CN102238991B - 从福尔马林固定的组织中平行抽提不同的生物分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从相同的固定生物样本中平行分离/抽提各种生物分子，特别是核酸和蛋白质的方法。还涉及对本发明方法分离得到的生物分子进行定量和分析。还涉及一种从固定样本中平行分离/提取各种生物分子的试剂盒，以及该试剂盒的用途，该试剂盒用于疾病诊断、预后、决策和对疾病治疗的监测。

Description

从福尔马林固定的组织中平行抽提不同的生物分子
本发明涉及一种从相同的经固定的生物样本中平行分离/抽提各种不同生物分子(特别是核酸和蛋白质)的方法。本发明还包括：对本发明方法分离的生物分子进行定量和分析；用于从固定的样本中平行分离/提取各种生物分子的试剂盒；以及使用所述试剂盒对疾病的治疗进行诊断、预后、决策和监视。
目前，在福尔马林中固定组织可用于后续组织病理学测试(例如为了区分正常和病理组织)，这是标准化的操作方法。数十年来收集福尔马林固定的、石蜡包埋(FFPE)处理的组织，是无数诊断研究的来源。该组织涵盖了大多数器官组织，处于不同的疾病阶段的组织，处于治疗前、治疗中、治疗后的组织，以及更多的其他组织。FFPE组织的优点是可以非常好地保留组织形态。然而采用福尔马林固定组织会导致细胞中大分子严重交联，因此不可能用原来的方法从人或动物组织的单一样本中平行抽提核酸和蛋白质，而这是医疗或研究机构非常需要的，而且人们在数十年来一直在尝试和试验。
从单一样本中平行分离各种不同生物分子，比如蛋白质和核酸，是特别有利的，因为，首先，通常可获得的样品材料很少，不足以用于多次独立的纯化。其次，样本材料的物质组成是不均质的，例如某些肿瘤细胞夹在健康细胞之间。在这种情况下，由于分割样品不能保证每一个亚样本包含相同数目的同种细胞，因此不利于进行样本分离或分割。只有从不经分割的样本中平行分离生物分子(如DNA，RNA，和蛋白质)，才能够保证所有被调查(分析)的生物分子源自可比较的样本并且能相互关联。
目前从FFPE组织中分离核酸分子是常规做法，并且在文献中有详尽的描述。从国际专利申请WO2004/080578，WO2005/012523，WO2005/054466和WO2008/021419中都可以找到此类方法的实施案例。上述方法的共同特点是为了纯化核酸优先加入蛋白酶，以便同时破坏存在的蛋白质(如导致核酸降解的酶)。这些方法当然不可能从相同样本中对蛋白质进行同时/平行纯化或分离。
WO2006/127860描述了通过定向水解存在于FFPE组织中的蛋白质，对源自所述组织的肽段进行蛋白质水解制备。这包括用不同的缓冲液同时处理两个组织样本，以产生上述样本的肽图谱。从相同样本中同时/平行分离蛋白质和核酸没有被提及。
WO2006/122898揭示了，如果将所研究的样品先在含有去污剂的缓冲液中煮沸，接着于60℃以上的温度进一步温育，可以显著提高从固定组织中抽提蛋白质的效果。用这种方法处理样品，使分离的蛋白质可以在随后被定量。
WO2007/068764描述了一种方法，其中通过将固定的组织样本与含有亲核试剂的优选的水性溶液接触，从而使由于福尔马林固定引起的生物分子之间的交联更容易解开。用这种方法处理过的样品可以用于进一步分离蛋白质或核酸的纯化步骤。该申请没有描述从相同样本中平行/同时分离两种生物分子的方法。
本发明的目的是提供一种方法，该方法使得各种不同生物分子能够从固定组织的单一样本中获得并且在合适的情况下被研究。
所述目的是通过从交联固定的相同生物原料中平行纯化不同种类生物分子的方法以及实施所述方法的试剂盒来实现的，所述方法包括：
a)解开原料的所述交联的步骤，
b)将存在于原料中的不同的生物分子至少分为一个组分(A)和至少一个组分(B)的步骤，和
c)从步骤b)中的所述组分(A)和组分(B)中至少一个组分分离或/和检测不同的生物分子。
从属权利要求中包括了优选例。
令人惊讶的是，当实施已知方法(尤其是WO2006/122898中所描述的方法时)，(a)应用无蛋白酶的缓冲液，(b)使用去污剂，和(c)样品煮沸后，在60℃以上温度进一步温育50秒以上，结果发现组织中福尔马林造成的交联，仅在蛋白质中的所述交联得到充分解开。因此，只有蛋白质会以基本定量的方式通过迄今所述的方法得以分离，而同样存在于样本中的核酸并没有被释放或没有相对大量地被释放，却依然存在于样品的未溶解部分(undissolvedfraction)。由此导致的发现是，通过如离心或过滤等简单的机械分离步骤，就可以基本上将这些核酸从可溶的蛋白质组分中分离开。这样，根据本发明，“蛋白质态”和“核酸态”就可以从相同的原料中被各自分别记录到。这样，使用目前已知的核酸分离方法(如无RNA酶的FFPE和QIAampFFPE，都来自德国希尔登的凯杰公司)，可以从不溶的、已分离的组分中分离出核酸，这些方法包括：对不溶组分用蛋白酶处理以进一步破坏，和进一步的温育步骤。用这种方法，在一个提取步骤中就可以从一个相同的样本中初步分离出两类生物分子，并接着彼此分离，因而可以用于进一步(后续)的分析方法。
术语“生物分子”包括本领域技术人员已知的所有生物分子，例如天然或合成的核酸，如被引入到样本中的核酸，线性、分枝或环状的，单链或双链的核酸，RNA，特别是mRNA，siRNA，miRNA，snRNA，tRNA，hnRNA或核糖体，基因组、质粒或细胞器DNA，蛋白质，肽，经修饰的蛋白，以及传染源核酸、蛋白和肽，抗体，激素，生长因子，脂类，寡糖，多糖，糖蛋白，代谢分子和药物/药剂，但并不受此限制。
一个合适的生物学样本是任何适于固定的生物学样本，例如，含细胞的体液，如血液、精液、脑脊髓液、唾液、痰或尿，白血球层、血块黄层、排泄物、刮取物、穿刺液、皮肤碎片、生物整体或部分、器官、器官碎片、多细胞生物的组织或组织部分，优选昆虫或哺乳动物(尤其人)的组织和组织部分，例如以切片、活体切片、细针抽吸或组织切片的形式，分离的细胞(例如以贴壁或悬浮细胞培养的形式)、植物、植物的部分、植物组织或植物细胞、细菌、病毒、酵母和真菌，但并不局限于此。可以使用的特别优选的原料是来自于人体组织的组织切片。
生物样本可以使用本领域技术人员已知的任何固定剂来固定，特别是用酸，醇，醛、酮，或诸如其他有机物，尤其是戊二醛或甲醛。特别优选的生物学样品是用甲醛固定。根据本发明方法的一个优选例，使用用甲醛固定并用石蜡包埋的生物样本。
经福尔马林固定、石蜡包埋的组织(FFPE组织)，由于非常好地保持了组织形态，所以在世界范围内常规用于疾病和健康组织的病理学诊断。但是，用这种方法固定的组织中的大分子如DNA、RNA和蛋白质通常不再能充分研究。与科学家们长期以来的经验相反的，一种可以从FFPE组织中提取完整蛋白质的方法最近已经建立起来。Becker等人描述了一种精确检测临床组织样本中蛋白质表达量的方法(JPathol.211：370-8，2007)。这就使得临床研究人员能够定量分析FFPE组织中的蛋白质，并且与获得的临床数据相比较。
用于分析和/或检测用本发明方法所分离的核酸和蛋白质的方法，可以是本领域技术人员已知的任何方法，例如扩增技术，如：PCR，qPCR，RT-PCR，qRT-PCR，全基因组扩增，凝胶电泳，印迹技术，如Southern印迹，Northern印迹，以及免疫方法，如Western印迹，免疫沉淀或亲和层析法，微阵列分析，RFLP分析(限制性片段多态性分析)，SAGE(基因表达的系列分析)，测序，SNP分析(单核苷酸多态性分析)，突变分析，表观遗传学分析如甲基化模式分析，蛋白质/抗体阵列，免疫沉淀，高效液相色谱(HPLC)，快速蛋白液相色谱(FPLC)，表面增强激光解吸离子化SELDI或表面增强激光解吸离子化-飞行质谱SELDI-TOF，质谱技术，基质辅助激光解析电离化-飞行时间质谱(MALDI-TOF)，酶联免疫吸附分析(ELISAs)，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(特别是2维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D凝胶电泳))，毛细管电泳，利用酶的特定活性进行检测等等，但并不局限于这些方法。
本发明描述了一种从FFPE组织中平行分离生物分子和由此进行灵敏的定量分析的方法，优选的生物分子是蛋白质和核酸，如基因组(g)DNA或RNA，该方法可以从诸如临床活组织切片等的非常微量的样本开始着手。
根据本发明，平行分离是指，从相同样本(也就是从完全相同的原料)出发，在所有情况下纯化出多种不同生物分子，例如核酸和蛋白质，都得到纯化。为此，例如，在第一步先解开福尔马林造成的交联后，蛋白质组分和核酸组分彼此分离。生物分子(优选某特定组分中主要的生物分子)，从所述组分中的至少一个组分，(较佳地从每一个组分)中被分离出来。优选方案是，从可溶的组分中分离蛋白质，并从不溶的组分中分离核酸。将生物分子从组分中分离出来之后，可以同时或相继实施进一步分离。
本发明的分离方法，使核酸和蛋白质都能够从相同的原料中以基本定量的方式相互分离。例如，所述方法还使得基因的结构、序列、甲基化状态和/或基因的表达，能够与组织中蛋白质的状态进行比较。
本文描述的方法可以被使用，例如，在被探究的组织具有复杂结构和调节机制的情况下，记录体内对于诊断和治疗有重要作用的标志物。一个此类重要标志物的例子是表皮生长因子受体(EGFR)，包括它在肿瘤组织中的蛋白质表达和DNA突变图谱。
本发明的方法可以用于临床研究和基础研究。更为重要的是，本文描述的从福尔马林固定组织中分离生物分子的方法可以以最可行的方式合并到日常临床程序中。这样就可大体上使用更精确的诊断和治疗方法。
本文描述的发明，涉及从固定的生物样本(如组织样本)中提取蛋白质和核酸的实质性优化，以便用于后续分析(特别是对所述蛋白质和核酸进行定量)。上述优化与目前的临床研究和实验研究中的高通量方法(如蛋白质阵列和实时PCR方法)是相容的。例如，来自疾病不同阶段和不同病程的样本都可以用这种方法对其中的生物分子进行分析和定量，因而也允许进行回顾分析。
本方法能够使来自相同原料的完整蛋白质和核酸被检测和定量。来自完全不同细胞区室(如细胞核，细胞质或细胞膜)的蛋白质，可以进行可靠的分离和定量分析。分离的完整蛋白质可以进行稀释，即系列稀释并建立内标曲线。这样可以保证蛋白质的检测和定量在线性范围内进行。如果有必要，可以先用Western印迹的方法进行蛋白测试，以保证所使用的检测方法间没有交差反应，比如抗体(Western印迹中仅有一条大小正确的特异性条带)。用本文所述方式分离的可定量的完整蛋白，以最可行的方法补充了免疫组化分析(如那些已经在日常临床实行的分析)的结果。这样就可以对完整蛋白质进行准确、灵敏地定量，并且将蛋白质按细胞分配给固定组织(免疫组化)。同时，所记录的蛋白质状态，可以与组织中的蛋白质表达谱相比较，或与各表达基因的数量相比较。已知的疾病标志物，如乳腺癌病人的Her2/neu，可以在临床上在表达水平和翻译水平上被准确测定。另外，使用常用的检测方法(如质谱或定量PCR)来分析表达基因和/或分离的完整蛋白，通过比较健康组织和疾病组织，可以鉴定出新的疾病标志物。用本发明方法可以同样地用于研究动物组织。对于许多人类的疾病如癌症，已经有动物模型。待研究的组织要典型地用福尔马林固定，石蜡包埋，并进行组织病理学评估。本发明的方法，可通过例如蛋白质阵列和定量PCR对上述模型中已知或新的疾病标识物进行准确、灵敏、有效的定量。
根据本方法，在早期的方法步骤中，组织中存在的蛋白质就以基本定量的方式与所述组织中存在的核酸分开。
根据本发明，术语“以基本定量方式”指，分离步骤后获得两个不同的组分，两个组分都包含有组织中原始存在的生物分子，其中组分(A)包括50％以上的总可溶性蛋白(即所有可从组织中分离的蛋白质)但少于50％的总可分离的核酸；而在分离步骤后的另一组分(B)中，保留少于50％的总可溶性蛋白质和多于50％的核酸。优选地，经分离步骤后，组分(A)包含60％以上，较佳地70％以上，更佳地甚至75％以上，最佳地至少80％可从组织中分离的总蛋白质；而组分(B)包含60％以上，较佳地70％以上，更佳地75％以上，最佳地至少80％可从组织中分离的总核酸。在第一个分离步骤后，所述核酸有可能仍结合于组织的不溶组分。
根据本发明，术语“分离”指有关的生物分子与原料的其他组分分开，并不需要对上述生物分子进行完全或大致纯化。这样，分离的生物分子是指这样的生物分子：它不再存在于其原始、自然的环境(例如存在于细胞内)而是从原始环境中移出，并且其他细胞组分已经至少被部分与其分开。例如，通过破细胞和随后的离心，从而将可溶组分与不溶组分分开，这就代表了分离可溶细胞组分的一个步骤。
术语“纯化”是指，对已经与其他细胞组分分开的生物分子(分离的生物分子)再进行至少一次进一步的纯化步骤，以便至少部分地除去污染物(杂质)。例如，通过色谱方法纯化或其他通过透析其他可溶的细胞组分的方法，可对可溶性蛋白质进行纯化。在本文中，纯化并不是意味着经纯化后的蛋白质不含任何种类的污染物。相反地，只要由于所述纯化步骤，所述生物分子对其他污染物的比例提高了，那么生物分子就被称为“经纯化的”。
术语“可移除的”或“可溶解的”指，生物分子可以通过适合的方法得到分离。所述术语可以用于不同种类的生物分子(比如蛋白质或者核酸)，且可以用于能通过合适的处理从原料中分离得到的生物分子的数量。这里需要注意的是，生物分子可以被称为“可移除的”，尽管生物分子仍在聚集体内(也就是说，还没有被溶解但是可以被适当的方法溶解例如细胞膜蛋白质)。
下面更详细地描述本发明方法的各个步骤：
使用的原料可以是任何包含有生物分子的材料，优选使用固定的原料。特别优选的是使用福尔马林固定的组织，特别是FFPE组织。当使用FFPE组织时，优选首先进行脱石蜡。可以手动地采用组织显微切片机或组织打洞机，或者用激光解剖的方法，将所要研究的组织区域从组织切片中分离出。
优选例中首先进行的脱石蜡的过程，会明显影响可达到的生物分子的收率。脱石蜡通常是为了移除包埋生物样本时所用到的石蜡。一般来讲，所述石蜡在以下情况下可能会造成麻烦：首先当生物分子溶解和分为各组分时，其次当生物分子进一步纯化和分析时。样品通常通过在有机溶剂(如二甲苯和/或乙醇)中温育而除去石蜡。在此过程中，样本一般首先在二甲苯中温育一次或多次，然后在100％乙醇中以及随后在稀乙醇(合适的话)中温育一次或多次，从而除去所述二甲苯。也可以使用其他的有机溶剂脱石蜡，比如烷烃类(特别优选庚烷)，或者其他醇类例如甲醇。基于在烷烃(如庚烷)和添加醇(特别优选甲醇)中温育而进行的脱石蜡，已经被证明在用所述方法获得高收率的高质量的生物分子方面是很有优势的。
首先，根据本发明方法的步骤a)，存在于原料中的交联特别是生物分子的交联，至少被部分解开。
为此，一个合适的实施例包括：
(i)将原料(合适的话在脱石蜡步骤之后)转至有利地含有去污剂、不含蛋白水解活性物的水性体系中。例如，为了保证蛋白质的完整，不应使用蛋白酶诸如胰蛋白酶或蛋白酶K。例如可以使用含有下面列出有益物质的水性溶液或缓冲液。
(ii)存在于溶液(例如缓冲液)的物质，被加热至一定温度，此温度足够释放存在于其中的可移出的蛋白质。较佳地，首先将材料煮沸(从95℃加热至100℃)。温育时间可以改变，比如从5分钟到40分钟。煮沸时间视情况而定，例如样本大小。
(iii)将样本置于60℃以上的温度(如80℃)温育。在大于60℃温度下的温育时间可以不同，如从1小时至6小时。大于60℃的温育时间最好是至少20分钟，然而最好是少于16小时。这样会使足够数量的完整蛋白质得到释放，使得能够直接检测、分析和/或定量。
本发明方法的一个优选例中，步骤(i)中用到的水性体系可以是一种水性溶液，特别是缓冲液。
适合于本发明的缓冲液或缓冲体系，通常其特定pH在1.0-12.0范围内，优选1.0-9.0之间。
水性体系优选含有至少一种还原剂，优选二硫苏糖醇(DTT)。我们发现，使用还原剂(尤其是使用DTT)，对分离完整蛋白质的产量是非常有利的。该实施方式的特殊优点是，可以通过本领域技术人员已知的市场上可以获得的蛋白质定量分析产品，如BioRad或(Pierce)，对所获得的溶解产物可直接进行定量，并可用于进一步分析。无需进行样品稀释。这就可以避免测量不精确，保证等量的蛋白质用于下一步分析(如Western印迹)。
此外，缓冲液还可以额外地包含还原剂，如1，4-二硫代-DL-苏糖醇，二硫赤藓糖醇(DTE)，三(2-羧乙基)膦(TCEP)，或乙醇胺(MEA)。
还原剂的使用浓度为0.05mM到20mM，较优的是0.1mM到10mM，更优的是0.5mM到5mM，最优的是0.5mM到2mM。在各个实施例中，在此范围内的最适浓度视所用试剂而定，DTT的特别合适的浓度是1mM。
用于本发明方法的去污剂可以为本领域技术人员已知的适用于细胞裂解的任何去污剂，较优的是阴离子或非离子型去污剂，更优的是包含磺酸基的去污剂，特优的是十二烷基磺酸钠(SDS)、脱氧胆酸钠、3-[N-(3-胆酰丙基)-二甲氨基]-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)、TritonX-100、诺乃P40(NonidetP40)或者Tween20。
例如，去污剂的浓度为约0.1-10％。特别优选的浓度范围为约1-5％。
此外，水性体系最好含有至少一个亲核试剂。此处合适的亲核试剂可以为任何能够转移电子至路易斯酸一个或多个空轨道的路易斯碱。在上述路易斯碱中，特别优选具有至少一个功能基团的试剂，该功能基团载有负电荷，是负极化的或者具有至少一个自由电子对。
含有携带负电荷的功能基团的化合物的例子是：碱金属或碱土金属的醇盐，碱金属或碱土金属的氢氧化物，碱金属或碱土金属的卤化物，碱金属或碱土金属的氰化物，等等。
具有至少一个被负极化的功能基团的试剂，特别的是那些含有至少一个包括两个共价连接的原子的功能基团的试剂，其中两个共价连接原子的根据Alfred和Rochow得出的电子负性差异，至少为0.25，更优的是至少为0.5，最优的是至少为1.0。
但是，根据本发明，特别优选的亲核试剂是具有至少一个功能基团的化合物，该功能基团有一个或两个(特别优选有一个)自由电子对，这些化合物中最优选的是那些具有至少一个结构式I所示的伯胺、仲胺、叔胺基团的化合物。
其中，R1为C1-C20烃基，优选C2-C15烃基，特别优选C2-C10烃基；具有至少一个杂原子的C1-C20烃基，优选具有至少一个杂原子的C2-C15烃基，更优的是具有至少一个杂原子的C2-C10烃基，或可任选地被杂原子取代的芳环系；R2为C1-C20烷基，优选C1-C10烷基，特别优选C1-C2烷基，特别是甲基或乙基；也可以为C1-C20羟烷基，优选C1-C10羟烷基，特别优选C1-C2羟烷基，或者氢原子，最优的是氢原子；而且R3是C1-C20烷基，优选C1-C10烷基，特别优选C1-C2烷基，特别是甲基或乙基；也可以是C1-C20羟烷基，优选C1-C10羟烷基，特别优选C1-C2羟烷基或氢原子，最优是氢原子。
具有本发明特别优选的上述结构式I的功能团的亲核试剂具有至少含有一个结构式I所示的功能基团，其中在结构式I中R2和R3中的至少一个(优选R2和R3两个都)是氢原子。此外，特别优选的亲核试剂具有至少一个结构式I功能基团，其中氮原子仅与sp3杂合的R1、R2和R3基团中的原子共价连接。更具体地，R1、R2和R3基团都不能使氮原子上的自由电子对脱离分别转移至R1、R2和R3基团。优选地，所述R1、R2和R3都不具有结构式II：
本发明特别优选的具有至少一个结构式I功能基团的亲核试剂选自下组：甲胺，乙胺，乙醇胺，正丙胺，正丁胺，异丁胺，叔丁胺，二甲胺，二乙胺，二乙醇胺，二正丙胺，二异丙胺，二丁胺，三甲胺，三乙胺，三乙醇胺，六亚甲基四胺，2-乙基己基胺，2-氨基-1，3-丙二醇，己胺，环己胺，1，2-二-甲氧基丙胺，1-氨基戊烷，2-甲氧基丙胺，三(羟甲基)-甲胺，氨基羧酸(特别是甘氨酸或组氨酸)，或氨基胍，其中优选乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，氨基-1，3-丙二醇，氨基胍，和三(羟甲基)甲胺。此外，优选的具有至少一个结构式I的功能基团的亲核试剂为选自下组的芳香胺：苯胺，甲苯胺，萘胺，苄胺，二甲苯胺，苯二甲胺，萘二胺，甲苯二胺，3，3’-二甲基-4，4’-二氨基联苯，苯二胺，2，4’-亚甲基双苯胺，4，4’-亚甲基双苯胺，磺基二苯胺和二甲基苄胺。
在一优选例中，亲核试剂具有至少一个结构式I所示的伯氨基团。所述亲核试剂是C1-C6烷基胺，C1-C6烷基二胺，C1-C6烷基三胺，C1-C15氨基醇，C1-C15氨基二元醇或C1-C15氨基羧酸。
在另一优选例中，亲核试剂是包含氮原子的杂环化合物，选自下组：吡咯，嘧啶，噻啉，吲哚，氮杂环戊烷，氮杂环己烷，吗啉，哌啶，咪唑，或这些化合物的衍生物，其中这些化合物的衍生物优选这样的衍生物：C1-C3烷基(特别优选甲基和乙基)而不是氢原子与以上列出的化合物中的一个或多个碳原子或氮原子键合所得到的衍生物。
在上述亲核试剂中，特别优选的是那些水溶性的，特别是在25℃，pH为7的条件下，在水中的溶解度至少为1g/l，较优的是至少10g/l，特优的是100g/l的亲核试剂。
含有上述亲核试剂的水性体系可以以纯水(优选去离子水)为基础，或以其他水性体系为基础，特别是水和有机溶剂(如醇)的混合物，特别是水和甲醇或乙醇的混合物。优选地，水的量至少为50wt％，特别优选至少75wt％，最优的至少90wt％，以上每种情况都基于水和有机溶剂、生理盐水、缓冲液的总重量。特别是包括有以下本领域技术人员已知的缓冲液组分的缓冲液，如TRIS、HEPES、PIPES、CAPS、CHES、AMP、AMPD或MOPS，这些缓冲组分量的范围从0.1-1000mmol，特别优选1-500mmol，最优选10-200mmol。在合适的情况下，这样的缓冲组分，根据其结构，还可以同时用作亲核试剂。此外营养介质(如MEM培养基和DEME培养基)，也可以用作水性体系。优选地，含有亲核试剂的水性体系可以用以下方法制备：将水或者相应的水性体系与亲核试剂简单混合。
亲核试剂在水性溶液中的浓度优选在0.1-10000mmol之间，较优的是1-5000mmol，更优的是5-2500mmol，最优的是20-1000mmol。根据本发明方法的特别有益的实施例，水溶液中亲核试剂的浓度大于20mmol，特别优选大于50mmol，最优的是大于100mmol。
依照本发明，具有蛋白质水解活性的化合物可以是任何可以分解蛋白质的化合物，例如蛋白质水解活性的酶，如蛋白酶，特别是蛋白酶K，胰蛋白酶，糜蛋白酶，木瓜蛋白酶，胃蛋白酶，链霉蛋白酶(pronase)和胞内蛋白酶Lys-C。此外依照本发明，具有蛋白质水解活性的物质还可以是可分解蛋白质的非酶类物质，如溴化氢。
根据本发明方法的步骤b)，将存在于原料中的不同的生物分子分为至少一个组分(A)和至少一个组分(B)。
优选地，所述组分被分为至少一个可溶的组分(A)和至少一个不溶的组分(B)。尽管有可能将包括可溶的和不可溶的组分的整个样本分为至少两部分，接下来又可以从这些组分中分离或纯化出不同的生物分子，或者从中检测或分析不同的生物分子，但是优选在步骤(a)之后将样本分为至少一个可溶的组分(A)和至少一个不溶的组分(B)。
本发明方法步骤(a)和步骤(b)优选例的一个优点是：存在于可溶的组分(A)中的被提取/分离的基本上完整蛋白质可以在步骤c中被分析、定量或者被分离，甚至无需进一步的纯化步骤。具体地，可用一种或多种方法对提取的蛋白质进行细分。但是，仍然可以将存在于组分(A)中的蛋白质从其他可溶性细胞组分中纯化出来，或者将各蛋白质从存在于组分(A)中其他蛋白质中纯化出来，然后再进行检测、分析或分离。
优选含有不溶成分的组分(B)，宜在步骤d)中进一步处理，以裂解不溶的样本组分，并且适宜的话，用于解开生物分子的交联。依然存在于不溶组分(B)中的可移除的核酸，可以在该进一步处理步骤中得到分离。
根据步骤d)，适当的处理方法是指可将核酸从固定组织中移出的任何已知方法。例如，国际专利申请WO2007/068764，WO2008/021419，WO2005/012523或WO2005/054466中描述的方法，或者是借助市售试剂盒(如RNeasy和QIAamp都产自德国希尔登的凯杰公司)可以实行的方法。使用后者，组分(B)中的不溶成分须经至少一个进一步加热步骤和蛋白酶处理。所述蛋白酶的处理可以导致有效裂解，从而释放可移出的核酸。
蛋白质被分离和任选地被纯化，而核酸也独立地被分离和任选地被纯化。组分(A)和组分(B)可以同时但相互独立地进行进一步处理，或相继进行处理。
蛋白质可以用色谱法、电泳分离、特异结合于结合蛋白质的物质、借助特异性抗体对蛋白质捕获、或沉降的方法进行纯化和分离。
组分(B)经过进一步热处理和蛋白酶处理后，核酸可以得到分离和纯化，分离纯化的方法可以是简单沉降，可以是将核酸结合到可以与核酸结合的物质上，电泳或色谱，或者是本领域技术人员熟知的类似的合适方法。优选采用WO2007/068764或WO2008/021419中描述的方法或者是借助RNeasy或QIAamp试剂盒(都产自德国希尔登的凯杰公司)，根据本文所述的方法对所述核酸进行纯化。
可以使用上述提到的任何分析方法进行分析。较好地，蛋白质宜用Lowry或BCA进行定量，其他定量方法(特别是蛋白质阵列)也可以用于定量。核酸可以用任何合适的方法进行定量，例如定量PCR，测定浓度已限定的稀释液在260/280nm的光学密度，或者使用已定量的核酸进行电泳比较。
此外，提取的蛋白质可以用任何蛋白酶进行处理，如胰蛋白酶，糜蛋白酶，蛋白酶K，木瓜蛋白酶，胃蛋白酶，链霉蛋白酶，胞内蛋白酶LysC，胞内蛋白酶GLu-C，或糖苷酶(如内切糖苷酶H、糖苷酶F、唾液酸苷酶)，或磷酸酶。
有利地，蛋白质可以用于做至少一个生化分析。优选的生化分析的例子是蛋白质阵列，比如微阵列，特别是夹心免疫阵列、抗体捕获阵列或者直接的蛋白质阵列。
生化分析可以优先用于测定一个或多个诊断学或临床学上相关的标志蛋白质。例如，这可能涉及到对来自于至少两个生物样本的标志蛋白进行相互比较。这就有可能将疾病和健康区别开。此外，为了分析至少一个或更多的相关标志物，可以进行复杂度更高的分析。
核酸可以不受限制地用于任何一个已知的分析方法，尤其上面提到的方法。
本发明还提供一个试剂盒，此试剂盒用于从福尔马林固定的人类或动物生物样本(如组织)中可靠、高产地分离完整蛋白质和核酸。所述试剂盒的组分至少包括，(1)无蛋白酶的水性体系优选缓冲体系，它用于解开原料的交联，(2)去污剂(可以存在于溶液(1)中)，和(3)含蛋白酶的溶液或蛋白酶。试剂盒的进一步组成还可以包括：(4)至少一种可结合核酸的物质，(5)用于分离核酸的其他溶液或缓冲液，优选结合缓冲液和洗脱缓冲液。试剂盒中可以包含更加详细的、从福尔马林固定组织中分离蛋白质和核酸的实验方案说明。
试剂盒中包含的水溶体系(1)，对应于与上面描述的水溶体系，可含有上述的所有可能的组分。
下面的例子用于描述本方法的优点。例如，已表明，药物易瑞没有显著提高非小细胞肺癌(NSCLC，一种最普遍的肺癌种类)病人的存活率。总的来说，这种EGFR抑制剂只对十分之一的病人有效。在妇女、非吸烟者，亚裔病人中，其抑制肿瘤发生的效果可以观察到。原因是这些病人携带有EGFR基因突变，造成对易瑞的敏感。相反，此受体的过表达仅占小部分，但却是新药开发中决定性的标准。应用合适的方法，有可能在相同样本中分析这些突变和表达，却不会造成很大损失，这样就确定了那些病人经易瑞治疗后会产生响应(疗效)。这样可以避免大量取样，或在每一个案例中避免取两个样本用于分离DNA和蛋白质。
既然未来将会有越来越多的靶向治疗，必将平行开发相对应的诊断。从FFPE组织的提取物中平行分析核酸(特别是DNA，RNA)和蛋白质，将在预测给药中起重要的作用。此处有必要对所述分子定量，也就是确定各组分的表达水平或翻译速度或以上两个参数，以及检测后者是否存在基因序列的修饰(突变、缺失)。
实施例
实施例1：用本发明方法分离生物分子
本实验使用来自大鼠肺部的福尔马林固定、石蜡包埋的组织样本(FFPE样本)。用显微薄片切片机，从上述组织中制得约10μm厚的切片，每一个样本使用两个切片。接下来使用RNeasyFFPE试剂盒、QIAampFFPE试剂盒、QproteomeFFPE试剂盒和AllprepDNA/RNAMini试剂盒(凯杰公司)，从所述FFPE切片中分离蛋白质和DNA/RNA。
首先使用常规方法对组织进行脱石蜡处理。例如，样本先在二甲苯中温育10分钟。样品沉淀后，去除上清，所述二甲苯处理重复两次。如上所述，将每一个例子中的样品采用100％乙醇，96％乙醇，70％乙醇处理两次。
得到的脱蜡样本沉淀物与100μlEXB缓冲液(凯杰公司)混合，100℃煮沸20分钟，以释放全长蛋白质。然后将样品在80℃再温育2个小时。用这种方法，蛋白质便从样本中释放出来，福尔马林导致的交联也被解开。样品经所述创造性的处理后，核酸并没有释放到溶液中，或者有微不足道的释放，可以经离心(如在14000xg离心15分钟)有选择地沉淀下来，而蛋白质在上清中保持可溶，通过移出上清就可以与上述沉淀分离。除了核酸沉淀之外，完全不溶的组分也与核酸一起移出，然而这些组分不会对DNA和RNA的进一步纯化造成影响。
为了明确两个组分中各种生物分子(蛋白质和核酸)的存在，处理过的样品经离心后，首先要先将上清移出，然后独立于沉淀地用于进一步分析和检查。使用三个样本来检查组分中生物分子的分布。样本一，从上清和沉淀物中分离蛋白质；样本二，从上清和沉淀物中分离DNA；样本三，从上清和沉淀物中分离RNA。
样本一中的上清不经进一步处理用于分析存在于其中的蛋白质。
为了分离样本二中的DNA，其上清与200μl离液裂解缓冲液混合(例如凯杰公司的RBC缓冲液)，并将此混合液上样于硅胶膜(如凯杰公司的AllprepDNA柱)，以10000rpm离心1分钟使混合液通过硅胶膜。离液剂的加入创造这样的条件：即DNA能够结合到硅胶膜上，而RNA不能。所述硅胶膜再如下进行洗涤：用500μl含有胍盐的洗涤缓冲液AW1清洗，接下来用500μl含乙醇的洗涤缓冲液AW2清洗，最后用500μl100％乙醇清洗。14000rpm离心5分钟使膜干燥。使用30μlDNA洗脱缓冲液(例如，使用凯杰公司的ATE)，温浴1分钟后进行离心，将DNA洗脱下来。
相似地，从样本三中分离RNA。首先将上清与200μl离液裂解缓冲液(例如凯杰公司的RBC缓冲液)混合，然后将上述混合液上样于硅胶膜上(如凯杰公司的AllprepDNA柱)，以10000rpm离心1分钟使混合液通过硅胶模。由于上述混合液的组成成分会使DNA而不是RNA结合到所述硅胶膜上，所述RNA存在于通过柱子的流穿液(flowthrough)中。为了调节RNA的结合条件，上述流穿液与乙醇混合，然后再一次上样于硅胶膜(如凯杰公司的RNeasyMinElute柱)，以10000rpm离心1分钟使其通过硅胶膜。硅胶膜如下进行洗涤：使用500μl含有胍盐的洗涤缓冲液RW1清洗，然后使用500μl含有乙醇的洗涤缓冲液RW2进行清洗。14000rpm离心5分钟使膜干燥。使用30μl水，温浴1分钟后进行离心，将RNA洗脱下来。
根据本发明处理的样本，经过离心，所获得的三个样本的沉淀部分也用于分离蛋白质(样本一)，DNA(样本二)，和RNA(样本三)。
为了分离蛋白质，样本一中的沉淀物溶解在合适的蛋白质裂解缓冲液中，如含有去污剂的哺乳动物蛋白质裂解缓冲液，并用于进一步分析。
为了分离DNA，样本二中的沉淀与常规的DNA裂解缓冲液混合，例如，凯杰公司的180μl含有去污剂的缓冲液ATL。由于沉淀中含有的组分，在前处理时没有被完全溶解，为了溶解所述未被完全溶解的组分，通过加入蛋白酶(如20μl蛋白酶K)再进一步裂解。56℃温育1小时，然后90℃温浴10分钟，裂解物与含离液剂的结合缓冲液(如凯杰公司的AL缓冲液)混合，混合液上样于硅胶膜(如凯杰公司的QIAampMini硅胶柱)，10000rpm离心1分钟，使得其通过膜。如上所述，硅胶膜再用洗涤缓冲液AW1和AW2以及100％乙醇进行清洗，干燥硅胶膜，并将DNA洗脱下来。
为了分离RNA，样本三中的沉淀与常规的RNA裂解缓冲液(如凯杰公司的150μl含有去污剂的缓冲液PKD和10μl蛋白酶K)混合。56℃温育1小时，然后80℃继续温育15分钟，裂解物与含离液剂的结合缓冲液(如凯杰公司的RBC缓冲液)混合，上述混合液上样于硅胶膜(如凯杰公司的RNeasyMinElute硅胶柱)，10000rpm离心1分钟，使其通过膜。如上所述，硅胶膜用洗涤缓冲液RW1和RW2过柱洗涤，再将膜干燥，并将RNA洗脱下来。
为了确定用这个方法从两个组分(上清和沉淀)中分离的蛋白质和核酸的分布情况，使用合适的方法对两组分中的生物分子进行定量。采用BCA法，根据厂商(Pierce)提供的信息测定存在的蛋白质产量，通过测量260/280nm吸光值分别确定DNA和RNA的产量和纯度。表1记录了多次检测的平均产量。
表1
结果表明，使用本发明的方法，生物分子在下游纯化之前就得到了明显分开。蛋白质在上清中占绝对优势，核酸则主要存在于沉淀中。
实施例2：对本发明方法分离的生物分子进行凝胶分析。
采用凝胶分析方法进一步分析用实施例1中的方法从沉淀组分和上清组分中分离出来的DNA、RNA和蛋白质。
分离自两个组分的相同体积的蛋白质，用常规方法进行分析，用SDS聚丙烯酰胺凝胶，随后进行考马斯亮蓝染色。在这种情况下，蛋白只有在上清组分中是可见的，沉淀组分中没有任何可见蛋白质。
分离自两个组分的相同体积的核酸，用常规方法进行分离，用TAE琼脂糖凝胶电泳和EB染色。结果示于图1。在所有情况下，经EB染色的胶显示的是组分中和参照物中的DNA或RNA片段，它们可以通过分布于一定大小范围内的亮“弥散带”(smear)来鉴别。从FFPE样本中分离的核酸总是片段化的，这是由于样品在固定、包埋和储存中所述核酸已经降解的缘故。也很容易观察到，沉淀组分比上清组分中明显具有更多的DNA和RNA。
实施例3：实时RT-PCR分析用本发明方法分离的RNA
为了研究本发明的方法在分离核酸和通过扩增方法进行分析的效果，采用实时RT-PCR的方法，对实施例1中描述的方法从沉淀组分和上清组分中分离出的RNA进行进一步分析。
在所有情况下，所分离的RNA一式两份用于检测madH7转录物的扩增子。在所有情况下洗脱液与水进行1∶5稀释，取5μl上述溶液用于实时PCR。扩增总体积为25μl，使用合适的实时RT-PCR扩增试剂盒(mastermix)，如凯杰公司的QuantiTectSYBRGreenRT-PCR试剂盒，并根据其使用手册进行扩增操作。在合适的实时扩增仪(如来自ABI的7700)上进行扩增。测得到的ct值用来确定平均值和标准偏差。结果显示在表2中。
表2
组分 平均ct值 标准偏差
沉淀 24.7 0.26
上清 28.1 0.25
结果表明，用本发明方法分离的RNA，尤其是从沉淀组分中分离的RNA，非常适用于扩增分析。这进一步证实，大部分RNA存在于沉淀组分中，只有很少一部分能在上清中检测到。
总之，蛋白质和核酸的产量测定和进一步分析都证明：使用本发明方法，生物分子在下游纯化前就得到了很好的分离。蛋白质在上清中占绝对优势，而核酸主要存在于沉淀组分中。

Claims (14)

1.一种从相同的、经交联固定的生物原料中平行纯化不同种类生物分子的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
a)利用含有去污剂且不含蛋白水解活性化合物的缓冲液解开原料中所述交联的步骤，
b)将存在于原料中不同的生物分子至少分为一个可溶的组分A和至少一个不可溶的组分B的步骤，和
c)从步骤b)的所述组分A和组分B中，分离和/或检测/分析不同的生物分子，
其中，所述组分A和组分B的分离，导致从原料中至少可释放的蛋白质与至少可释放的核酸发生分离，其中可溶的蛋白质存在于组分A中，而可溶的核酸存在于组分B中。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)中原料中交联的解开是通过以下步骤实现：
(i)将原料转移到含有去污剂且不含蛋白水解活性化合物的缓冲液中，
(ii)在足以释放可溶蛋白质的温度下，在所述缓冲液中温育(i)所得的材料，
(iii)随后在60℃以上的温度下进一步温育。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(i)所用的缓冲液是水性的。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤(ii)中，所述的材料在溶液中煮沸。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，组分A包括50％以上的总可溶性蛋白但少于50％的总可分离的核酸；组分B中保留少于50％的总可溶性蛋白质和多于50％的核酸。
6.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤c)中不同的生物分子分离是如下进行的：借助于常规的蛋白质纯化或蛋白质分离的方法，将蛋白质从组分A中纯化/分离出，以及通过步骤d)进一步将核酸从组分B中分离出来，所述步骤d)包含有至少一个裂解不溶样本成分的进一步处理步骤和/或进一步解开原料中依然存在的交联的步骤，以及分离可溶的核酸的步骤。
7.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，通过色谱法、电泳分离、特异性结合于可结合蛋白质的物质、借助特异性抗体的蛋白质捕获法、或沉淀法来纯化/分离蛋白质；以及通过沉淀法、结合于可结合核酸的物质、电泳或色谱法来分离核酸。
8.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，通过免疫法、色谱法、测序或电泳来检测/分析蛋白质；通过特异性PCR、电泳、杂交法或测序来检测/分析核酸。
9.一种用于实施权利要求1-8中任一项所述方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括：
(1)用于解开原料中的交联且不含蛋白酶的水性体系；
(2)去污剂，所述去污剂可任选地存在于所述水性体系中，和
(3)含有蛋白酶的溶液或蛋白酶。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述水性体系是缓冲液体系。
11.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还额外地包括：
(4)至少一种与核酸结合的物质，
(5)用于分离核酸的另外的缓冲液。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述另外的缓冲液是结合缓冲液和洗脱缓冲液。
13.如权利要求9-12中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述水性体系是含有至少一种还原试剂、至少一种去污剂和至少一种亲核试剂的缓冲液。
14.权利要求9-13中任一项所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于分析和/或定量生物样本中含有的生物分子。
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