块与乙二胺四乙酸二钠盐溶质量比为1:20混合，乙二胺四乙酸二钠盐溶液浓度为0.5mol/L，PH值为7.5，常温处理时间为3d，去除过程中不断搅拌，每隔24h更换乙二胺四乙酸二钠盐溶液。
2.2脱脂处理：鱼骨块与正丁醇溶液质量比为1:20，正丁醇溶液体积分数为10％，常温处理时间为2d，去除过程中不断搅拌，每隔24h更换正丁醇溶液，正丁醇溶液脱脂肪
Sp3:鱼骨胶原蛋白提取：
将经脱脂脱钙后的鱼骨块置于pH值为2.6的0.5mol/L乙酸溶液(鱼骨块与乙酸溶液比质量比为1:20)中常温3d，分离滤液和鱼骨；
再将鱼骨块置于pH值为2.6的0.5mol/L乙酸溶液(鱼骨块与乙酸溶液质量比为1:20)中常温搅拌24h，分离滤液和鱼骨；
合并两次分离获得的滤液。
Sp4:脱腥、脱色处理：
4.1脱腥处理：对胶原蛋白肽的水解液用正丁醇萃取进行脱腥处理有机溶剂脱腥溶液为正丁醇溶液，提取液与正丁醇溶液体积比1∶20，正丁醇溶液体积分数为15％，
4.2脱色处理：向经脱腥处理后的液体中添加活性炭，添加量为1.00wt％，50℃，脱色处理40min。
处理后，经4℃、13000×g离心1h，分离上清液。Sp5:制备鲷鱼酸溶性胶原蛋白：将脱腥、脱色处理后的上层清液通过0.9mol/L氯化钠溶液进行盐析，搅拌过夜，之后4℃、13000×g离心15min，弃去上清液，使用0.5mol/L乙酸溶液溶解沉淀物，溶液转入透析袋的分子量为100～300000Da用去离子水透析2d后，进行冷冻干燥。
Sp6:制备鲷鱼胶原蛋白肽：加入蛋白酶制剂(碱性蛋白酶(400U/mg)、中性蛋白酶(400U/mg)、胰蛋白酶(4000U/mg)和木瓜蛋白酶(400U/mg))，制取鲷鱼胶原蛋白肽，将冻干的粉末与蒸馏水按照料液比1：2(mg/mL)配置成溶液，依次进行中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶酶解。碱性蛋白酶的酶解时间9h、木瓜蛋白酶的酶解时间8h，中性蛋白酶酶解时间为6h，胰蛋白酶酶解时间为4h；碱性蛋白酶的酶解PH值为8.0、木瓜蛋白酶的酶解PH值为6.0,中性蛋白酶酶解酶解PH值为6.7，胰蛋白酶酶解pH值为6.5。且中性蛋白酶、碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶的酶解温度均为45℃，胰蛋白酶酶解的温度为45℃。蛋白质酶解后，产生小分子肽。
经检测，所得鲷鱼胶原蛋白肽的分子量为1600道尔顿，收率为87％。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.海鲷鱼胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：依次以NaOH溶液和水清洗海鲷鱼骨后，将鱼骨碎化制成鱼骨块；
步骤2：将鱼骨块以乙二胺四乙酸二钠盐溶液脱钙、再以正丁醇溶液脱脂后，以乙酸溶液进行提取，制得提取液；
步骤3：提取液经正丁醇溶液萃取、活性炭脱色后，经盐析取沉淀以乙酸溶液溶解，获得蛋白溶液；
步骤4：所述蛋白溶液经透析后，经酶解制得鲷鱼胶原蛋白肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中：
NaOH溶液的浓度为0.1mol/L，海鲷鱼骨与氢氧化钠溶液的料液比为1∶20；所述NaOH溶液进行清洗的条件为搅拌48h，期间每12h更换新鲜NaOH溶液；所述水清洗至中性。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中：所述乙二胺四乙酸二钠盐溶液中，乙二胺四乙酸二钠盐的浓度为0.5mol/L，pH值为pH7.5；所述鱼骨块与乙二胺四乙酸二钠盐溶液的料液比为1∶20；所述脱钙的条件为搅拌3天，期间每24h更换新鲜乙二胺四乙酸二钠盐溶液。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中：所述正丁醇溶液中正丁醇的体积分数为10％，所述鱼骨块与正丁醇溶液的料液比为1∶20；所述脱脂的条件为搅拌2天，期间每24h更换新鲜正丁醇溶液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中：所述乙酸溶液中乙酸的浓度为0.5mol/L，pH值为2.6，所述鱼骨块与乙酸溶液的料液比为1∶40；所述提取的次数为2次，第一次提取的条件为为搅拌3天，第二次提取的条件为搅拌1天，提取后过滤取滤液，合并两次提取的滤液为提取液。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中：正丁醇溶液中正丁醇的体积分数为15％，所述正丁醇溶液与提取液的体积比为1∶20；所述萃取后，取水相并加入活性炭至活性炭质量分数为1％，50℃脱色0.6h；
所述脱色后，经离心取上清液，经0.9mol/L NaCl盐析，搅拌过夜后，离心分离沉淀；
所述沉淀以0.5mol/L乙酸溶液溶解，每g沉淀以40mL乙酸溶液溶解。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中：所述透析的透析袋的分子量为100～300000Da，透析液为去离子水，透析条件为4℃透析2d。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中所述酶解的包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，每种酶的添加量为碱性蛋白酶400U/mg、中性蛋白酶400U/mg、胰蛋白酶4000U/mg、木瓜蛋白酶400U/mg。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中所述酶解的条件包括：依次进行中性蛋白酶、碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶、胰蛋白酶的酶解；其中，
碱性蛋白酶酶解的pH值为8.0,45℃酶解为9h；
木瓜蛋白酶酶解的pH值为8.0,45℃酶解为8h；
中性蛋白酶酶解的pH值为8.0,45℃酶解为6h；
胰蛋白酶酶解的pH值为6.5,45℃酶解为4h。
10.权利要求1～9任一项所述的制备方法制得的海鲷鱼胶原蛋白肽。
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