CN104198248A - 用于双向电泳的小鼠精子总蛋白提取和分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于双向电泳的小鼠精子总蛋白提取和分离方法，包括精子的制备、精子裂解后沉淀其中的DNA、制备精子蛋白、制备蛋白提取样品、第一向等电聚焦电泳、第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、用考马斯亮蓝染色、制备的凝胶、图像扫描仪扫描。本发明方法使用Trizol彻底裂解精子，氯仿抽提蛋白，异丙醇、盐酸胍、乙醇去除杂质，丙酮纯化蛋白，很好的解决了小鼠精子含量少，采集困难，细胞体积小，细胞质少，富含顶体蛋白酶的问题。采用本发明方法得到的样品制备全、分离蛋白点多、重复性好、图谱清晰，经PDQuestsoftware软件检测，蛋白点多于1000个，为进一步质谱分析打好基础。
Description
技术领域
本发明属于生殖生物学和疾病发病机制研究技术领域，具体涉及一种小鼠精子总蛋白提取以及双向电泳的方法。
背景技术
随着现代工业的发展，环境中的有毒有害物质增多。近年来，有毒有害物质对生殖系统的影响及其药物研发已经成为研究热点。精子是一种高度分化的细胞，是雄性动物的成熟生殖细胞。精子的主要功能是完成受精过程，使其种群延续。精子的形态结构和功能异常，既能影响精液的质量，又是雄性动物不育的重要原因之一。基因是动物的遗传物质，其含量成分相对恒定；蛋白质是基因功能的执行者，同一动物体不同细胞内蛋白表达差异显著。疾病的发生必然伴随着蛋白质的改变，以小鼠为动物模型寻找毒物、药物影响精子的关键蛋白和标志蛋白，对于疾病的诊断、病理的研究和药物的筛选都具有重要意义。蛋白质本身的结构和活动规律，如表达量，蛋白质间相互作用，结构的变化以及蛋白修饰必须依赖蛋白质组学技术来解决。
蛋白质组学是继基因组学、转录组学之后形成的交叉学科，主要是从整体水平研究细胞蛋白质的组成，结构及其自身特有的活动规律。双向电泳是蛋白组学技术三大技术之一，是质谱技术、蛋白质信息学的上游技术。双向电泳利用等电点和分子量两个性质对蛋白质进行分离,可以使样品中的数千种蛋白质得到很好的分离。而蛋白质的样品制备与电泳条件的摸索是双向电泳的关键步骤， 但是由于小鼠精子含量少，采集困难，细胞体积小，细胞质少，富含顶体蛋白酶,其蛋白样品制备一直较为困难。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于双向电泳的小鼠精子总蛋白提取和分离方法，采用该方法提取和分离的小鼠精子总蛋白样品制备全、分离蛋白点多、重复性好、图谱清晰，是一套适用于小鼠精子总蛋白组分析的双向电泳技术。
为实现本发明目的，本发明采用的技术方案包括如下步骤：
（1）将成熟雄性小鼠断颈处死，把两侧附睾尾及输精管的精子冲出，-80℃保存备用；
（2）将（1）取得的精子在室温解冻后，在4℃、12,000g条件下离心10 min沉淀精子；
（3）将（2）获得的精子按照1. 5 ×107个精子/mL Trizol液裂解，置于1.5ml Ep管中，用200μl枪头反复吹打沉淀至完全分散，然后在精子中首先加入20 μL β-巯基乙醇(β-ME) ， 65 ℃ 水浴60 min，然后加入0. 2 mL氯仿， 振荡20s， 28℃水浴锅中孵育5 min，12 000g、4℃ 离心15 min，得到分层的混合物，吸取分层混合物的下层500μl-700μl有机相转移至新管中，加入无水乙醇0. 3 mL， 4℃、12,000g 离心5 min， 使其中的DNA 沉淀；
（4）取（3）离心后的上清部分500μl-700μl)转移至2mL新管中， 加入1.5mL异丙醇， 振荡30 s，在28℃ 水浴锅中孵育10 min， 12 000g、4 ℃ 离心10 min 沉淀蛋白，弃上清；加入2 mL 洗液，用200μl枪头反复吹打10次，洗涤蛋白沉淀，28℃水浴锅中孵育20 min，12 000 g、4 ℃ 离心5 min，弃上清，重复3 次；然后再用无水乙醇重复洗涤蛋白3 次，最后在室温下干燥10-20 min，待无水乙醇挥发殆尽为止；
（5）将（4）制备的精子蛋白沉淀溶于50μl-100 μl样品水化液中，加入400 μl丙酮，-20℃纯化15min，4℃、12,000g离心5 min，弃上清，再加入样品水化液50μl-100μl，在4 ℃ 下静止12 h，然后在4 ℃、12 000g离心10 min，弃不溶物，取上清，然后采用Bradford法对上清进行蛋白定量，重复3次，求平均值；
（6）根据（5）定量的蛋白浓度，计算出上样200μg-500μg所需的（5）中蛋白提取样品的体积，制备的蛋白提取样品和样品水化液加入聚焦盘中，使终体积在125μl-250μl之内，将胶条胶面朝下放入蛋白提取样品溶液，加盖矿物油3-5ml，充满整个胶条槽，室温下被动水化15小时后的胶条进行第一向等电聚焦电泳；
（7）经（6）处理后的胶条，加入2.5ml平衡缓冲液Ⅰ，水平摇动15min，加入2.5ml平衡缓冲液Ⅱ，水平摇动15min，然后将胶条转移至12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的上端，琼脂糖封胶液封顶，加入封胶液去除气泡后，进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，条件是：15mA 30min，20 mA 100min；
（8）经（7）处理后的胶条用纯水洗3次，每次15min，然后用考马斯亮蓝染色液染色5h，再用超纯水脱色3次；
（9）将（8）制备的凝胶用图像扫描仪扫描，即得电泳图谱。
所述的裂解液需现用现配。
所述的洗液为0.3 M 盐酸胍或95% 乙醇。
所述的样品水化液是由下列原料的质量体积份（w/v）组成： 7 M 尿素、2 M 硫脲、4%CHAPS、65 mM DTT、0.2% （w/v）Bio-Lyte、0.001%溴酚蓝，且均各种成分需现用现配。
所述的第一向等电聚焦电泳包括下列步骤：无电压室温被动水化15小时，250伏电压线性除盐2小时，500伏电压快速除盐0.5小时，4000伏电压线性升压3小时，4000伏电压快速聚焦20000总电压时间积，500伏电压低压维持0到12小时。
所述的平衡缓冲液Ⅰ由6 M 尿素、2%SDS、0.375M PH8.8 Tris-Hcl、20% 甘油、1%DTT配置而成。
所述的平衡缓冲液Ⅱ由6 M 尿素、2%SDS、0.375M PH8.8 Tris-Hcl、20% 甘油、2.5%碘乙酰胺配置而成。
所述的12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶由下列原料的质量体积份（w/v）配置而成：水33份、30%的聚丙烯酰胺40份、0.375M PH8.8的Tris-HCl25份、10%SDS1份、10%过硫酸铵1份、四甲基乙二胺0.06份。
所述的考马斯亮蓝染色液由考马斯亮蓝R-250粉末、异丙醇、冰醋酸和去离子水配制而成，其质量体积份（w/v）为：考马斯亮蓝R-250份、异丙醇250份、冰醋酸100份、去离子水650份，终浓度为0.1%（w/v）考马斯亮蓝R-250、25%(v/v)异丙醇和10%(v/v)冰醋酸。
所有现配溶液均需用电阻率大于18MΩ·cm（25℃）制备的的实验室用水配制。
本发明的有益效果
本发明用于双向电泳的小鼠精子总蛋白提取和分离方法与现有技术相比，其突出的优点是：（1）使用Trizol彻底裂解精子，氯仿抽提蛋白，异丙醇、盐酸胍、乙醇去除杂质，丙酮纯化蛋白，很好的解决了小鼠精子含量少，采集困难，细胞体积小，细胞质少，富含顶体蛋白酶的问题。（2）采用本发明方法得到的样品制备全、分离蛋白点多、重复性好、图谱清晰，经PDQuest software软件检测，蛋白点多于500个，为进一步质谱分析打好基础。
附图说明
图1为8周龄性成熟雄性昆明小鼠精子总蛋白双向电泳图谱。
具体实施方式
实施例1
用本发明的方法提取和分离小鼠精子总蛋白，采用如下步骤：
（1）将饲养8周龄体成熟雄性昆明小鼠断颈处死，将两侧附睾尾及输精管的精子冲出，在-80℃保存备用；
（2）将（1）取得的精子在室温解冻后，采用sigma高速低温离心机在4℃、12,000g条件下离心10 min沉淀精子；
（3）将（2）制备的精子按照1. 5 ×107个精子/mL Trizol液裂解，置于1.5ml Ep管中，用200μl枪头反复吹打沉淀至完全分散，然后在精子中首先加入20 μL β-巯基乙醇，65 ℃ 水浴60 min，然后加入0.2 mL氯仿，振荡20s，28℃水浴锅中孵育5 min，12 000g、4℃ 离心15 min，得到分为3 层的混合物，蛋白主要分布在底层有机相，中层为DNA，吸取下层有机相600μl转移至新管中，加入无水乙醇0.3 mL， 4℃、12,000g 离心5 min， 使其中的混杂的DNA 沉淀；
（4）取（3）离心后的取上清部分500μl转移至2ml Ep管中， 加入1.5mL异丙醇， 振荡30 s，在28℃ 水浴锅中孵育10 min，12 000g、4 ℃ 离心10 min 沉淀蛋白，弃上清；加入2 mL用95% 乙醇制备的洗液，用200μl枪头反复吹打10次，洗涤蛋白沉淀，28℃水浴锅中孵育20 min，12 000 g、4 ℃ 离心5 min，弃上清；重复3 次，然后再用无水乙醇重复洗涤蛋白3 次，最后在室温下干燥10-20 min，待无水乙醇挥发殆尽为止；
（5）将（4）制备的精子蛋白沉淀溶于100 μl样品水化液中，样品水化液由 7 M 尿素、2 M 硫脲、4%CHAPS、65 mM DTT、0.2% (w/v)Bio-Lyte、0.001%溴酚蓝现配而成。加入400 μl丙酮，-20℃纯化15min，4℃、12,000g离心5 min，弃上清，再加入上述水化液100μl，在4 ℃ 下静止12 h，然后在4 ℃、12 000g离心10 min，弃不溶物，取上清，然后采用Bradford法对上清进行蛋白定量,重复3次，测得蛋白浓度的平均值为18.8 μg/μl；
（6）将（5）制备的蛋白提取样品80μl以及和样品水化液70μl混匀后加入聚焦盘中，将7cm胶条胶面朝下放入蛋白提取样品溶液，加盖矿物油5ml，充满整个胶条槽，室温下被动水化15小时后的胶条用美国Bio-Rad生产的双向电泳PROTEAN进行第一向等电聚焦电泳，电泳条件是：无电压室温被动水化15小时，250伏电压线性除盐2小时，500伏电压快速除盐0.5小时，4000伏电压线性升压3小时，4000伏电压快速聚焦20000总电压时间积，500伏电压维持12小时；
（7）经（6）处理后的胶条，加入2.5ml由6 M 尿素、2%SDS、0.375M PH8.8 Tris-Hcl、20% 甘油、1%DTT配置而成的平衡缓冲液Ⅰ，水平摇动15min；再加入2.5ml由6 M 尿素、2%SDS、0.375M PH8.8 Tris-Hcl、20% 甘油、2.5%碘乙酰胺配置而成的平衡缓冲液Ⅱ，水平摇动15min，然后将胶条转移至由质量体积份（w/v）水33份、30%的聚丙烯酰胺40份、0.375M PH8.8的Tris-HCl 25份、10%SDS 1份、10%过硫酸铵1份、四甲基乙二胺0.06份配制而成的12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶的上端，琼脂糖封胶液封顶，加入封胶液去除气泡后，进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，条件是：15mA 30min，20 mA 100min；
（8）经（7）处理后的胶条用纯水洗3次，每次15min，然后用终浓度为0.1%（w/v）考马斯亮蓝R-250、25%(v/v)异丙醇和10%(v/v)冰醋酸的考马斯亮蓝染色液R-250染色5h，再用超纯水脱色3次；
（9）将（8）制备的凝胶用图像扫描仪扫描，即得图1所示的电泳图谱。
Claims (8)
1.用于双向电泳的小鼠精子总蛋白提取和分离方法，包括如下步骤：
（1）将成熟雄性小鼠断颈处死，把两侧附睾尾及输精管的精子冲出，-80℃保存备用；
（2）将（1）取得的精子在室温解冻后，在4℃、12,000g条件下离心10 min沉淀精子；
（3）将（2）获得的精子按照1. 5 ×107个精子/mL Trizol液裂解，置于1.5ml Ep管中，用200μl枪头反复吹打沉淀至完全分散，然后在精子中首先加入20 μL β-巯基乙醇(β-ME) ， 65 ℃ 水浴60 min，然后加入0. 2 mL氯仿， 振荡20s， 28℃水浴锅中孵育5 min，12 000g、4℃ 离心15 min，得到分层的混合物，吸取分层混合物的下层500μl-700μl有机相转移至新管中，加入无水乙醇0. 3 mL， 4℃、12,000g 离心5 min， 使其中的DNA 沉淀；
（4）取（3）离心后的上清部分500μl-700μl转移至2mL新管中， 加入1.5mL异丙醇， 振荡30 s，在28℃ 水浴锅中孵育10 min， 12 000g、4 ℃ 离心10 min 沉淀蛋白，弃上清；加入2 mL 洗液，用200μl枪头反复吹打10次，洗涤蛋白沉淀，28℃水浴锅中孵育20 min，12 000 g、4 ℃ 离心5 min，弃上清，重复3 次；然后再用无水乙醇重复洗涤蛋白3 次，最后在室温下干燥10-20 min，待无水乙醇挥发殆尽为止；
（5）将（4）制备的精子蛋白沉淀溶于50μl-100 μl样品水化液中，加入400 μl丙酮，-20℃纯化15min，4℃、12,000g离心5 min，弃上清，再加入样品水化液50μl-100μl，在4 ℃ 下静止12 h，然后在4 ℃、12 000g离心10 min，弃不溶物，取上清，然后采用Bradford法对上清进行蛋白定量，重复3次，求平均值；
（6）根据（5）定量的蛋白浓度，计算出上样200μg-500μg所需的（5）中蛋白提取样品的体积，制备的蛋白提取样品和样品水化液加入聚焦盘中，使终体积在125μl-250μl之内，将胶条胶面朝下放入蛋白提取样品溶液，加盖矿物油3-5ml，充满整个胶条槽，室温下被动水化15小时后的胶条进行第一向等电聚焦电泳；
（7）经（6）处理后的胶条，加入2.5ml平衡缓冲液Ⅰ，水平摇动15min，加入2.5ml平衡缓冲液Ⅱ，水平摇动15min，然后将胶条转移至12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的上端，琼脂糖封胶液封顶，加入封胶液去除气泡后，进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，条件是：15mA 30min，20 mA 100min；
（8）经（7）处理后的胶条用纯水洗3次，每次15min，然后用考马斯亮蓝染色液染色5h，再用超纯水脱色3次；
（9）将（8）制备的凝胶用图像扫描仪扫描，即得电泳图谱。
2.根据权利要求1所述的用于双向电泳的小鼠精子总蛋白提取和分离方法，其特征在于，所述的洗液为0.3 M 盐酸胍或95% 乙醇。
3.根据权利要求1所述的用于双向电泳的小鼠精子总蛋白提取和分离方法，其特征在于，所述的样品水化液是由下列原料的质量体积份（w/v）组成： 7 M 尿素、2 M 硫脲、4%CHAPS、65 mM DTT、0.2% （w/v）Bio-Lyte、0.001%溴酚蓝，且均各种成分需现用现配。
4.根据权利要求1所述的用于双向电泳的小鼠精子总蛋白提取和分离方法，其特征在于，所述的第一向等电聚焦电泳包括下列步骤：无电压室温被动水化15小时，250伏电压线性除盐2小时，500伏电压快速除盐0.5小时，4000伏电压线性升压3小时，4000伏电压快速聚焦20000总电压时间积，500伏电压低压维持0到12小时。
5.根据权利要求1所述的用于双向电泳的小鼠精子总蛋白提取和分离方法，其特征在于，所述的平衡缓冲液Ⅰ由6 M 尿素、2%SDS、0.375M PH8.8 Tris-Hcl、20% 甘油、1%DTT配置而成。
6.根据权利要求1所述的用于双向电泳的小鼠精子总蛋白提取和分离方法，其特征在于，所述的平衡缓冲液Ⅱ由6 M 尿素、2%SDS、0.375M PH8.8 Tris-Hcl、20% 甘油、2.5%碘乙酰胺配置而成。
7.根据权利要求1所述的用于双向电泳的小鼠精子总蛋白提取和分离方法，其特征在于，所述的12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶由下列原料的质量体积份（w/v）配置而成：水33份、30%的聚丙烯酰胺40份、0.375M PH8.8的Tris-HCl25份、10%SDS1份、10%过硫酸铵1份、四甲基乙二胺0.06份。
8.根据权利要求1所述的用于双向电泳的小鼠精子总蛋白提取和分离方法，其特征在于，所述的考马斯亮蓝染色液由考马斯亮蓝R-250粉末、异丙醇、冰醋酸和去离子水配制而成，其质量体积份（w/v）为：考马斯亮蓝R-250份、异丙醇250份、冰醋酸100份、去离子水650份。
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