CN102262161B - 水蛭素在特定条件下失活后检测凝血四项方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了水蛭素在特定条件下失活后检测凝血四项方面的应用，其中制备失活水蛭素的失活剂主要是番木瓜蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶或酶蛋白酶；水蛭素与番木瓜蛋白酶的重量分数比为1:1-1:5；水蛭素与枯草杆菌蛋白酶的重量分数比为为1:1-1：5；水蛭素与酶蛋白酶的重量分数比为1:1-1：5。本发明首次采用水蛭素失活后检测凝血四项，解决了单独使用水蛭素无法检测凝血四项的问题。能够解决传统抗凝剂枸橼酸钠添加不合适造成的PT时间的多少，造成误诊，延误病情，影响治疗等情况。
Description
技术领域
本发明属于医疗器械技术领域，特别是涉及水蛭素在特定条件下失活后检测凝血四项方面的应用。
背景技术
中华人民共和国《中国药典》2010年版，第一部记载“水蛭（HIRUDO）”，本品为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman或柳叶蚂蟥Whitmania wranulata Whitman的干燥全体，夏、秋二季捕捉，用沸水烫死，晒干或低湿干燥。炮制：水蛭洗净、切段、干燥。烫水蛭：取净水蛭段，照烫法用滑石粉浇至微鼓起。功能与主治：破血，逐瘀，通经。用于血瘀经闭，跌扑损伤。
国外医学输血及血液分册1993年第16卷第6期记载中国医学科学院血液研究所，郭娟综述 王荷碧 审校“重组水蛭素的研究进展”Haycraft于1884年发现医用水蛭提取物中有抗凝物质。50年代末，Markwardt首次分离出纯品，命名为水蛭素（Hirudin）,并知其为凝血酶特异抑制剂，是一种理想的抗凝、抗血栓制剂。80年代初得知其结构和氨基酸顺序。因天然水蛭素提取步骤繁琐，且饲养水蛭困难，水蛭来源匮乏，难于得到足够量的纯品，使研究与临床应用受到限制。近年来，基因工程技术的发展弥补了这一缺陷，利用化学合成、cDNA文库、PCR方法获得基因克隆，表达获得重组水蛭素，从而较深入地研究了水蛭素的药理学、药效学和毒性等，大量动物实验及临床试用，加快了水蛭素应用于临床的进程。
水蛭素的结构：天然水蛭素是不含多糖，由65或66个氨基酸残基组成的单链蛋白，分子量约7，000，富含二羧基氨基酸，无Arg、Met和Trp,有三个分子内二硫键位于肽链N-端，对分子构型起稳定作用；C-端有较多的酸性氨基酸残基，且有一硫酸化Tyr;肽链中部有一个由Pro-Lys47-Pro组成的特殊结构，其在水蛭素与凝血酶相互作用中起一定的作用。
水蛭素在干燥状态下稳定，室温下可稳定保存6个月以上，80℃下15分钟不被破坏。pH升高(或下降)则稳定性下降。在0.1mol/L NaOH或0.1mol/L HCl可稳定存在15分钟。胰蛋白酶和α-糜蛋白酶不破坏水蛭素的活性。番木瓜蛋白酶、酶蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶可使之失活。水蛭素溶于水和 0.9% NaCl溶液。不溶于乙醇、丙酮。
水蛭素抗凝原理为（国外医学输血及血液分册1993年第16卷第6期记载中国医学科学院血液研究所，郭娟综述 王荷碧 审校“重组水蛭素的研究进展”）重组水蛭素与ɑ-凝血酶形成稳定特异的复合物，此时凝血酶全部蛋白酶水解功能被封闭，故水蛭素不仅能防止纤维蛋白原的凝固作用，而且能阻断凝血酶催化的止血反应，诸如因子Ⅴ、Ⅷ及ⅩⅢ的激活，凝血酶诱发的血小板反应，防止了凝血酶原活化的正反馈而导致的凝血酶生成。同时水蛭素不干扰凝血因子的生物合成，对抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）亦无影响。
依水蛭素活性在血中的浓度高低比例，能在需要的时间内完全抑制血液凝固作用。凝固作用的变化如凝血酶时间（TT）、部分凝血活酶时间（APTT）及凝血酶原时间（PT），随水蛭素不同浓度而变化。
凝血酶是一种多样细胞活性的促效剂，与水蛭素复合后，它便丧失了对这些细胞的非止血效应。
水蛭素与凝血酶的特异性结合分二个阶段。首先，水蛭素C末端的酸性氨基酸与凝血酶的碱性部位结合，封闭凝血酶的底物识别位点。其次，该结合使凝血酶构型发生轻微变化，使水蛭素N端与凝血酶的活性中心结合，从而抑制凝血酶的催化活性。水蛭素抗凝原理是抑制凝血四项的产生，也就是抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白从而达到抗凝效果，但在抗凝过程中不破坏凝血因子（水蛭素为抑制凝血因子的形成）如形成一定条件下水蛭素可以被分解，那么血液中的凝血因子被完整释放后不会影响检测凝血四项的结果。
凝血四项属于检验科临检检查项目之一，归属于血栓性疾病检查。为手术前必查项目、血栓前检查项目及监控临床口服抗凝药物患者。现有检测凝血四项的方法使用的抗凝剂抗凝原理：由于枸橼酸钠的抗凝效果较弱，故如需作用于阻止血液凝固，需较大剂量。为采血管内加入了定量液态的枸橼酸钠抗凝剂缓冲液。抗凝剂与额定采血量按1:9的比例加入，用于凝血机制项目的检查（如PT、APTT）。其原理为：抗凝剂与血液中的钙结合，形成可溶性钙螯合物而使血液不凝固。因此凝血四项测定过程中必须加入适量的钙使血液恢复凝固过程，抗凝时去钙和实验时的复钙决定了抗凝比例实质是抗凝剂与血浆的比例，而不是与全血的比例。推荐的血凝测定要求的抗凝剂浓度是3.2%或3.8%，相当于0.109或0.129mol/L。对于血液凝固实验来讲，如果血液比例过低，APTT时间会延长，凝血酶原时间（PT）结果亦会显著改变，因此抗凝剂与额定采血量的比例是否准确，是决定该类产品品质的重要标准。
而上述对检测凝血四项传统方法具有缺陷，其表现为：1、抗凝剂对结果的影响:实验证明同一个患者如果抗凝剂量加入不合适，凝血酶原时间（PT）、分别为11.7秒和18.7秒，这对临床诊断和治疗是有很大影响的,主要反映外源性凝血系统状况，其中INR常用于监测口服抗凝剂。延长见于先天性凝血因子ⅡⅤⅦⅩ缺乏及纤维蛋白原缺乏，后天凝血因子缺乏主要见于维生素K缺乏、严重的肝脏疾病、纤溶亢进、DIC、口服抗凝剂等；缩短见于血液高凝状态和血栓性疾病等。2、采用传统方法的实验手册上载明，做凝血实验标本中，抗凝剂的比例是1份量抗凝剂加9份量的血液，但这只是表面现象，实际内涵是1份量抗凝剂作用于9份血细胞比积正常标本内的血浆而言。换言之，比积血液经抗凝处理后，通过离心可以把血液分为两大部分，血浆和血细胞。如果将血液放在一个特殊的试管中(温氏管)按规定的时间和速度进行离心，最终使得红细胞完全压实在试管的底端，红细胞之间互相接触密切，尽可能排除所有血浆，此时血浆会全部被挤出到血细胞的上面，这时红细胞所占全血的百分比就是我们所要得到的红细胞压积，即压实的红细胞所占的体积数(或百分比)，也叫红细胞比积或红细胞比容。测定红细胞压积还可用毛细管法和血细胞计数仪法测定。红细胞压积通常缩写为HCT或Ht，测定单位现在多用每升血液中红细胞占有多少升来表达(L/L)。红细胞压积的测定有助于了解红细胞的增多与减少，当各种原因所致的红细胞绝对值增高时，红细胞压积也会有相应的增加。血液浓缩时红细胞压积可达50%以上，临床上常用于了解脱水病人的血液浓缩程度，作为计算补液量的参考。红细胞压积降低与各种贫血有关，因红细胞体积大小的不同，红细胞压积的改变并不与红细胞数量平行，需同时测定红细胞数量和血红蛋白浓度，并用于计算红细胞各项平均值才有参考价值。决定了血浆量，而血浆量决定抗凝剂的用量。研究表明，同一个人如果比积为46%（正常）、10%（贫血）、80%（红细胞增多），同样都是一种抗凝剂1:9量抗凝，活化部分凝血活酶时间（APTT）的结果分别为33秒、24秒、60秒,主要反映内源性凝血系统状况，常用于监测肝素用量。增高见于血浆因子Ⅷ、因子Ⅸ和因子XI水平减低：如血友病A、血友病B及因子XI缺乏症；降低见于高凝状态：如促凝物质进入血液及凝血因子的活性增高等情况。可见只在抗凝剂应用的小问题上就会给临床造成检测结果的偏差,会影响医生对病情的判断，造成误诊，遇到这种情况必须进行校正抗凝剂用量。通过调整抗凝剂用量来达到控制结果准确性的目的详见图1。3、临床检验要求当做血液凝血四项时患者红细胞比容（Hct）小于0.2或大于0.5时，抗凝剂的用量应做适当调整。它所指的是传统109mmol/L枸橼酸钠溶液做抗凝剂0.2ml，采血1.8ml，调整抗凝剂的量ml=(100-Hct)×血液ml×0.00185。这样患者必须抽1份血常规（EDTA抗凝剂）测定值红细胞比容小于0.2或大于0.5时,再计算出此患者做凝血四项所需要的枸橼酸钠抗凝剂的量后，再抽1份血检测。这样不但给患者造成二次抽血的痛苦，也给繁忙的非专科医院带来困难，对急诊抢救是不利的，同时也证明传统方法用枸橼酸钠做抗凝剂，具有抗凝力弱、抗凝剂体积大等重要缺陷。
丛教授阐述（丛玉隆，解放军总医院主任医师，教授，博士生导师，我国著名的实验诊断学专家《定向点金-临床实验室》2008/4号刊载的文章名为ISO15189与分析前质量管理的文章节选)临床通常使用以下的两种方法确定在收集高比积血标本时所用枸橼酸盐的体积：
⑴使用公式计算用量：抗凝剂用量=0.00185×血量（ml）×（100-病人红细胞压积）； ⑵根据Hct变化，抗凝剂用量按下图2所示加入。
这些是特别值得注意的，贫血病人以及一切低HCT病人的标本，如果按平常的1：9比例抗凝，实际上血浆和抗凝剂和血浆的比例缩小了，抗凝剂受到了稀释，得出的结果是不可靠的，在检测前需进行抗凝剂校正。
另外由于水蛭素所具有的独特的抗凝原理所限制，其与凝血酶的特异性结合，抑制纤维蛋白原凝固，还会阻断凝血酶催化的止血反应。基于以上问题，水蛭素无法用于检测凝血四项，血液中添加单独水蛭素抗凝剂后检测的数据全部为0。
| 英文名称 | 中文名称 | 结果 | 参考范围 | 单位 |
| PT | 凝血酶原时间 | 106 | 70-120 | % |
| PT-INR | PT-INR | 0 | 0.8-1.5 | |
| PT-sec | 血浆凝血酶原时间 | 0 | 11-14.5 | sec |
| APTT | 活化部分凝血活酶时间 | 0 | 28-44 | sec |
| FIB | 血浆纤维蛋白原 | 0 | 2-4 | g/l |
| TT | 血浆凝血酶时间 | 0 | 14-21 | sec |
具体数据如上所示。
发明内容
本发明首次公开了水蛭素在特定条件下失活后检测凝血四项方面的应用。其中制备失活水蛭素的失活剂是番木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶或酶蛋白酶；水蛭素与番木瓜蛋白酶的重量份数比为1:1-1：5；水蛭素与枯草杆菌蛋白酶的重量份数比为为1:1-1：5，水蛭素与酶蛋白酶的重量份数比为1:1-1：5。
本发明的具体方案如下：
首先，采用水蛭素失活主要的方法有：（1）二硫键被氧化（2）水蛭素C-端被破坏（3）80℃高温灭活等等方法，本发明所采用的失活水蛭素可以是上述（1）-（3）任何一种方法制备失活水蛭素。优选本发明所使用的水蛭素的失活剂是“番木瓜蛋白酶”“枯草杆菌蛋白酶”或“酶蛋白酶”。
其次，水蛭素与番木瓜蛋白酶的重量份数比可以为1:1，1:2,1:3，1:4，1:5等；水蛭素与枯草杆菌蛋白酶的重量份数比可以为1:1，1:2,1:3，1:4，1:5等；水蛭素与酶蛋白酶的重量份数比可以为1:1，1:2,1:3，1:4，1:5等。根据添加抗凝剂的种类、比例不同水蛭素加入失活剂后，需静置1-5分钟，使水蛭素与失活剂发生反应。并用《中国药典》2010年版中药部分77-78页记载—水蛭素的检测方法，检测水蛭素按上述比例加入番木瓜蛋白酶、酶蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶后，是否失活，检测值为零，即水蛭素失活。最后，水蛭素+失活剂的操作方法为：
（1）使用含有水蛭素作为抗凝剂的采血管或者采血针，抽取患者血液5ml（也可根据临床实际需要确定抽血量），先检测除凝血四项以外的其他检测项目例如：血常规、生化检测、血糖检测等等（顺序不限，或根据实际情况确定先后顺序），最后检测凝血四项。
（2）将检测凝血四项的设备就绪，做好相关辅助工作后，将含有失活剂的溶液迅速倒入水蛭素作为抗凝剂的采血管或集血样瓶内，并在1-5分钟内上机测试凝血四项结果（注：如实际情况无法做到1-5分钟内上机测试，需加入一定量的抗凝剂以推迟血液凝固）。
本发明中出现的Hct指的是：红细胞比容是指一定容积全血中红细胞所占的百分比。又称红细胞比容（比积／压积)对抗凝剂用量血浆的影响。
APTT：主要反映内源性凝血系统状况，常用于监测肝素用量。增高见于血浆因子Ⅷ、因子Ⅸ和因子XI水平减低：如血友病A、血友病B及因子XI缺乏症；降低见于高凝状态：如促凝物质进入血液及凝血因子的活性增高等情况；
PT：主要反映外源性凝血系统状况，其中INR常用于监测口服抗凝剂。延长见于先天性凝血因子ⅡⅤⅦⅩ缺乏及纤维蛋白原缺乏，后天凝血因子缺乏主要见于维生素K缺乏、严重的肝脏疾病、纤溶亢进、DIC、口服抗凝剂等；缩短见于血液高凝状态和血栓性疾病等；
FIB：主要反映纤维蛋白原的含量。增高见于急性心肌梗死 减低见于DIC消耗性低凝溶解期、原发性纤溶症、重症肝炎、肝硬化；
TT：主要反映纤维蛋白原转为纤维蛋白的时间。增高见于DIC纤溶亢进期，低（无）纤维蛋白原血症，异常血红蛋白血症，血中纤维蛋白（原）降解产物（FDPs）增高；降低无临床意义。
本发明公开的失活水蛭素在检测凝血四项方面的应用所具有的积极效果在于：
（1）本发明解决了单独使用水蛭素无法检测凝血四项的问题。能够解决传统抗凝剂枸橼酸钠添加不合适造成的PT时间的多少，造成误诊，延误病情，影响治疗。
（2）本发明具有杜绝了使用枸橼酸钠所带来的弊病，也减轻了由于使用枸橼酸钠与血细胞比积的比例问题，使得临床检验人员无需再进行检测数据的校准和测量Hct值。也从根本上解决了由于抗凝剂添加不当所引起的误诊、错诊，延误患者的治疗时间，拖延病情，同时，也避免特殊患者还需要再抽取一次血液来检测血常规（EDTA抗凝剂）测定值红细胞比容。另外，有关资料统计，约有20%的非患病者是由于错误的诊断，错误的用药，被人为的“检查”出疾病，这种情况也能够从根本上减少发生的几率。同时解决了单独使用水蛭素无法检测凝血四项的问题，使得水蛭素作为抗凝剂可以检测目前已知的全部血液检测项目，真正做到只抽取患者一管（约5ml）血液，即可作出全部的血液学临床检测。
（3）临床检测上解决了1、诊断期：将由于抗凝剂本身的不足所带来的检测误差或者错误所导致的误诊风险降至最低。2、治疗期：由于能够快速的、精确的检测医生所需血液的各项指标，医生能够准确判断患者使用治疗药物的剂量、根据使用效果增减药物剂量。3、对于检验人员：大量减少检验人员的工作量，检验人员无需再顾虑枸橼酸钠与血细胞比积的比例问题是否影响检测数据，也无需再反复验证检测数据是否符合患者的实际情况，更不需要再次计算患者的Hct，利用抗凝剂修正公式再次计算。4、减少患者痛苦和医疗开支、减少医疗垃圾等。
（4）采用本发明的方法对血细胞比积升高或降低者有更大的检测意义。比如做PT检测：Rbc、Hct小于0.2或大于0.5时不与纠正的话,一个标本两种测定值:11.7s、18.7s（正常11-14、5s）：
如按上述错误的数据报告给临床医生，无论医生接受哪个数据都会给患者带来严重后果。
附图说明
图1为Hct对抗凝剂用血量的影响；
图2为根据Hct变化，抗凝剂用量校正图。
具体实施方式
为了简单和清楚的目的，下文恰当的省略了公知技术的描述，以免那些不必要的细节影响对本技术方案的描述。以下结合较佳实施例，对本发明做进一步的描述。其所述的番木瓜蛋白酶、酶蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶均有市售。
实验地点：医院检验科
实验用血：随机抽取，选择年龄接近患者
实验设备：法国STAGO COMPACT全自动凝血分析仪
实施例1
实验者为35岁健康男性。2、此项检测为单独使用水蛭素作为抗凝剂与水蛭素+失活剂后所测凝血四项是的实验数据的对比。该数据能够验证单独使用水蛭素作为抗凝剂检测的问题和对比使用水蛭素+失活剂得出的实验数据。
水蛭素未添加失活剂测定的凝血四项值
| 英文名称 | 中文名称 | 结果 | 参考范围 | 单位 |
| PT | 凝血酶原时间 | 106 | 70-120 | % |
| PT-INR | PT-INR | 0 | 0.8-1.5 | |
| PT-sec | 血浆凝血酶原时间 | 0 | 11-14.5 | sec |
| APTT | 活化部分凝血活酶时间 | 0 | 28-44 | sec |
| FIB | 血浆纤维蛋白原 | 0 | 2-4 | g/l |
| TT | 血浆凝血酶时间 | 0 | 14-21 | sec |
(2)水蛭素添加失活剂番木瓜蛋白酶测定的凝血四项值
| 英文名称 | 中文名称 | 结果 | 参考范围 | 单位 |
| PT | 凝血酶原时间 | 106 | 70-120 | % |
| PT-INR | PT-INR | 0.97 | 0.8-1.5 | |
| PT-sec | 血浆凝血酶原时间 | 13.0 | 11-14.5 | sec |
| APTT | 活化部分凝血活酶时间 | 39.2 | 28-44 | sec |
| FIB | 血浆纤维蛋白原 | 3.37 | 2-4 | g/l |
| TT | 血浆凝血酶时间 | 16.5 | 14-21 | sec |
(3)水蛭素添加失活剂酶蛋白酶测定的凝血四项值
| 英文名称 | 中文名称 | 结果 | 参考范围 | 单位 |
| PT | 凝血酶原时间 | 106 | 70-120 | % |
| PT-INR | PT-INR | 0.97 | 0.8-1.5 | |
| PT-sec | 血浆凝血酶原时间 | 13.1 | 11-14.5 | sec |
| APTT | 活化部分凝血活酶时间 | 39.2 | 28-44 | sec |
| FIB | 血浆纤维蛋白原 | 3.38 | 2-4 | g/l |
| TT | 血浆凝血酶时间 | 16.4 | 14-21 | sec |
(4)水蛭素添加失活剂枯草杆菌蛋白酶测定的凝血四项值
| 英文名称 | 中文名称 | 结果 | 参考范围 | 单位 |
| PT | 凝血酶原时间 | 106 | 70-120 | % |
| PT-INR | PT-INR | 0.97 | 0.8-1.5 | |
| PT-sec | 血浆凝血酶原时间 | 13.1 | 11-14.5 | sec |
| APTT | 活化部分凝血活酶时间 | 39.5 | 28-44 | sec |
| FIB | 血浆纤维蛋白原 | 3.32 | 2-4 | g/l |
| TT | 血浆凝血酶时间 | 16.4 | 14-21 | sec |
注：上述“INR”为国际标准化比率。用凝血酶所测得的参比血浆与正常血浆的PT比值和所用试剂标出的ISI（国际敏感度指数）值计算出INR，使不同的凝血酶试剂测得的结果具有可比性。
实施例2
实验者为35岁健康女性。(1)使用常规剂量的枸橼酸钠测定的数值。 （2）、（3）、（4）使用水蛭素+三种失活剂与（1）的对比实验数据：
（1）正常使用枸橼酸钠作为抗凝剂测定的凝血四项值
| 英文名称 | 中文名称 | 结果 | 参考范围 | 单位 |
| PT | 凝血酶原时间 | 106 | 70-120 | % |
| PT-INR | PT-INR | 1.1 | 0.8-1.5 | |
| PT-sec | 血浆凝血酶原时间 | 12.7 | 11-14.5 | sec |
| APTT | 活化部分凝血活酶时间 | 38.6 | 28-44 | sec |
| FIB | 血浆纤维蛋白原 | 3.26 | 2-4 | g/l |
| TT | 血浆凝血酶时间 | 17.5 | 14-21 | sec |
（2）水蛭素添加失活剂番木瓜蛋白酶测定的凝血四项值
| 英文名称 | 中文名称 | 结果 | 参考范围 | 单位 |
| PT | 凝血酶原时间 | 106 | 70-120 | % |
| PT-INR | PT-INR | 1.1 | 0.8-1.5 | |
| PT-sec | 血浆凝血酶原时间 | 12.3 | 11-14.5 | sec |
| APTT | 活化部分凝血活酶时间 | 37.9 | 28-44 | sec |
| FIB | 血浆纤维蛋白原 | 3.19 | 2-4 | g/l |
| TT | 血浆凝血酶时间 | 17.4 | 14-21 | sec |
（3）水蛭素添加失活剂酶蛋白酶测定的凝血四项值
| 英文名称 | 中文名称 | 结果 | 参考范围 | 单位 |
| PT | 凝血酶原时间 | 106 | 70-120 | % |
| PT-INR | PT-INR | 1.1 | 0.8-1.5 | |
| PT-sec | 血浆凝血酶原时间 | 12.5 | 11-14.5 | sec |
| APTT | 活化部分凝血活酶时间 | 37.6 | 28-44 | sec |
| FIB | 血浆纤维蛋白原 | 3.20 | 2-4 | g/l |
| TT | 血浆凝血酶时间 | 17.6 | 14-21 | sec |
（4）水蛭素添加失活剂枯草杆菌蛋白酶测定的凝血四项值
| 英文名称 | 中文名称 | 结果 | 参考范围 | 单位 |
| PT | 凝血酶原时间 | 106 | 70-120 | % |
| PT-INR | PT-INR | 1.1 | 0.8-1.5 | |
| PT-sec | 血浆凝血酶原时间 | 12.3 | 11-14.5 | sec |
| APTT | 活化部分凝血活酶时间 | 37.8 | 28-44 | sec |
| FIB | 血浆纤维蛋白原 | 3.21 | 2-4 | g/l |
| TT | 血浆凝血酶时间 | 17.6 | 14-21 | sec |
实施例3
实验者为56岁男性已经确诊患有脑血栓病，（1）为使用常规剂量的枸橼酸钠测定的数值，其结果不准确，容易造成误诊（2）检验人员确定Hct值后，修正了枸橼酸钠添加量后测定的正确数值（3）水蛭素添加失活剂番木瓜蛋白酶测定的凝血四项值（4）水蛭素添加失活剂酶蛋白酶测定的凝血四项值（5）水蛭素添加失活剂枯草杆菌蛋白酶测定的凝血四项值：
（1）常规剂量的枸橼酸钠测定的数值
| 英文名称 | 中文名称 | 结果 | 参考范围 | 单位 |
| PT | 凝血酶原时间 | 106 | 70-120 | % |
| PT-INR | PT-INR | 1.0 | 0.8-1.5 | |
| PT-sec | 血浆凝血酶原时间 | 12.0 | 11-14.5 | sec |
| APTT | 活化部分凝血活酶时间 | 28.1 | 28-44 | sec |
| FIB | 血浆纤维蛋白原 | 2.90 | 2-4 | g/l |
| TT | 血浆凝血酶时间 | 16.5 | 14-21 | sec |
说明：此结果在低值临界点，医生接到该报告后，医生可能认为基本正常或做进一步观察处理。
（2）修正枸橼酸钠添加量后测定的数值
| 英文名称 | 中文名称 | 结果 | 参考范围 | 单位 |
| PT | 凝血酶原时间 | 106 | 70-120 | % |
| PT-INR | PT-INR | 1.0 | 0.8-1.5 | |
| PT-sec | 血浆凝血酶原时间 | 8.0 | 11-14.5 | sec |
| APTT | 活化部分凝血活酶时间 | 19.5 | 28-44 | sec |
| FIB | 血浆纤维蛋白原 | 2.9 | 2-4 | g/l |
| TT | 血浆凝血酶时间 | 16.0 | 14-21 | sec |
说明：此结果表明患者血管内处于凝血状态（血栓状态），临床医生需制定治疗方案，对患者用药。
（3）水蛭素添加失活剂番木瓜蛋白酶测定的凝血四项值
| 英文名称 | 中文名称 | 结果 | 参考范围 | 单位 |
| PT | 凝血酶原时间 | 106 | 70-120 | % |
| PT-INR | PT-INR | 1.0 | 0.8-1.5 | |
| PT-sec | 血浆凝血酶原时间 | 9.5 | 11-14.5 | sec |
| APTT | 活化部分凝血活酶时间 | 23.6 | 28-44 | sec |
| FIB | 血浆纤维蛋白原 | 3.20 | 2-4 | g/l |
| TT | 血浆凝血酶时间 | 16.6 | 14-21 | sec |
（4）水蛭素添加失活剂酶蛋白酶测定的凝血四项值
| 英文名称 | 中文名称 | 结果 | 参考范围 | 单位 |
| PT | 凝血酶原时间 | 106 | 70-120 | % |
| PT-INR | PT-INR | 1.0 | 0.8-1.5 | |
| PT-sec | 血浆凝血酶原时间 | 9.3 | 11-14.5 | sec |
| APTT | 活化部分凝血活酶时间 | 22.1 | 28-44 | sec |
| FIB | 血浆纤维蛋白原 | 3.10 | 2-4 | g/l |
| TT | 血浆凝血酶时间 | 16.3 | 14-21 | sec |
（5）水蛭素添加失活剂枯草杆菌蛋白酶测定的凝血四项值
| 英文名称 | 中文名称 | 结果 | 参考范围 | 单位 |
| PT | 凝血酶原时间 | 106 | 70-120 | % |
| PT-INR | PT-INR | 1.0 | 0.8-1.5 | |
| PT-sec | 血浆凝血酶原时间 | 9.0 | 11-14.5 | sec |
| APTT | 活化部分凝血活酶时间 | 20.6 | 28-44 | sec |
| FIB | 血浆纤维蛋白原 | 3.0 | 2-4 | g/l |
| TT | 血浆凝血酶时间 | 16.1 | 14-21 | sec |
注：临床实验数据，通常会出现一定的波动，该波动范围通常极小，此数据可以被接受。
结论：
1、通过上述3个实验数据，可以得到结论，水蛭素+番木瓜蛋白酶、酶蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶失活剂使用作为检测凝血四项的方法是有效的。
2、水蛭素+番木瓜蛋白酶、酶蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶失活剂联合使用作为检测凝血四项可以杜绝因为抗凝剂添加量不准确导致的检测数据错误，从而直接影响临床诊断，本应通过早期发现、治疗的病症，由于检测数据错误，导致的治疗方案南辕北辙；掩盖、延误真实病情；增加患者痛苦；增加国家医保负担；加剧医患矛盾关系等问题，还可以大幅减少检验人员的工作量。
3、通过水蛭素+失活剂的新方法，是补充现有水蛭素用于临床检测项目中所出现的问题，使水蛭素能够将目前临床检测血液的全部项目实现一管血液检测的最终目标，既提高效率又节省人力、物力，是目前为止最适合临床需要的检测方案。
实施例4
水蛭素与番木瓜蛋白酶按1:2的重量比混合，静置3分钟，使水蛭素与失活剂发生反应。并用《中国药典》2010年版中药部分77-78页记载—水蛭素的检测方法，检测水蛭素是否失活，检测值为零，即水蛭素失活。
实施例5
水蛭素与枯草杆菌蛋白酶按1:4的重量比混合，静置5分钟，使水蛭素与失活剂发生反应。并用《中国药典》2010年版中药部分77-78页记载—水蛭素的检测方法，检测水蛭素是否失活，检测值为零，即水蛭素失活。
实施例6
水蛭素与酶蛋白酶按1:1的重量比混合，静置2分钟，使水蛭素与失活剂发生反应。并用《中国药典》2010年版中药部分77-78页记载—水蛭素的检测方法，检测水蛭素是否失活，检测值为零，即水蛭素失活。
Claims (2)
1.水蛭素在特定条件下失活后检测凝血四项方面的应用；其中制备失活水蛭素的失活剂是番木瓜蛋白酶；所述在特定条件下指的是：水蛭素与番木瓜蛋白酶按1:2的重量比混合，静置3分钟，使水蛭素与失活剂发生反应。
2.水蛭素在特定条件下失活后检测凝血四项方面的应用；其中制备失活水蛭素的失活剂是枯草杆菌蛋白酶；所述在特定条件下指的是：水蛭素与枯草杆菌蛋白酶按1:4的重量比混合，静置5分钟，使水蛭素与失活剂发生反应。
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