CN111811918B - 一种石蜡包埋食管癌组织中制备肽段的方法 - Google Patents
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Abstract
一种石蜡包埋食管癌组织中制备肽段的方法，包括以下步骤：S1：脱蜡；S2：水化；S3：依次加入1ml的70％酒精，并在室温下孵育10分钟；S4：溶解样本；S5：将S4得到蛋白质溶液转移至Barocycler匹配试管内，放置于Barocycler固定位上，程序设置为95℃下，共60个循环，其中每个循环内40000psi，时间50秒，紧接着5000psi，时间10秒；S6：将沉淀保存至‑80℃冰箱；S7：冷冻丙酮溶液沉淀蛋白质；S8：4℃下16000g离心10分钟去除丙酮；S9：定量蛋白质；S10：肽段消化；S11：磷酸化肽段的富集。本发明提高了工作效率，降低了堵塞导致的样本丢失。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质研究中的肽段的制备，特别涉及石蜡包埋食管癌组织中制备肽段的方法，属于生物技术领域。
背景技术
临床蛋白质组学研究是通过发现不同病患和健康人之间的蛋白质及其修饰水平的表达丰度差异,以实现疾病人群的分子分型，发现潜在的药物干预靶标和诊断标志物。活检或手术切除组织是临床治疗过程中可获取的基本样本，包括新鲜/冻存和福尔马林固定石蜡包埋(Formalin-fixed and paraffin-embedding,FFPE)的组织样本。其中FFPE组织在常温下可稳定储存数十年,是组织病理学分析的金标准。自该技术诞生的一个世纪发展,在全世界临床上已经累积了大量的FFPE组织样本。FFPE组织样本的一个重要优势是具备长期的临床随访信息,包括个体生活史、疾病分期、无病生存期和死亡时间等信息。这些信息对于多组学分析和目标导向的精准医学实践异常重要,而这往往是新鲜冻存组织难以达到的。基于患者人群的FFPE组织开展差异蛋白质组学研究，可以充分利用罕见疾病或肿瘤等样本,发现与疾病诊断、分型、预后及治疗密切相关的靶蛋白。从技术角度,FFPE组织由于经过甲醛固定、脱水和封蜡等处理，且通常只能获得几个微米厚度的切片，因此针对微量切片的FFPE组织蛋白质提取和消化、质谱分析等过程,本身又构成了极大的挑战。如何保证在提取包埋样本内蛋白质的过程中，保证不丢失蛋白质，保护原有蛋白质上的修饰重要信息，且该操作简便，能够在大部分临床机构内开展，蛋白质组研究者面对的现实问题。
对FFPE样本内蛋白质提取中肽段制备的主要报道如下，主要集中表现在不同提取裂解液的选取和总蛋白质充分酶解的质谱检测：
1.Broeckx等对比了8种不同蛋白裂解液的提取效率，阐明了在提取液中加入2%十二烷基硫酸钠后，蛋白的回收率提高了15倍。Molecular Biosystems,2016,12(2):553-565
2.Gawin等在2018年将人甲状腺癌的石蜡包埋组织样本用单独胰蛋白酶酶切和Lyc-C与胰蛋白酶联用进行了比较，多酶联用中鉴定到了4800基因(单独胰蛋白酶酶切鉴定到3700多种基因)。J. Proteome Res，2018,18（1）：426-435。
基于目前的蛋白质组学研究中的肽段制备方法，研究更为全面的高效肽段制备方法是有助于提高其研究水平。
发明内容
本发明的目的在于进一步优选蛋白质组学研究中肽段制备方法。
为实现本发明的目的，采用了下述的技术方案：一种石蜡包埋食管癌组织中制备肽段的方法，包括以下步骤：
S1：脱蜡：将连续的5~10张每张厚度5μm石蜡包埋切片置于1个2ml离心管内，加入1ml的100％二甲苯并孵育10分钟，每2分钟震荡涡旋1次，2500 g下离心10分钟，然后除去二甲苯溶液；再次添加1ml的100％二甲苯并重复上述步骤1次；
S2：水化：步骤S1脱腊后加入1ml的100％酒精，并在室温下孵育10分钟，每2分钟震荡涡旋1次，2500 g离心10分钟去除酒精；
S3：依次加入1ml的70％酒精，并在室温下孵育10分钟，每2分钟震荡涡旋1次，2500g离心10分钟除去酒精，再加入1ml去离子水，进行同样的上述步骤1次，离心后，将材料在室温下干燥5分钟；
S4：溶解样本：在S3得到的材料中加入0.5-0.7ml裂解缓冲液，裂解缓冲液组成为0.1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.1M二硫苏糖醇、质量浓度0.5%聚乙二醇20000、质量浓度1%十二烷基硫酸钠，并在加热震荡仪上以1200 rpm和99℃下孵育30分钟；
S5：将S4得到蛋白质溶液转移至Barocycler匹配试管内，放置于Barocycler固定位上，程序设置为95℃下，共60个循环，其中每个循环内40000psi，时间50秒，紧接着5000psi，时间10秒；
S6：程序结束，取出蛋白质溶液，转至2ml离心管内，4℃下16000g离心20分钟，吸取上清，将沉淀保存至-80℃冰箱；
S7：冷冻丙酮溶液沉淀蛋白质去除十二烷基硫酸钠等分子对后续消化步骤的影响：按照冷冻丙酮和蛋白质溶液体积比3:1，冷冻在-20℃过夜沉淀蛋白质；
S8：4℃下16000g离心10分钟去除丙酮，再次按照4倍体积加入冷冻丙酮洗涤沉淀，4℃下16000g离心10分钟后去除丙酮，置于通风橱内完全干燥蛋白质沉淀；
S9：定量蛋白质：加入100μl~200μl的蛋白质溶解缓冲液，缓冲溶液为50mM 三乙基碳酸氢铵、8M尿素缓冲液，经过超声溶解后，4℃下16000g离心10分钟后保留上清，经过蛋白质定量后备用；
S10：肽段消化：根据步骤S9对蛋白质定量的结果，每含1 mg蛋白质裂解溶液中，加入终浓度为5 mM二硫苏糖醇，室温孵育10分钟后，加入终浓度为10 mM碘乙酰胺，室温下避光孵育20分钟，加入4倍上述总体积的50 mM 三乙基碳酸氢铵以及1%蛋白质总质量的胰蛋白酶，在加热震荡器上震荡至少12小时；充分消化的肽段经C18除盐后，-80℃冻干备用；
S11：磷酸化肽段的富集： 本步骤中富集总蛋白初始量1mg，对应使用10 μl琼脂糖珠，琼脂糖珠采用50 μl-100 μl/每1.5 ml EP 管；包括以下S11的子步骤S11A、S11B、S11C、S11D、S11E、S11F、 S11G；
S11A：活化的琼脂糖珠制备：包括以下S11A子步骤：
S11A1：500 μl的100 mM 乙二胺四乙酸孵育洗脱含镍的琼脂糖珠，室温下，旋转孵育盘上500转/分钟，2次，每次5分钟；
S11A2：500 μl 10 mM三氯化铁水溶液中孵育S11A1得到的琼脂糖珠，室温下，旋转孵育盘上500转/分钟，2次，每次5分钟；
S11A3：500 μl 80%乙腈 / 0.1%三氟乙酸孵育S11A2得到的琼脂糖珠，室温下，旋转孵育盘上500转/分钟，2次，每次5分钟；得到活化的琼脂糖珠；
S11B.：溶液重悬肽段：步骤S10中得到的已干燥的磷酸化肽段溶解在80%乙腈 /0.1%三氟乙酸溶液中，终浓度为0.5 μg/μl；
S11C：每1 mg肽段混合物中移入活化的10 μl琼脂糖珠，在室温下，于孵育旋转器上结合30分钟以上；
S11 D：从琼脂糖珠上洗脱磷酸化肽段，包括以下S11D子步骤
S11 D1：用50 μl 80 %乙腈 / 0.1%三氟乙酸和100 μl 1% 甲酸各洗涤琼脂糖珠2次；
S11 D2：pH7.0，500 mM磷酸氢二钠洗脱液70 μl从琼脂糖珠上洗脱磷酸化肽段，重复3次，收集全部洗脱液；
S11E： C18 小柱的预先制备：
100 μl甲醇洗涤2次，50 μl 50%乙腈 / 0.1%甲酸洗涤2次，100 μl 1%甲酸洗涤平衡C18 小柱2次；
S11 F：从C18 小柱洗脱磷酸化肽段：
将S11D2中全部洗脱液上样C18小柱后，100 μl 1%甲酸洗涤2次，然后用60 μl 50%乙腈 / 0.1%甲酸 从C18 小柱洗脱磷酸化肽段3次；
S11G：所有洗脱液合并一管，得到肽段，干燥供高分辨质谱检测用。
本发明的积极有益技术效果在于：本发明与其他已报道的FFPE提取方案比较，具有以下优势：
1、降低了裂解液中十二烷基硫酸钠用量和进行丙酮沉淀蛋白质，减少了后续胰蛋白酶工作效率的干扰；2、在特定的高压高温条件下，使用少量的FFPE切片，即可达到蛋白质的高提取量和高浓度；3、磷酸化肽段预先从琼脂糖小珠上洗脱，减少了因为载体对C18过滤器的堵塞，提高了工作效率，降低了堵塞导致的样本丢失；按照该发明建立的提取和富集完整流程，可以提高FFPE中磷酸化肽段修饰的检测数量，对研究肿瘤机制有重要意义。
附图说明
图1 是提取的蛋白质样本经过电泳后，考马斯蓝染色结果。
图2是食管癌患者FFPE组织的组织化学染色400倍的显微镜图。
图3是食管癌患者FFPE组织的阳性表达示意图。
具体实施方式
以下实施例中，无特殊说明，蛋白质中肽段的制备方法按照以下方法进行：一种石蜡包埋食管癌组织中制备肽段的方法，包括以下步骤：
S1：脱蜡：将连续的5~10张每张厚度5μm石蜡包埋切片置于1个2ml离心管内，加入1ml的100％二甲苯并孵育10分钟，每2分钟震荡涡旋1次，2500 g下离心10分钟，然后除去二甲苯溶液；再次添加1ml的100％二甲苯并重复上述步骤1次；
S2：水化：步骤S1脱腊后加入1ml的100％酒精，并在室温下孵育10分钟，每2分钟震荡涡旋1次，2500 g离心10分钟去除酒精；
S3：依次加入1ml的70％酒精，并在室温下孵育10分钟，每2分钟震荡涡旋1次，2500g离心10分钟除去酒精，再加入1ml去离子水，进行同样的上述步骤1次，离心后，将材料在室温下干燥5分钟；
S4：溶解样本：在S3得到的材料中加入0.5-0.7ml裂解缓冲液，裂解缓冲液组成为0.1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.1M二硫苏糖醇、质量浓度0.5%聚乙二醇20000、质量浓度1%十二烷基硫酸钠，并在加热震荡仪上以1200 rpm和99℃下孵育30分钟；
S5：将S4得到蛋白质溶液转移至Barocycler匹配试管内，放置于Barocycler固定位上，程序设置为95℃下，共60个循环，其中每个循环内40000psi，时间50秒，紧接着5000psi，时间10秒；
S6：程序结束，取出蛋白质溶液，转至2ml离心管内，4℃下16000g离心20分钟，吸取上清，将沉淀保存至-80℃冰箱；
S7：冷冻丙酮溶液沉淀蛋白质去除十二烷基硫酸钠等分子对后续消化步骤的影响：按照冷冻丙酮和蛋白质溶液体积比3:1，冷冻在-20℃过夜沉淀蛋白质；
S8：4℃下16000g离心10分钟去除丙酮，再次按照4倍体积加入冷冻丙酮洗涤沉淀，4℃下16000g离心10分钟后去除丙酮，置于通风橱内完全干燥蛋白质沉淀；
S9：定量蛋白质：加入100μl~200μl的蛋白质溶解缓冲液，缓冲溶液为50mM 三乙基碳酸氢铵、8M尿素缓冲液，经过超声溶解后，4℃下16000g离心10分钟后保留上清，经过蛋白质定量后备用；
S10：肽段消化：根据步骤S9对蛋白质定量的结果，每含1 mg蛋白质裂解溶液中，加入终浓度为5 mM二硫苏糖醇，室温孵育10分钟后，加入终浓度为10 mM碘乙酰胺，室温下避光孵育20分钟，加入4倍上述总体积的50 mM 三乙基碳酸氢铵以及1%蛋白质总质量的胰蛋白酶，在加热震荡器上震荡至少12小时；充分消化的肽段经C18除盐后，-80℃冻干备用；
S11：磷酸化肽段的富集： 本步骤中富集总蛋白初始量1mg，对应使用10 μl琼脂糖珠，琼脂糖珠采用50 μl-100 μl/每1.5 ml EP 管；包括以下S11的子步骤S11A、S11B、S11C、S11D、S11E、S11F、 S11G；
S11A：活化的琼脂糖珠制备：包括以下S11A子步骤：
S11A1：500 μl的100 mM 乙二胺四乙酸孵育洗脱含镍的琼脂糖珠，室温下，旋转孵育盘上500转/分钟，2次，每次5分钟；
S11A2：500 μl 10 mM三氯化铁水溶液中孵育S11A1得到的琼脂糖珠，室温下，旋转孵育盘上500转/分钟，2次，每次5分钟；
S11A3：500 μl 80%乙腈 / 0.1%三氟乙酸孵育S11A2得到的琼脂糖珠，室温下，旋转孵育盘上500转/分钟，2次，每次5分钟；得到活化的琼脂糖珠；
S11B.：溶液重悬肽段：步骤S10中得到的已干燥的磷酸化肽段溶解在80%乙腈 /0.1%三氟乙酸溶液中，终浓度为0.5 μg/μl；
S11C：每1 mg肽段混合物中移入活化的10 μl琼脂糖珠，在室温下，于孵育旋转器上结合30分钟以上；
S11 D：从琼脂糖珠上洗脱磷酸化肽段，包括以下S11D子步骤
S11 D1：用50 μl 80 %乙腈 / 0.1%三氟乙酸和100 μl 1% 甲酸各洗涤琼脂糖珠2次；
S11 D2：pH7.0，500 mM磷酸氢二钠洗脱液70 μl从琼脂糖珠上洗脱磷酸化肽段，重复3次，收集全部洗脱液；
S11E： C18 小柱的预先制备：
100 μl甲醇洗涤2次，50 μl 50%乙腈 / 0.1%甲酸洗涤2次，100 μl 1%甲酸洗涤平衡C18 小柱2次；
S11 F：从C18 小柱洗脱磷酸化肽段：
将S11D2中全部洗脱液上样C18小柱后，100 μl 1%甲酸洗涤2次，然后用60 μl 50%乙腈 / 0.1%甲酸 从C18 小柱洗脱磷酸化肽段3次；
S11G：所有洗脱液合并一管，得到肽段，干燥供高分辨质谱检测用。
实施例1：采用本发明的方法对新鲜组织和FFPE组织进行的比较
首先构建荷瘤小鼠。将生长状态良好的食管癌TE-8细胞按照1×107/ml，100μl皮下注射BALB/c nude免疫缺陷小鼠胸壁5~6肋间和侧腹壁皮下，每日观察小鼠状态和成瘤情况。待接种部位触及直径约1cm结节并迅速长大时，剥离肿瘤组织，一个位点的肿瘤作为新鲜组织，经过液氮冷冻研磨后提取肽段，另一个位点经过常规的石蜡包埋切片后，按照本发明方法提取FFPE肽段，经过考马斯蓝染色确认两样本中蛋白质的表达情况，如图1所示。高分辨质谱检测到，新鲜组织的5个样本共提取到肽段数目为10032，其中包含1532磷酸化肽段，可对应到3534个蛋白质；石蜡组织的5例样本共分析得到8598个肽段，其中1092个磷酸化肽段，找到3299个蛋白质。经过比较分析，来源相同的组织样本，在不同的状态下，蛋白质被识别情况相似程度为87.32%（表1）。经统计学比较，两种形式下的蛋白质数量、肽段数量及磷酸化肽段数量均无显著性差异。利用本发明方法，可以较好的重现原有组织内蛋白质表达情况，追溯和分析肿瘤的发生原因，结合临床信息进一步优化现有诊断和治疗。
实施例2：癌组织和癌旁组织的FFPE样本比较
收集10例中分化食管癌患者的石蜡包埋组织（保存时间为至少1年），参考病理组织化学染色结果（其中代表图片见图2、图3，），将癌组织部分和癌旁部分区分，按区域剥离收集至各自2ml离心管内，每管内各收集10张切片样本。按照本发明方法建立的FFPE肽段提取和优化的磷酸化肽段提取方案，获取到肽段，进行最终的高分辨质谱检测和数据的初步分析。
通过本发明方法，发现癌组织和癌旁组织的识别到的蛋白质存在一定差异，存在34.89%蛋白质不能同时在两部分组织中被检测到。癌组织内的肽段、磷酸化肽段和识别到的蛋白质均多于癌旁部分的对应指标（表2），经过统计学处理，该三种差异均具有显著性（P值分别小于0.05）。使用本发明方法，不但提高了FFPE样本制备成肽段的效率，并且可有助于利用大量的石蜡组织样本，发现与癌症密切相关的蛋白质异常表达水平。
实施例3：本发明中使用的FFPE蛋白质溶解缓冲液测试
根据Broeckx之前报道，其使用的蛋白质溶解液（20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐,200mM二硫苏糖醇, 2%十二烷基硫酸钠,20%甘油）可以使蛋白质回收率提高15倍，本发明中采用的蛋白质溶解液与之有所区别，具体为100mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，100mM 二硫苏糖醇，0.5%聚乙二醇20000，1% 十二烷基硫酸钠。至今尚无报道两种溶解液提取效率的比较，故此部分以实施例1中5个石蜡包埋的小鼠肿瘤组织为对象，每块组织切出20张切片，分2管放置（每个1.5ml小管中收集10张切片）。设计两组实验进行，其中A组按照本发明方法建立的FFPE肽段提取方案和优化的磷酸化肽段提取方案，获取肽段，进行最终高分辨质谱检测和数据的初步分析；B组除蛋白质提取液为Broeckx文献中方案外，其他实验过程和A组操作方式一致。
两组样本经过高分辨质谱检测到，A组（即使用本发明方法中提及的蛋白质提取液方案）5例样本总共分析得到8598个肽段，其中1092个磷酸化肽段，找到3299个蛋白质；B组（采用Broeckx文献中蛋白质提取液方案）5例样本总共分析得到肽段数目为8032，其中包含897磷酸化肽段，肽段对应的蛋白质2843个。比较两种蛋白质提取液方案，共同识别的蛋白质为75.51%（表3）。从肽段数目和蛋白质总数来观察本发明方法中的提取液，效率较文献方法高，另外考虑两种提取液捕获的FFPE蛋白质存在差异，本发明方法中的蛋白质提取液具有一定的实际应用和推广价值。
Claims (1)
1.一种石蜡包埋食管癌组织中制备肽段的方法，其特征在于包括以下步骤：
S1：脱蜡：将连续的5~10张每张厚度5μm石蜡包埋切片置于1个2ml离心管内，加入1ml的100％二甲苯并孵育10分钟，每2分钟震荡涡旋1次，2500 g下离心10分钟，然后除去二甲苯溶液；再次添加1ml的100％二甲苯并重复上述步骤1次，上述步骤指孵育10分钟至除去二甲苯溶液；
S2：水化：步骤S1脱腊后加入1ml的100％酒精，并在室温下孵育10分钟，每2分钟震荡涡旋1次，2500 g离心10分钟去除酒精；
S3：依次加入1ml的70％酒精，并在室温下孵育10分钟，每2分钟震荡涡旋1次，2500 g离心10分钟除去酒精，再加入1ml去离子水，进行同样的上述步骤1次，离心后，将材料在室温下干燥5分钟；
S4：溶解样本：在S3得到的材料中加入0.5-0.7ml裂解缓冲液，裂解缓冲液组成为0.1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.1M二硫苏糖醇、质量浓度0.5%聚乙二醇20000、质量浓度1%十二烷基硫酸钠，并在加热震荡仪上以1200 rpm和99℃下孵育30分钟；
S5：将S4得到蛋白质溶液转移至Barocycler匹配试管内，放置于Barocycler固定位上，程序设置为95℃下，共60个循环，其中每个循环内40000psi，时间50秒，紧接着5000psi，时间10秒；
S6：程序结束，取出蛋白质溶液，转至2ml离心管内，4℃下16000g离心20分钟，吸取上清，将沉淀保存至-80℃冰箱；
S7：冷冻丙酮溶液沉淀蛋白质去除十二烷基硫酸钠分子对后续消化步骤的影响：按照冷冻丙酮和蛋白质溶液体积比3:1，冷冻在-20℃过夜沉淀蛋白质；
S8：4℃下16000g离心10分钟去除丙酮，再次按照4倍体积加入冷冻丙酮洗涤沉淀，4℃下16000g离心10分钟后去除丙酮，置于通风橱内完全干燥蛋白质沉淀；
S9：定量蛋白质：加入100μl~200μl的蛋白质溶解缓冲液，缓冲溶液为50mM 三乙基碳酸氢铵、8M尿素缓冲液，经过超声溶解后，4℃下16000g离心10分钟后保留上清，经过蛋白质定量后备用；
S10：肽段消化：根据步骤S9对蛋白质定量的结果，每含1 mg蛋白质裂解溶液中，加入终浓度为5 mM二硫苏糖醇，室温孵育10分钟后，加入终浓度为10 mM碘乙酰胺，室温下避光孵育20分钟，加入4倍上述总体积的50 mM 三乙基碳酸氢铵以及1%蛋白质总质量的胰蛋白酶，在加热震荡器上震荡至少12小时；充分消化的肽段经C18除盐后，-80℃冻干备用，上述总体积指代含有终浓度5mM 二硫苏糖醇和终浓度10mM 碘乙酰胺的1mg蛋白质裂解液的实际体积；
S11：磷酸化肽段的富集： 本步骤中富集总蛋白初始量1mg，对应使用10 μl琼脂糖珠，琼脂糖珠采用50 μl-100 μl/每1.5 ml EP 管；包括以下S11的子步骤S11A、S11B、S11C、S11D、S11E、S11F、 S11G；
S11A：活化的琼脂糖珠制备：包括以下S11A子步骤：
S11A1：500 μl的100 mM 乙二胺四乙酸孵育洗脱含镍的琼脂糖珠，室温下，旋转孵育盘上500转/分钟，2次，每次5分钟；
S11A2：500 μl 10 mM三氯化铁水溶液中孵育S11A1得到的琼脂糖珠，室温下，旋转孵育盘上500转/分钟，2次，每次5分钟；
S11A3：500 μl 80%乙腈 / 0.1%三氟乙酸孵育S11A2得到的琼脂糖珠，室温下，旋转孵育盘上500转/分钟，2次，每次5分钟；得到活化的琼脂糖珠；
S11B.：溶液重悬肽段：步骤S10中得到的已干燥的磷酸化肽段溶解在80%乙腈 / 0.1%三氟乙酸溶液中，终浓度为0.5 μg/μl；
S11C：每1 mg肽段混合物中移入活化的10 μl琼脂糖珠，在室温下，于孵育旋转器上结合30分钟以上；
S11 D：从琼脂糖珠上洗脱磷酸化肽段，包括以下S11D子步骤
S11 D1：用50 μl 80 %乙腈 / 0.1%三氟乙酸和100μl 1% 甲酸各洗涤琼脂糖珠2次；
S11 D2：pH7.0，500 mM磷酸氢二钠洗脱液70 μl从琼脂糖珠上洗脱磷酸化肽段，重复3次，收集全部洗脱液；
S11E： C18 小柱的预先制备：
100 μl甲醇洗涤2次，50 μl 50%乙腈 / 0.1%甲酸洗涤2次，100 μl 1%甲酸洗涤平衡C18 小柱2次；
S11 F：从C18 小柱洗脱磷酸化肽段：
将S11D2中全部洗脱液上样C18小柱后，100 μl 1%甲酸洗涤2次，然后用60 μl 50%乙腈/ 0.1%甲酸 从C18 小柱洗脱磷酸化肽段3次；
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| GR01 | Patent grant | ||
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