CN104569391B - 一种草鱼出血病病毒抗体elisa检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种草鱼出血病病毒抗体elisa检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种草鱼出血病病毒抗体ELISA检测试剂盒，属于兽用生物制品技术领域。本发明从胎牛血清中分离分子量小于30～100K的蛋白质、氨基酸等营养物质培养繁殖草鱼出血病病毒，繁殖后对草鱼出血病病毒采用孔径为30～100K的滤膜进行超滤，然后经过分子筛层析、阴离子交换层析、超滤进行进一步的纯化，获得高纯度的草鱼出血病病毒；进一步采用分子量大小为30～100K的酶解明胶蛋白作为ELISA板的封闭液封闭草鱼出血病病毒等步骤制备了诊断草鱼出血病病毒抗体的ELISA试剂盒。该试剂盒中ELISA板包被的草鱼出血病病毒纯度高，检测更灵敏；经过酶解胶原蛋白封闭、戊二醛固定、干燥后有效延长保存期。

Description

一种草鱼出血病病毒抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种草鱼出血病病毒抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
草鱼是我国淡水养鱼的主要品种，其产量约占淡水养殖总产量的20％。草鱼出血病是鱼种培育阶段一种流行地区广泛、流行季节长、发病率高、死亡率高、危害性大，是危害草鱼最为严重的病毒性疾病，造成重大的经济损失。目前，没有治疗草鱼出血病的特效药物，主要通过疫苗、养殖环境等方面控制草鱼出血病疫情的发生。在评价疫苗效果方面，草鱼出血病疫苗免疫鱼产生的抗体效价是重要的指标。目前，市场上没有关于检测草鱼出血病病毒抗体的ELISA试剂盒。
本发明主要根据草鱼出血病病毒繁殖和其产生抗体的特征，专门制备了相应检测抗体的ELISA试剂盒。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种草鱼出血病病毒抗体ELISA检测试剂盒，该试剂盒中ELISA板包被的草鱼出血病病毒纯度高，检测更灵敏；经过酶解胶原蛋白封闭、戊二醛固定、干燥后有效延长保存期。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种草鱼出血病病毒抗体ELISA检测试剂盒，其包括鼠抗兔IgG的酶标记物、包被有草鱼出血病病毒的ELISA板。
上述的ELISA检测试剂盒还包括标准血清、洗涤液、TMB底物显色液、终止液。
本发明还提供了上述草鱼出血病病毒抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法，其包括以下几个步骤：
1)ELISA板包被抗原的制备：采用CIK细胞接种草鱼出血病病毒获得病毒悬浮液；对病毒悬浮液进行离心、超滤浓缩后得到浓缩液，将浓缩液依次经过分子筛层析、阴离子交换层析、超滤浓缩后获得精纯病毒液；
2)包被液的制备：包被液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液，该包被液的pH为9～9.8；
3)洗涤液的制备：洗涤液为0.15mol/L含吐温-20的磷酸盐缓冲液，该洗涤液的pH为7.4，吐温-20的体积浓度为0.05％；
4)封闭液的制备：在上述洗涤液中加入50～500μg/ml的酶解胶原蛋白，即得封闭液；
5)ELISA板的制备：将步骤1)制得的精纯病毒液加入到包被液中进行稀释至浓度为0.5～10μg/ml的病毒蛋白稀释液，将病毒蛋白稀释液加入到ELISA板的每孔中，2～8℃孵育过夜；然后使用洗涤液洗涤，接着向ELISA板每孔中加入100μl封闭液后置于2～8℃冰箱中孵育过夜；再使用洗涤液洗涤后，加入0.3ml含有浓度为0.5～2％的戊二醛的洗涤液在2～8℃下孵育过夜；使用洗涤液洗涤后在37℃下干燥12～24h，干燥后使用膜封闭ELISA板，37℃保存。
具体地，在上述的步骤1)中采用CIK细胞接种草鱼出血病病毒具体包括以下步骤：
a、在无菌条件下采用孔径为10～100K的超滤膜对胎牛血清进行超滤，收集滤出液，得到营养液；较佳的超滤膜孔径为30K；
b、采用M199培养基培养CIK细胞，长满单层后加入胰蛋白酶进行消化，然后使用移液管反复轻轻吹打成单细胞悬浮液，在25℃下按照体积比1:3接种传代培养；
c、待CIK细胞生长至单层致密后接种0.03MOI的草鱼出血病病毒，加入步骤a所制得的营养液后25℃下培养4～6天后获得病毒悬浮液。
具体地，在上述的步骤1)中所述的离心是将病毒悬浮液在4000～6000r/min的转速下进行离心，离心时间为20～60min，然后收集上清液。其中，较佳的方案中，离心转速为4500～6000r/min，离心时间为30～60min。
将上述离心步骤后得到的上清液采用孔径为10～300K的超滤膜进行超滤，收集非滤出液，得到浓缩液。较佳的方案中超滤膜的孔径为10～100K。
具体地，在上述的步骤1)中的分子筛层析采用填料为SuperdexTM200、填料高度为20～80cm的层析柱；上样前用PH为7.2的0.01mol/L磷酸盐缓冲液平衡层析柱，然后将体积为填料体积的5～20％的浓缩液上样至层析柱中，使用PH为7.2的0.01mol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集第一洗脱峰样品，得到初纯液。
具体地，在上述的步骤1)中的阴离子交换层析采用填料为CellufineSulfate的层析柱；上样前用PH为7.2的0.01mol/L磷酸盐缓冲液平衡层析柱，然后将初纯液上样至层析柱中，使用0.5mol/LNaCl溶液进行梯度洗脱，收集第二洗脱峰样品，得到精纯液。
将经阴离子交换层析得到的精纯液采用孔径为10～300K的超滤膜进行超滤，收集非滤出液，得到精纯病毒液。较佳的方案中，超滤膜的孔径为10～100K。
在上述步骤4)中，封闭液的制备具体包括以下步骤：
A、在5～10g明胶中加入200ml用超纯水配制的PBS溶液，完全溶解后进行湿热高压灭菌，温度为121℃、灭菌时间为20min；
B、灭菌结束后自然冷却至常温，加入0.25％胰酶溶液，37℃下消化8-24h；重复该步骤1-3次后得到胰酶消化液；
C、使用孔径为100K的超滤膜对胰酶消化液进行超滤，收集滤出液；然后使用孔径为30K的超滤膜对上述滤出液进行超滤，收集非超滤液，得到酶解胶原蛋白；
D、将上述酶解胶原蛋白以50～500μg/ml的量加入到步骤3)所述洗涤液中，即得封闭液。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明通过采用胎牛血清中30KDa以下的小分子营养物质培养、收获草鱼出血病病毒，然后经过超滤、分子筛层析、阴离子交换层析等步骤纯化，获得纯度非常高的病毒，其病毒滴度(TCID50)大于107 . 5/0.1ml时，蛋白含量小于100μg/ml，使得本发明所述的试剂盒检测草鱼出血病病毒抗体更加灵敏精准；其中，超滤膜超滤是为了去除小于超滤膜孔径的蛋白质，同时具有浓缩的作用；而分子筛层析去除的是与草鱼出血病病毒在层析过程中能够很好分离开的蛋白质；而阴离子交换层析去除的是与草鱼呼肠孤病毒带负电荷差异较大的蛋白质。
2、本发明通过对包被有高纯度的草鱼出血病病毒的ELISA板采用分子量为30～100KDa酶解胶原蛋白进行封闭、并采用0.5-2％的戊二醛进行固定、干燥，能够有效延长试剂盒的保存期，可在37℃下保存2个月。
3、本发明所述的试剂盒的制备方法操作简单易行。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为本发明所述的浓缩液经过分子筛层析的分离效果图；
图2为本发明所述的初纯液经过阴离子交换层析的分离效果图。
具体实施方式
一种草鱼出血病病毒抗体ELISA检测试剂盒，其包括鼠抗兔IgG的酶标记物、包被有草鱼出血病病毒的ELISA板。
上述的草鱼出血病病毒抗体ELISA检测试剂盒还包括标准血清、洗涤液、TMB底物显色液、终止液。
上述草鱼出血病病毒抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法，其包括以下几个步骤：
1)ELISA板包被抗原的制备：采用CIK细胞接种草鱼出血病病毒获得病毒悬浮液；对病毒悬浮液进行离心、超滤浓缩后得到浓缩液，将浓缩液依次经过分子筛层析、阴离子交换层析、超滤浓缩后获得精纯病毒液；
2)包被液的制备：包被液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液，该包被液的pH为9～9.8；
3)洗涤液的制备：洗涤液为0.15mol/L含吐温-20的磷酸盐缓冲液，该洗涤液的pH为7.4，吐温-20的体积浓度为0.05％；
4)封闭液的制备：在上述洗涤液中加入50～500μg/ml的酶解胶原蛋白，即得封闭液；
5)ELISA板的制备：将步骤1)制得的精纯病毒液加入到包被液中进行稀释至浓度为0.5～10μg/ml的病毒蛋白稀释液，将病毒蛋白稀释液加入到ELISA板的每孔中，2～8℃孵育过夜；然后使用洗涤液洗涤，接着向ELISA板每孔中加入100μl封闭液后置于2～8℃冰箱中孵育过夜；再使用洗涤液洗涤后，加入0.3ml含有浓度为0.5～2％的戊二醛的洗涤液在2～8℃下孵育过夜；使用洗涤液洗涤后在37℃下干燥12～24h，干燥后使用膜封闭ELISA板，37℃保存。
具体地，在上述的步骤1)中采用CIK细胞接种草鱼出血病病毒具体包括以下步骤：
a、在无菌条件下采用孔径为10～100K的超滤膜对胎牛血清进行超滤，收集滤出液，得到营养液；较佳的超滤膜孔径为30K；
b、采用M199培养基培养CIK细胞，长满单层后加入胰蛋白酶进行消化，然后使用移液管反复轻轻吹打成单细胞悬浮液，在25℃下按照体积比1:3接种传代培养；
c、待CIK细胞生长至单层致密后接种0.03MOI的草鱼出血病病毒，加入步骤a所制得的营养液后25℃下培养4～6天后获得病毒悬浮液。
具体地，在上述的步骤1)中所述的离心是将病毒悬浮液在4000～6000r/min的转速下进行离心，离心时间为20～60min，然后收集上清液。其中，较佳的方案中，离心转速为4500～6000r/min，离心时间为30～60min。
将上述离心步骤后得到的上清液采用孔径为10～300K的超滤膜进行超滤，收集非滤出液，得到浓缩液。较佳的方案中超滤膜的孔径为10～100K。
具体地，在上述的步骤1)中的分子筛层析采用填料为SuperdexTM200、填料高度为20～80cm的层析柱；上样前用PH为7.2的0.01mol/L磷酸盐缓冲液平衡层析柱，然后将体积为填料体积的5～20％的浓缩液上样至层析柱中，使用PH为7.2的0.01mol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集第一洗脱峰样品，得到初纯液。
具体地，在上述的步骤1)中的阴离子交换层析采用填料为CellufineSulfate的层析柱；上样前用PH为7.2的0.01mol/L磷酸盐缓冲液平衡层析柱，然后将初纯液上样至层析柱中，使用0.5mol/LNaCl溶液进行梯度洗脱，收集第二洗脱峰样品，得到精纯液。
将经阴离子交换层析得到的精纯液采用孔径为10～300K的超滤膜进行超滤，收集非滤出液，得到精纯病毒液。较佳的方案中，超滤膜的孔径为10～100K。
在上述步骤4)中，封闭液的制备具体包括以下步骤：
A、在5～10g明胶中加入200ml用超纯水配制的PBS溶液，完全溶解后进行湿热高压灭菌，温度为121℃、灭菌时间为20min；
B、灭菌结束后自然冷却至常温，加入0.25％胰酶溶液，37℃下消化8-24h；重复该步骤1-3次后得到胰酶消化液；
C、使用孔径为100K的超滤膜对胰酶消化液进行超滤，收集滤出液；然后使用孔径为30K的超滤膜对上述滤出液进行超滤，收集非超滤液，得到酶解胶原蛋白；
D、将上述酶解胶原蛋白以50～500μg/ml的量加入到步骤3)所述洗涤液中，即得封闭液。
实施例1
草鱼出血病病毒抗体ELISA检测试剂盒，,按照以下方法制备而成的，具体包括以下几个步骤：
一、草鱼出血病病毒的繁殖：
a、在无菌条件下采用孔径为30K的超滤膜对胎牛血清进行超滤，收集滤出液，得到营养液；
b、在225cm2的方瓶中加入Gibco的M199培养基培养CIK细胞，待CIK细胞长满单层后加入胰蛋白酶进行消化，然后使用移液管反复轻轻吹打成单细胞悬浮液，在25℃下按照体积比1:3接种传代培养；
c、待CIK细胞生长形成致密的单层后接种0.03MOI的草鱼出血病病毒，加入10％步骤a所制得的营养液后25℃下培养5天后获得病毒悬浮液。
二、草鱼出血病病毒的纯化
1、离心超滤：将上述的病毒悬浮液在离心转速为4500rpm、离心时间为30min的条件下进行离心，收集上清液；然后使用孔径为100K的超滤膜对上清液进行超滤，收集非滤出液，得到浓缩液。
2、分子筛层析纯化：采用SuperdexTM200填料的层析柱进行分子筛层析，填料装柱的高度为30cm；使用pH为7.2的0.01mol/L磷酸盐缓冲液平衡层析柱，然后将浓缩液上样至层析柱进行层析，上样的浓缩液体积为填料体积的5％；使用PH为7.2的0.01mol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集第一个洗脱峰样品，即为草鱼出血病病毒峰样品，得到初纯液；浓缩液通过SuperdexTM200分子筛层析的分离效果具体参见图1，图1中曲线表示浓缩液中蛋白质浓度；黑色箭头表示草鱼出血病病毒的洗脱峰。
3、阴离子交换层析纯化：采用填料为CellufineSulfate的层析柱进行阴离子交换层析；使用pH为7.2的0.01mol/L磷酸盐缓冲液平衡层析柱，然后将初纯液上样至层析柱进行层析，然后用0.5mol/LNaCl溶液进行梯度洗脱，收集第二个洗脱峰样品，即草鱼出血病病毒峰，得到精纯液；初纯液通过CellufineSulfate阴离子交换层析的分离效果具体参见图2，图2中曲线表示初纯液中蛋白质浓度；黑色箭头表示草鱼出血病病毒的洗脱峰。
4、超滤纯化：使用孔径为10K的超滤膜对精纯液进行超滤浓缩，去除小分子物质，收集非滤出液，得到精纯病毒液。
为了考察上述不同的纯化步骤对草鱼出血病病毒纯度的影响，分别对进行上述纯化步骤前的病毒悬浮液及每个纯化步骤结束后得到的液体测定病毒滴度、蛋白含量，结果见表1。
由表1可知，上述不同的纯化步骤对草鱼出血病病毒的纯度均有不同的影响，其中超滤、分子筛层析、阴离子交换层析对草鱼出血病病毒的纯度影响最大。本发明的草鱼出血病病毒经过特殊培养方法和多个不同的纯化步骤后，使得其最终能够达到病毒滴度(TCID50)为107.7/0.1ml时，蛋白含量仅为95μg/ml。
表1不同处理过程对草鱼出血病病毒的纯度影响
编号 处理过程 病毒滴度(TCID50/0.1ml) 蛋白含量(μg/ml)
1 未处理 108.3 2000
2 离心 108.2 1700
3 超滤 108.2 600
4 分子筛层析 108.0 200
5 Cellufine Sulfate离子交换 107.9 99
6 超滤 107.9 95
三、包被液的制备：包被液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液，其pH为9.6；
四、洗涤液的制备：洗涤液为0.15mol/L含吐温-20的磷酸盐缓冲液，该洗涤液的pH为7.4，吐温-20的体积浓度为0.05％；
五、封闭液的制备：
A、在5g明胶中加入200ml用超纯水配制的PBS溶液，完全溶解后进行湿热高压灭菌，温度为121℃、灭菌时间为20min；
B、灭菌结束后自然冷却至常温，加入0.25％胰酶溶液，37℃下消化12h；重复该步骤1-3次后得到胰酶消化液；
C、使用孔径为100K的超滤膜对胰酶消化液进行超滤，收集滤出液；然后使用孔径为30K的超滤膜对上述滤出液进行超滤，收集非超滤液，得到酶解胶原蛋白；
D、将上述酶解胶原蛋白以50μg/ml的量加入到步骤3)所述洗涤液中，即得封闭液。
六、ELISA板的制备：
将上述的精纯病毒液加入到包被液中进行稀释，得到浓度为0.5μg/ml的病毒蛋白稀释液，将50μl的病毒蛋白稀释液加入到ELISA板的每孔中，放入2～8℃的冰箱中孵育过夜；倒净包被液，然后每次向每孔中加入0.3ml的洗涤液洗涤3遍，接着向ELISA板每孔中加入100μl封闭液后置于2～8℃冰箱中孵育过夜；倒净封闭液，每次向每孔中加入0.3ml的洗涤液洗涤3遍后，每孔加入0.3ml含有浓度为0.5～2％的戊二醛的洗涤液在2～8℃下孵育过夜；每次向每孔中加入0.3ml的洗涤液洗涤3遍后在37℃下干燥12～24h，干燥后使用膜封闭ELISA板，37℃保存。
为了考察保存时间对上述方法制得的ELISA板检测结果的影响，分别使用37℃下不同保存时间的ELISA板检测兔抗草鱼出血病病毒抗体，具体检测步骤如下：在ELISA板中加入50ul兔抗草鱼出血病病毒的抗体，37℃孵育2小时；然后使用洗涤液洗涤3次；再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗兔IgG的酶标二抗37℃孵育30min；然后使用洗涤液洗涤3次，再加入TMB底物显色液反应20min；然后加入50ul终止液(2M的H2SO4溶液)终止反应；然后采用酶标仪在450nm的波长处测定OD值，测定结果参照表2。
表2ELISA板在37℃保存不同时间对其检测效果的影响
保存时间(37℃) 5d 10d 20d 30d 40d 50d 60d 80d 100d
OD值(1/trans) 1.8 1.8 1.7 1.7 1.7 1.8 1.7 1.5 1.5
由表2可知，本发明所制得的ELISA板在37℃下的保存时间大于2个月，其对兔抗草鱼出血病病毒抗体的检测结果没有明显变化。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种草鱼出血病病毒抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于：其包括鼠抗兔IgG的酶标记物、包被有草鱼出血病病毒的ELISA板；
所述的草鱼出血病病毒抗体的ELISA检测试剂盒通过以下步骤制得：
1）ELISA板包被抗原的制备：采用CIK细胞接种草鱼出血病病毒获得病毒悬浮液；对病毒悬浮液进行离心、超滤浓缩后得到浓缩液，将浓缩液依次经过分子筛层析、阴离子交换层析、超滤浓缩后获得精纯病毒液；
2）包被液的制备：包被液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液，该包被液的pH为9~9.8；
3）洗涤液的制备：洗涤液为0.15mol/L含吐温-20的磷酸盐缓冲液，该洗涤液的pH为7.4，吐温-20的体积浓度为0.05%；
4）封闭液的制备：在上述洗涤液中加入50~500μg/ml的酶解胶原蛋白，即得封闭液；
5）ELISA板的制备：将步骤1）制得的精纯病毒液加入到包被液中进行稀释至浓度为0.5~10μg/ml的病毒蛋白稀释液，将病毒蛋白稀释液加入到ELISA板的每孔中，2~8℃孵育过夜；然后使用洗涤液洗涤，接着向ELISA板每孔中加入100μl封闭液后置于2~8℃冰箱中孵育过夜；再使用洗涤液洗涤后，加入含有浓度为0.5~2%的戊二醛的洗涤液在2~8℃下孵育过夜；使用洗涤液洗涤后在37℃下干燥12~24h，干燥后使用膜封闭ELISA板，37℃保存。
2.根据权利要求1所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于：该ELISA检测试剂盒还包括标准血清、洗涤液、TMB底物显色液、终止液。
3.一种如权利要求1所述的草鱼出血病病毒抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于：其包括以下几个步骤：
1）ELISA板包被抗原的制备：采用CIK细胞接种草鱼出血病病毒获得病毒悬浮液；对病毒悬浮液进行离心、超滤浓缩后得到浓缩液，将浓缩液依次经过分子筛层析、阴离子交换层析、超滤浓缩后获得精纯病毒液；
2）包被液的制备：包被液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液，该包被液的pH为9~9.8；
3）洗涤液的制备：洗涤液为0.15mol/L含吐温-20的磷酸盐缓冲液，该洗涤液的pH为7.4，吐温-20的体积浓度为0.05%；
4）封闭液的制备：在上述洗涤液中加入50~500μg/ml的酶解胶原蛋白，即得封闭液；
5）ELISA板的制备：将步骤1）制得的精纯病毒液加入到包被液中进行稀释至浓度为0.5~10μg/ml的病毒蛋白稀释液，将病毒蛋白稀释液加入到ELISA板的每孔中，2~8℃孵育过夜；然后使用洗涤液洗涤，接着向ELISA板每孔中加入100μl封闭液后置于2~8℃冰箱中孵育过夜；再使用洗涤液洗涤后，加入含有浓度为0.5~2%的戊二醛的洗涤液在2~8℃下孵育过夜；使用洗涤液洗涤后在37℃下干燥12~24h，干燥后使用膜封闭ELISA板，37℃保存。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：在步骤1）中采用CIK细胞接种草鱼出血病病毒具体包括以下步骤：
a、在无菌条件下采用孔径为10~100K的超滤膜对胎牛血清进行超滤，收集滤出液，得到营养液；
b、采用M199培养基培养CIK细胞，长满单层后加入胰蛋白酶进行消化，然后使用移液管反复轻轻吹打成单细胞悬浮液，在25℃下按照体积比1:3接种传代培养；
c、待CIK细胞生长至单层致密后接种0.03MOI的草鱼出血病病毒，加入步骤a所制得的营养液后于25℃下培养4~6天后获得病毒悬浮液。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤1）中所述的离心是将病毒悬浮液在4000~6000r/min的转速下进行离心，离心时间为20~60min，然后收集上清液。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：将上清液采用孔径为10~300K的超滤膜进行超滤，收集非滤出液，得到浓缩液。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：在步骤1）中的分子筛层析采用填料为SuperdexTM200、填料高度为20~80cm的层析柱；上样前用PH为7.2的0.01mol/L磷酸盐缓冲液平衡层析柱，然后将体积为填料体积的5~20%的浓缩液上样至层析柱中，使用PH为7.2的0.01mol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集第一洗脱峰样品，得到初纯液。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：在步骤1）中的阴离子交换层析采用填料为CellufineSulfate的层析柱；上样前用PH为7.2的0.01mol/L磷酸盐缓冲液平衡层析柱，然后将初纯液上样至层析柱中，使用0.5mol/LNaCl溶液进行梯度洗脱，收集第二洗脱峰样品，得到精纯液。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：将精纯液采用孔径为10~300K的超滤膜进行超滤，收集非滤出液，得到精纯病毒液。
10.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：封闭液的制备具体包括以下步骤：
A、在5~10g明胶中加入200ml用超纯水配制的PBS溶液，完全溶解后进行湿热高压灭菌，温度为121℃、灭菌时间为20min；
B、灭菌结束后自然冷却至常温，加入0.25%胰酶溶液，37℃下消化8-24h；重复该步骤1-3次后得到胰酶消化液；
C、使用孔径为100K的超滤膜对胰酶消化液进行超滤，收集滤出液；然后使用孔径为30K的超滤膜对上述滤出液进行超滤，收集非超滤液，得到酶解胶原蛋白；
D、将上述酶解胶原蛋白以50~500μg/ml的量加入到步骤3）所述洗涤液中，即得封闭液。
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