CN108059649A - 蛋白组基因组分析系统和方法 - Google Patents

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Abstract

从福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的单个组织样品切片分离核酸和蛋白质分子的方法，包括裂解组织样品切片的细胞，烷基化、还原和酶促消化裂解物中的蛋白质，并将存在于裂解物中的核酸与经消化的蛋白质分离。在允许提取适用于基因组和蛋白质组分析的DNA、RNA和蛋白质的条件下进行细胞裂解。特别地，裂解反应的缓冲条件、反应时间和温度使得释放适量的DNA、RNA和蛋白质，并且处在用于分离和蛋白组基因组分析的稳定条件下。用于进行方法的系统包括用于进行该方法的步骤的试剂和设备。用于检测肽的存在和表达水平以区分疾病状态的组包括多个肽。

Description

蛋白组基因组分析系统和方法
背景
1.技术领域
本公开涉及从生物样品中分离核酸和蛋白质分子，更具体地涉及用于从福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织的单个切片分离蛋白组基因组物质的系统、方法和产品。
2.相关技术
福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织是临床样品保存和归档的常用方法。用超薄切片机或低温恒温器将FFPE组织样品切成组织薄片，并分析病理学、组织学和分子生物学特征，以诊断疾病和其他组织病况。
历史上曾认为FFPE样品不是分子分析的合适来源。然而，最近已经发现，通过适当的处理，可以从FFPE样品中分离足量的DNA或RNA。纯化的核酸甚至可以适用于下游的基因组和基因表达分析，如聚合酶链反应(PCR)，定量逆转录PCR(qRT-PCR)，微阵列，阵列比较基因组杂交(CGH)，微RNA，下一代测序(NGS)和甲基化图谱分析。FFPE样品也可以经处理以分离适用于下游蛋白组分析(包括质谱(MS)或免疫测定)的蛋白质或肽。
适用于分离某些细胞材料的FFPE处理技术和试剂是否适于分离其它细胞材料，这并不知晓。例如，FFPE样品处理中用于分离核DNA的苛性去污剂和其他反应条件(如时间和温度)并不适合分离适用于分析的蛋白质或RNA。类似地，使用最适于蛋白质分离和分析的温和试剂或反应条件是否足够用于纯化核DNA并且是否可能破坏RNA，这也不知晓。同样，分离用于进一步分析的RNA的条件并不适于分离和分析DNA和蛋白质。
为了避免这些和其他问题，已经分别处理了独立的FFPE切片以分离和分析DNA、RNA和蛋白质。使用独立切片的主要缺点是获得误导性或冲突性基因组和蛋白质组数据的风险。例如在一些情况下，即使相邻或连续的切片含有的细胞也具有不同基因组和蛋白质组谱。此外，活检组织样品通常很小，使得可用的切片机或低温恒温器的切片数量有限。对于每个测定使用独立的切片可能减少用于后续研究的组织样品的供应。
因此，需要解决本领域已知的上述缺点和其他缺陷中的一些或全部的系统、方法和产品。
简述
本公开内容的实施方案采用从福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织样品中分离核酸和蛋白质分子的系统、方法和产品，解决了本领域的一个或多个前述或其它问题。说明性的实施方案包括从FFPE组织样品的单个薄切片中提取DNA、RNA和蛋白质。该方法可以包括提供具有包含核酸(例如DNA和/或RNA)和蛋白质的多个细胞的生物样品。该方法可以包括在允许提取适于分子生物学分析的核酸和蛋白质的条件下制备细胞的裂解物，使得裂解物含有核酸和蛋白质。例如，在一些实施方案中，生物样品(例如组织切片)可以在裂解缓冲液中孵育。裂解反应的缓冲条件、反应时间和/或温度可以经改变或配置而释放适量的核酸和蛋白质并且处于用于分离和蛋白组基因组分析的稳定的条件中。
在一些实施方案中，该方法可包括对裂解物中的蛋白质(依次)烷基化、还原、稀释和/或酶促消化。合适量和/或类型的烷化剂、还原剂、稀释剂和/或蛋白酶可以使蛋白质(或肽)保持对蛋白组分析的适用性。核酸可以与裂解物或反应样品中存在的(经消化的)蛋白质(或肽)分离。核酸可通过各种方式和通过各种手段进行定量(例如通过荧光测定计(或荧光仪)、分光光度计、生物分析仪等)、扩增(例如通过PCR)和/或测序(例如通过NGS)。还可以对分离的经消化的蛋白质进行质谱分析(例如液相色谱-质谱法(LC-MS))。
用于实施所述方法的系统和产品可以包括用于进行前述或本文所述的其它方法的步骤的试剂和设备。用于检测肽的表达的存在和水平以区分疾病状态(例如癌症亚型)的组也在本文中有涉及和描述。这样的组可以包括被改变或配置成检测和/或定量样品中存在的特定蛋白质或多肽的多个肽。
本公开内容的示例性实施方案的额外特征和优点将在下面的描述中阐述，并且部分地将从描述中显而易见，或者可以通过实施这些示例性实施方案来了解。这些实施方案的特征和优点可以通过在所附权利要求中特别指出的仪器和组合来实现和获得。这些和其它特征将从以下描述和所附权利要求中变得更加显而易见，或者可以通过下文阐述的这种示例性实施方案的实践来了解。
还应注意，本文所述的前述、后续和/或其他特征中的每一个都可以代表本公开内容的不同实施方案。此外，任何两个或更多个这样的特征的组合表示本公开内容的不同实施方案。在不脱离本公开内容的范围的情况下，这些实施方案也可以以任何合适的组合和/或顺序进行合并。因此，本文所述的每个特征都可以与本文的任何一个或多个其它特征以任何合适的组合和/或顺序进行组合。因此，本公开内容不限于本文详细描述的示例性实施方案的具体组合。
附图简述
为了描述获得本公开内容的某些优点和特征的方式，将通过参考附图中所示的具体实施方案来描述本公开内容。理解这些附图仅描绘了本公开内容的一些实施方案，并且因此不被认为是对其范围的限制，本公开内容将通过使用附图来描述和解释其更多特征和细节，其中：
图1是描绘根据本公开内容的实施方案用于从生物样品分离蛋白组基因组材料的操作方案的流程图。
详述
在详细描述本公开内容的各种实施方案之前，应当理解，本公开内容不限于特定示例性系统、方法和/或产品的具体参数和描述，这些可以随实施例不同而发生变化。因此，尽管将参考具体配置、参数、部件、试剂等详细描述本公开内容的某些实施方案，但是该描述是说明性的，并且不应被解释为对本公开内容的范围和/或所要求保护的发明的限制。此外，本文使用的术语是为了描述实施方案的目的，并不必然意图限制本公开内容和/或要求保护的发明的范围。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有的含义与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。
本公开内容的各个方面，包括系统、方法和/或产品可以参考示例性质的一个或多个实施方案或执行方案来进行说明。如本文所使用的，术语“实施方案”和“执行方案”是指用作示例、实例或说明，并且不应被解释为比本文公开的其它方面优选或有利。此外，提到本公开内容或发明的“执行方案”包括提到其一个或多个实施方案，反之亦然，并且旨在提供说明性示例而不限制本发明的范围(其由所附权利要求而不是说明书表示)。
如整个申请中所使用的那样，词语“能够”和“可以”以允许意义(即，表示有潜能)而不是强制性意义(即，表示必须)使用。另外，本文包括权利要求书在内所使用的“包括”、“具有”、“涉及”、“含有”、“特征在于”以及其变体以及类似术语应当是包含和/或开放式的，应具有与“包含”一词及其变体相同的含义，并且不说明性排除额外的、未述及的元件或方法步骤。
如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“a”、“an”和“the”也包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如提及“核酸(a nucleic acid)”包括一种、两种或更多种核酸或核酸类型。类似地，除非内容和/或上下文另有明确规定，否则引用多个指示物应被解释为包括单个指示物和/或多个指示物。因此，提及“核酸(nucleic acids)”不必然要求多种这样的核酸或多种核酸类型。相反，应当理解，独立于词形变化；其中涵盖一种或多种核酸或其类型。
还将理解，当公开或述及两个或更多个数值或数值范围(例如小于、大于、至少和/或高达某个值，和/或在两个列举的值之间)，落入所公开的数值或数值范围内的任何具体值或数值范围也同样公开和包含在本文中。因此，小于或等于约10单位或在0和10单位之间的说明性测量值(例如体积、浓度等)的公开内容示例性地包括下列具体公开内容：(i)9个单位、5单位、1单位的测量值，或0至10单位之间的任何其他值，包括0单位和/或10单位；和/或(ii)在9个单位和1个单位之间、在8单位和2单位之间、6单位和4单位之间的测量值，和/或0至10单位之间的任何其它数值范围。
在某些实施方案中，某些方法步骤和/或系统部件的排序和/或位置排列可以有助于甚至决定实施方案的有效性和/或功能性。此外，第二步之前的第一步的进行可以提供有用的预处理并且能够改变第二步的结果。类似地，在第一步之后进行第二步能够用于确定第二步的结果。
为了便于理解，在可能的情况下，已经使用了同样的表示(例如部件和/或元件的命名和/或编号)，以代表与说明书和/或附图共有的同样的部件和/或元件。然而，应当理解，由此并不意图限制本公开内容的范围。相反，应当理解，用于描述示例性实施方案的语言仅是说明性的，并且不应被解释为限制本公开内容的范围(除非这种语言在本文中被明确描述为必需的)。
本文使用的标题仅用于组织目的，并不意图用于限制说明书或权利要求书的范围。
本公开内容涉及用于从生物样品例如单个福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织样品切片分离核酸和蛋白质分子的系统、方法和产品。某些方法可以包括：(i)提供具有含有核酸(例如DNA和/或RNA)和蛋白质的多个细胞的生物样品，(ii)在允许提取适于分子生物学分析的核酸和蛋白质的条件下制备细胞的裂解物，使得裂解物含有核酸和蛋白质，(iii)烷基化、还原、稀释和/或酶促消化裂解物中的蛋白质，(iv)将裂解物或反应样品中存在的核酸与裂解物或反应样品中存在的经消化的蛋白质或肽分离，和/或(v)进行分子生物学分析，例如分离的核酸和/或蛋白质或肽的下一代测序(NGS)和/或质谱。
所述方法可以使用户能够从同一切片、片和/或FFPE组织分离RNA、DNA和蛋白质，进一步使得用户能够关联来自组织的相同部分的RNA、DNA和蛋白质的状态和/或特征。因此，由于分析中涉及来自相同切片和/或相同细胞的蛋白组基因组物质，因此可以降低获得误导或冲突的基因组和蛋白质组数据的风险。此外，因为单个薄切片(厚度约为7微米)可用于核酸和蛋白质二者的分析，所以FFPE组织块的其余部分可用于可能需要进一步研究的进一步分析。
用于实施方法的系统和产品可以包括用于进行前述或本文所述的其它方法的步骤的试剂和设备。例如两个或更多个设备可以联接在一起或以流体连通的方式布置以形成系统。此外，用于检测肽的存在和表达水平以区分疾病状态(例如癌症亚型)的肽的组可以包括经改变或配置而检测和/或定量样品中存在的特定蛋白质或肽的多个肽。
如本文所使用的，术语“系统”还包括装置、设备、组合物、部件、试剂盒等。类似地，术语“方法”也包括过程、程序、步骤等。此外，术语“产品”还包括装置、设备、组合物、部件、试剂盒等。
在至少一个实施方案中，术语“形式”、“形成”等是开放式的，使得组合、混合、偶联等以形成系统、部件、混合物的组件等不一定构成整个系统、部件、混合物等。因此，系统、部件、混合物等可以包括所述组件，而不必完全或基本上由所述组件组成。
如本文所用，术语“混合物”、“流体混合物”、“液体混合物”等可以包含任何合适的组成(组件)和/或其特定成分(组件)的组合。例如流体或液体混合物可以包含液体和/或非液体组分(组件)的溶液、悬浮液、胶体、乳液或其它混合物。
如本文所用，术语“生物学”是指生物体(例如微生物，例如细菌、酵母等，植物，动物等)，无论是有生命的还是无生命的，和/或其成分，或由此产生，包括细胞、分子/化合物(例如核酸、蛋白质、脂肪、脂肪酸等)或其组合、聚集体、晶体或其沉淀物。
如本文所使用的，术语“偶联”、“附接”、“连接”和/或“接合”用于指示两个组件(组分)之间的直接关联，或者在适当时指示彼此之间通过中间或中介组件的间接关联。相比之下，当组件被称为“直接偶联”、“直接附接”、“直接连接”和/或“直接接合”到另一个组件时，不存在或不考虑中间元件。
此外，可以通过描述流体连通或流体偶联、连接等的组件来说明本公开内容的方面。本领域技术人员将理解，这样的流体连通或连接意味着组件之间至少一条路线或流动路径。通常，这种流体连通或连接涉及设置在流体连通和/或用于实现流体连接的组件之间的至少一个流体入口和/或流体出口。此外，如本文所使用的“流体连接”、“流体偶联”等可以包括流体流动路径，例如在流体线路、管等内发现的那些。
现在将参考本公开内容的附图。注意，附图不一定按比例绘制，并且在一些实施方案中可以改变附图中所示的各种组件的尺寸、顺序、取向、位置和/或关系或者各种组件之间的尺寸、顺序、取向、位置和/或关系，而不脱离本公开内容的范围。
图1是描绘用于从生物样品(例如FFPE组织样品的单个切片)分离蛋白质组物质的操作方案或方法10的流程图。应当理解，图1示出了可用于实践本公开内容的某些方面的各种步骤。然而，本公开内容的实施方案可以包括比图1中明确示出的更少的步骤和/或附加步骤。
说明性地，实施方案可以包括进行组织活检和/或提供活检组织的步骤12。步骤12可以例如由外科医生进行。组织可以是或包含任何合适的生物组织类型，无论是患病的还是健康的，癌性的(恶性的)或良性的，坏死的或有生命的。在至少一个实施方案中，组织可以是或包含癌组织，例如肿块或其他块。因此，在某些实施方案中，活检组织可以包括肿瘤活检或其他活检。可以在cancer.gov/type中找到可以通过活检或者其他取样以提供可以在本公开内容的实施方案中使用的组织的癌症列表，该列表通过具体引用并入本文。
在至少一个实施方案中，组织可以包含小细胞肺癌或肿瘤组织或非小细胞肺癌或肿瘤组织。在一些实施方案中，组织可以包含肺癌的一种或多种亚型，例如鳞状细胞(表皮样)癌、腺癌、腺鳞癌、肉瘤样癌等。本公开内容的某些实施方案可用于区分癌症亚型。在一些实施方案中，组织可以包含乳腺癌或肿瘤组织。应当理解，本文还包括了其它癌症类型和/或亚型。
一些实施方案可以包括福尔马林固定和石蜡包埋组织样品的步骤14。用于福尔马林固定和石蜡包埋组织的系统、方法和产品是本领域已知的并在本文中涉及。还将理解，一些实施方案可以包括使用新鲜组织或新鲜冷冻组织。然后，组织可以被切片或以其他方式制备用于加工。例如，某些实施方案可以包括对FFPE组织进行切片的步骤16。可以使用切片机或低温恒温器(例如可从Thermo Fisher Scientific商业获得的那些)来制备FFPE或新鲜冷冻组织块的薄片。在一些实施方案中，FFPE组织切片或片的厚度可以为50纳米(nm)至100微米(μm)，优选为约3-20μm，更优选为约5-10μm，最优选为约7μm。
如本领域已知的，一些实施方案可以包括使FFPE组织切片脱蜡的步骤18。例如，在某些实施方案中可以将单个FFPE组织切片转移到和/或放置在容器中，例如样品管、样品孔或容器(receptacle)中，其容积可以为约0.5-15毫升(mL)，优选为约1-5mL，更优选为约1.5-2.5mL，最优选约2mL。
在某些实施方案中，FFPE组织切片可以与可以施加于组织切片和/或添加到容器中的有机清除剂例如二甲苯混合。例如，可以通过在室温(RT)或其它温度下离心从混合物中收集样品。
样品和/或管可以加热1-10分钟，优选加热约3分钟，在约20-100℃，优选在约37-65℃，更优选约42-58℃，最优选约56℃，以熔融石蜡。加热的样品可以在约1-20,000rpm，优选约1,000-15,000rpm，更优选在约5,000-12,000rpm，最优选约12,000rpm和/或约1-10分钟，优选约2-5分钟，更优选约2分钟离心(在室温或其它温度)，以使组织沉淀。
二甲苯可以通过倾析、移液管移液等从容器和/或沉淀的组织中除去，而不干扰沉淀。然后将沉淀与有机溶剂如甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)或异丙醇优选EtOH混合。例如可将0.5-2mL，优选1mL的10-100％(溶于水)，优选100％的EtOH加入到沉淀中。样品可以在约1-20,000rpm，优选在约1,000-15,000rpm，更优选在约5,000-12,000rpm，最优选在约12,000rpm和/或约1-10分钟，优选约2-5分钟，更优选约2分钟离心(在室温或其它温度)，以使组织沉淀。
有机溶剂可以通过倾析、移液管移液等从容器和/或沉淀的组织中除去，而不干扰沉淀。可以如上所述将沉淀与有机溶剂一次或另外多次连续混合。可以如真空、空气流动或被动地干燥(约1-20分钟，优选约15分钟，在约20-100℃，优选约37℃)沉淀，直到沉淀干燥和/或基本上所有的溶剂都被去除。然后，包含脱蜡的组织样品的沉淀可用于制备如本文进一步描述的多分析物裂解物。
在至少一个实施方案中，如在步骤20中那样，组织切片可被脱蜡并且/或可以分离FFPE组织切片的选定区域，例如通过激光捕获显微切割(LCM)。例如，FFPE组织切片可以粘附到玻璃或LCM专用载片，如聚萘二甲酸乙二酯(PEN)膜载片。例如，载片和/或粘附的组织切片可以用和/或在合适量的有机清除剂例如二甲苯中连续处理一次或多次(例如2、3、4或5次)。每次脱蜡处理可以为1-5分钟，优选3分钟。
然后可以用合适量的有机溶剂如MeOH、EtOH或异丙醇，优选10-100％EtOH，更优选100％EtOH，将载片和/或粘附的组织切片连续处理一次或多次(例如2、3、4或5次)。然后可以对组织进行染色，例如使用苏木素和/或伊红和/或优选地可从Thermo FisherScientific商业获得的 Plus染色产品。染色步骤可以为约0.1-10分钟，优选约0.5-1分钟。染色的样品可以干燥(或脱水)，例如通过分级的和/或连续的EtOH/二甲苯处理。载片可以(然后)存储(例如在4℃)直到进行LCM，例如使用可从ThermoFisher Scientific商业获得的ArcturusXTTMLCM仪器。从组织切片分割的样品可以在LCM盖中捕获和/或可用于制备如本文进一步描述的多分析物裂解物。
下面概述了示例性载片粘附的组织切片处理方案：
二甲苯-3分钟
二甲苯-3分钟
二甲苯-3分钟
二甲苯-3分钟
100％乙醇-1分钟
100％乙醇-1分钟
95％乙醇-1分钟
H2O-1分钟
染色-0.5分钟(7μm)和1分钟(20μm)
H2O-1分钟
100％乙醇-1分钟
100％乙醇-1分钟
100％乙醇-1分钟
二甲苯-3分钟
二甲苯-3分钟
二甲苯-3分钟
在至少一个实施方案中，一整个组织切片可用于蛋白组基因组数据的全局相关性分析。在至少一个实施方案中，激光捕获显微切割可用于靶向选择特定的细胞类型。
一些实施方案可以包括制备多分析物裂解物。例如，实施方案可以包括裂解脱蜡的FFPE样品的步骤22。可以将脱蜡的FFPE组织样品切片的细胞裂解，例如通过在合适的裂解缓冲液中热裂解适合的时间段。特别地，可以在允许提取适于蛋白组基因组分析或处于蛋白组基因组分析的条件中的核酸(例如DNA和/或RNA)和蛋白质的条件下，进行细胞裂解。例如，裂解反应的缓冲液条件、反应时间和温度可以经改变或配置而释放适量的DNA、RNA和蛋白质，并且在用于分离和蛋白组基因组分析的稳定条件下。
在至少一个实施方案中，裂解缓冲液(或溶液)可以包含浓度为约0-8M变性剂如盐酸胍，浓度为约0-250mM的缓冲剂如三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，浓度为约0-10％v/v的有机溶剂如正丙醇，浓度为0-8M的离液剂如尿素，浓度为0-8M的柠檬酸钠和/或浓度为约0-50mM的还原剂如二硫苏糖醇(DTT)、二硫代丁胺(DTBA)、2-巯基乙醇(2-ME)或谷胱甘肽，pH为约4-12。在示例性实施方案中，裂解缓冲液可以包含8M盐酸胍(Gu-HCl)，250mMTris-HCl，2％正丙醇和50mM二硫苏糖醇(DTT)，pH为8.6。在另一示例性实施方案中，裂解缓冲液可以包含0.4M尿素，200mM Tris-HCl，25mM柠檬酸钠和50mM DTT，pH为7.4。
不受任何理论束缚，前述制剂或组合物对于热裂解过程中RNA、DNA和/或蛋白质的稳定性可能是最佳的。然而，在其它实施方案中，所述裂解缓冲液制剂或组合物对于热裂解过程中RNA、DNA和/或蛋白质的稳定性而言可能是次优的。特别地，用于裂解DNA的最佳试剂、浓度等可以不同于裂解RNA的最佳试剂、浓度等，其可以(各自)与裂解蛋白质的最佳试剂、浓度等不同。因此，在某些实施方案中，用户可能(需要)选择针对哪个(蛋白组基因组)大分子来优化溶液。在优选的实施方案中，裂解缓冲液制剂或组合物对于样品中的RNA分子可能是最佳的(增强稳定性)。
在实施方案中，将脱蜡的FFPE(整个切片或LCM)组织样品(来自7μm切片)与约0.5-1.0ml(0.5ml、0.75ml、1.0ml)的裂解缓冲溶液混合。其他量也在本文中考虑，并且可取决于FFPE切片的厚度。
在一些实施方案中，裂解反应可发生、出现和/或进行在特定温度或在特定温度范围之间和/或特定温度范围内。例如裂解反应温度可以在约25-95℃，优选在约55-85℃，更优选约55-65℃，最优选约65℃。在一些实施方案中，裂解反应温度可以小于约80℃，78℃，75℃，72℃，70℃，69℃，68℃，67℃或66℃，和/或大于约30℃，32℃，37℃，42℃，45℃，50℃，55℃，60℃，61℃，62℃，63℃或64℃。
在一些实施方案中，裂解反应可发生、出现和/或进行在特定时间或时间范围内。例如裂解反应时间可以为约0-2小时，优选约2分钟至约1小时，更优选约5分钟至约30分钟，还更优选约10分钟至约20分钟，最优选约15分钟。在至少一个实施方案中，裂解反应可以是或包含在单个裂解温度或范围的单次裂解步骤或一段时间。
在实施方案中，裂解缓冲液可以是或包含可从Thermo Fisher ScientificTM商业获得的MagMAXTM试剂盒裂解缓冲液(其中存在的试剂)。
在一些实施方案中，裂解反应可以包括在第一温度的第一裂解步骤和在第二温度的后续第二裂解步骤。第一裂解步骤温度可以在约25-95℃，优选在约45-65℃，更优选在约50-60℃，最优选在约55℃。在一些实施方案中，第一裂解步骤温度可以小于约80℃，78℃，75℃，72℃，70℃，68℃，65℃，60℃，58℃或56℃，和/或大于约30℃，32℃，37℃，42℃，45℃，50℃，52℃或54℃。第二裂解步骤温度可以在约25-95℃，优选在约65-90℃，更优选在约80-88℃，最优选在约85℃。在一些实施方案中，第二裂解步骤温度可以小于约95℃，92℃，90℃，88℃或86℃和/或大于约30℃，32℃，37℃，42℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃，70℃，75℃，78℃，80℃，82℃或84℃。
在一些实施方案中，裂解反应的每个步骤可发生、出现和/或进行在特定时间或时间范围内。例如第一裂解步骤时间可以为约0-2小时，优选为约15分钟至约1.5小时，更优选为约30分钟至约1.25小时，还更优选为约45分钟至约1小时，最优选为约1小时。第二裂解步骤时间可以为约0-2小时，优选为约15分钟至约1.5小时，更优选为约30分钟至约1.25小时，还更优选为约45分钟至约1小时，最优选为约1小时。
在示例性实施方案中，脱蜡的FFPE组织可以与约0.5-1.0ml的包含8M盐酸胍(Gu-HCl)、250mM Tris-HCl、2％正丙醇和50mM二硫苏糖醇(DTT)pH为8.6的裂解缓冲液混合，并加热至65℃，以暴露于FFPE组织切片持续约15分钟。在另一个示例性实施方案中，裂解缓冲液可以包含0.4M尿素、200mM Tris-HCl、25mM柠檬酸钠和50mM DTT，pH 7.4，加热至约55℃，以暴露于FFPE组织切片约1小时，然后加热至85℃，以暴露于组织切片另外一小时。在另一个实施方案中，将脱蜡的FFPE(整个切片或LCM)组织样品(来自7μm切片)可与约0.5-1.0ml(0.5ml、0.75ml、1.0ml)的MagMAXTM试剂盒裂解缓冲液混合，并在55℃下加热1小时，然后在85℃下加热1小时。其他量也在本文中考虑，并且可取决于FFPE切片的厚度。
一些实施方案可以包括烷基化裂解物中蛋白质的步骤24。在至少一个实施方案中，烷基化裂解物中蛋白质可以包括向裂解物中加入烷化剂，例如碘乙酰胺(IAM)或甲基硫代磺酸甲酯(MMTS)。根据所使用的试剂，可以将烷化剂加入到裂解物中，浓度为或至约0-5mM，优选约1-5mM，更优选约2-4mM，最优选约3.75mM的浓度。例如，实施方案可包括向裂解物中加入约1-10μL，优选约2-5μL，更优选约3.75μL的1M IAM或MMTS(例如在1M碳酸氢钠中，pH约8-12，优选pH为9)。在至少一个实施方案中，烷基化反应可以在黑暗和/或室温(或其它合适的温度)下进行约0-2小时，优选约5分钟至约1小时，更优选地约10分钟至约45分钟，还更优选约15分钟至约30分钟的时间段。
一些实施方案可以包括还原裂解物中烷化蛋白质的步骤26。在至少一个实施方案中，还原裂解物中蛋白质可包括向裂解物中加入还原剂，例如二硫苏糖醇(DTT)，三(2-羧乙基)膦，二硫代丁胺(DTBA)，2-巯基乙醇(2-ME)或谷胱甘肽。根据所使用的试剂，可将还原剂加入到裂解物中，浓度为或至约0-50mM，优选约0.5-5mM，更优选约1-2mM，最优选约1mM的浓度。例如，实施方案可包括向裂解物中加入约0-1000μL，优选约0.5-5μL，更优选约1μL的1MDTT(或0.5μL的2M DTT)。在至少一个实施方案中，还原反应可以在黑暗和/或室温(或其它合适的温度)下进行约0-2小时，优选约5分钟至约1小时，更优选地约10分钟至约45分钟，还更优选约15分钟至约30分钟的时间段。
一些实施方案可以包括稀释裂解物中烷化和/或还原蛋白质的步骤28。例如裂解物可用稀释缓冲液或溶液稀释。稀释缓冲液或溶液可以包含例如0-1000mM Tris-HCl和0-1000mM CaCl2，pH为约4-10.0。优选的实施方案可以包括在(960μL)具有适当量的(例如40μL)RNase灭活试剂(例如可从Thermo Fisher Scientific商业获得的RNAsecure)的50mMTris-HCl、5mM CaCl2、约pH 8.0中，稀释裂解物。
一些实施方案可以包括酶促消化裂解物中烷化和/或还原蛋白质的步骤30。不受任何理论束缚，酶促消化可以在有效释放核内的RNA、DNA结合的蛋白质和交联蛋白质的条件下进行，其量足以用于下游的蛋白组基因组分析。在至少一个实施方案中，酶促消化裂解物中的蛋白质可以包括在蛋白酶例如胰蛋白酶、蛋白酶k、胃蛋白酶等的存在下孵育裂解物。根据所使用的蛋白质和/或组织切片的总蛋白质浓度，可以将蛋白酶加到裂解物中，浓度为或至约0-50mM的浓度或最终蛋白酶与蛋白质的比例为1:1至1:1000(w/w)，优选1:20至1:100(w/w)，更优选1:20。在至少一个实施方案中，可以在约25℃至62℃，优选约32℃至42℃，更优选约37℃和/或约1-96小时，优选约4-24小时，更优选约16小时的时间段发生消化反应。可以通过将样品储存在约-20至-80℃，优选约-20℃下0.25-96小时，来停止消化反应。
实施方案可以包括将20μg MS级蛋白酶(例如胰蛋白酶)的冻干原料用约5-50μL，优选为20μL的0.01-1M，优选为50mM乙酸，己二酸，苹果酸，乳酸，草酸，丙二酸，琥珀酸，戊二酸或苦味酸，优选乙酸，重构为浓度为约0.001-10mg/mL，优选约1mg/mL。所制备的蛋白酶可以新鲜使用或等分至单次使用体积并储存在-20至-80℃，优选约-80℃。因此，可以使用1:20的MS级胰蛋白酶(在50mM乙酸中)与总蛋白质之比消化裂解物中的蛋白质，并在37℃振荡孵育约16小时。在一个实施方案中，胰蛋白酶可以是用于更高的蛋白质消化的特异性和效率的固定化胰蛋白酶。
在至少一个实施方案中，可以处理样品而不将蛋白质暴露于任何显著量的十二烷基硫酸钠(SDS)，其可破坏、干扰或扰乱蛋白质组分析例如MS(例如通过包被蛋白质和/或阻止其离子化)。然而，不用SDS加工样品可能对在裂解和/或消化期间释放和/或分离细胞核内的DNA构成重大挑战。
在至少一个实施方案中，可以采用或使用例如在MagMAXTM或可能含有SDS的其它缓冲液中的蛋白酶K，进行消化步骤30。不受任何理论的束缚，使用蛋白酶K和/或SDS可以从细胞核中释放更大量的DNA(与胰蛋白酶促消化和/或无SDS处理相比)，而释放的RNA和/或蛋白质的量可能至少与蛋白酶K消化与用胰蛋白酶消化一样高。然而，蛋白酶K消化和/或SDS缓冲液可能不是下游蛋白质组分析的理想选择。胰蛋白酶消化和/或盐酸胍缓冲液可能更加适用于蛋白质组分析。然而，胰蛋白酶消化和/或盐酸胍缓冲液在裂解和/或消化过程中可能不太有效地释放和/或分离DNA。此外，使用胰蛋白酶消化和/或盐酸胍缓冲液有效释放和/或分离DNA所需的更长时间可能对RNA在反应样品中的稳定性是不利的。
本公开内容的实施方案可以在对稳健DNA提取、温和RNA处理和蛋白质分析要求的需求之间达成折中。这样的折中实施方案可能不代表用于分离DNA、RNA和/或蛋白质中的任何一种的最理想的试剂和/或反应条件。然而，某些折中实施方案可以产生足够量的处于适合用于下游蛋白组基因组分析(例如PCR、qRT-PCR、CGH、NGS和/或MS(例如LC-MS))的条件下的DNA、RNA和蛋白质。
一些实施方案可以包括从裂解物和/或反应样品中经消化的蛋白质分离核酸(DNA和/或RNA)的步骤32。例如可以使用本领域已知的磁性颗粒分离技术在裂解物或反应样品中分离RNA、DNA和蛋白质，优选使用自动化液体处理系统，例如KingfisherTM磁性颗粒仪器和相关试剂盒(例如Kingfisher Pure RNATM分离试剂盒)，可从Thermo Fisher Scientific商业获得。
举例来说，可以从反应混合物取出每个大约450μL的一个或多个等分试样(针对RNA提取和DNA提取中的每一个)。本领域已知，在可适用的情况下，RNA酶A或DNA酶I可以添加到等分试样中，用于消化RNA(在DNA分离的情况下)或DNA(在RNA分离的情况下)。RNA或DNA可以然后从样品中除去。作为说明，可以将磁珠加入到反应样品中。珠可以从裂解物中结合游离核酸(NA)，反之亦然。磁棒或其他元件可以取出可洗涤(例如用醇和/或专有的洗涤缓冲液)的结合有NA的磁珠。然后可以从珠洗脱NA(例如用(不含核酸酶的)水和/或专有的洗脱缓冲液)并经制备用于下游测定(例如PCR、RTqPCR、微阵列、CGH和/或NGS)。在一些实施方案中，每个等分试样可以洗脱25-100μl、优选50μL的NA。
一些实施方案可以包括分析分离的核酸(DNA和/或RNA)的步骤34。RNA和/或DNA可以被定量，例如使用荧光计(可从Thermo Fisher Scientific商业获得)以定量样品中NA的量，使用生物分析仪器(例如AgilentTM2100生物分析仪，可从AgilentTechnologies商业获得)以检测片段NA，和/或使用NanoDropTM2000c分光光度计(可从Thermo Fisher Scientific商业获得)以测量样品的相对纯度。
如本领域已知的，定量后，可以通过包括扩增(通过PCR、qPCR、RTqPCR等)和下一代测序(NGS)的分析方法分析RNA和DNA。可以使用Ion TorrentTMPersonal Gene MachineTM(PGM)仪器(可从Thermo Fisher Scientific商业获得)，使用设计用于PGM仪器的试剂盒(例如可从Thermo Fisher Scientific获得的AmpliSeqTMCancer Hotspot panel产品，其靶向50种基因)，进行基因组学分析(通过NGS)。
还可以从裂解物或反应混合物中回收蛋白质。例如至少一部分剩余的裂解物或反应样品(在取等分试样用于NA分离、纯化和/或分析后)可进行蛋白质回收处理。蛋白质也可以(或者可选择地)从一种或多种DNA和/或RNA等分试样中回收(例如在磁性除去NA后)。在至少一个实施方案中，剩余的裂解物或反应样品可以与单独的DNA和RNA等分试样残留物组合，并制备用于随后的纯化和通过液相色谱质谱法(LC-MS)蛋白质分析。在某些实施方案中，组合的RNA和DNA残留物可以提供约900-1800μL的样品，原始未使用的蛋白酶消化的裂解物可以提供约100μL的样品。
如本领域已知的，一些实施方案可以包括分析蛋白质和/或肽的步骤36。在某些实施方案中，分析可以包括LC-MS。举例来说，可以例如使用真空浓缩器(例如SpeedvacTM真空浓缩器，可从Thermo Fisher Scientific商业获得)干燥单个或组合的样品。如本领域已知的，可以使用溶于LC-MS级水的0.1％甲酸使干燥的样品达到最终体积为1mL。可以通过使用C4、C12或C18(C18)树脂在盒或板例如可从Thermo Fisher Scientific商业获得的HyperSepTM Retain CX(30mg)96孔板中进行固相萃取，来进一步纯化和浓缩肽。可以用1mL溶于LC-MS级水的1％氢氧化铵、75％异丙醇并施加真空压力，来调节板。可以用1mL溶于LC-MS级水的0.1％甲酸并施加真空压力，来平衡孔。再次用1mL溶于LC-MS级水的1％氢氧化铵、75％异丙醇并施加真空压力，来调节板。
在一些实施方案中，可将1mL所制备的肽样品加载到经调节和平衡的孔中。在高通量系统中，多个制备的肽样品可以分别加载到分开的经调节和平衡的孔中。可以施加真空压力来使样品运行通过孔。可以用1mL溶于LC-MS级水的0.1％甲酸洗涤孔，并用0.1mL溶于0.1％甲酸的10-100％异丙醇(IPA)(优选10％IPA)洗涤(例如两次)。
可以使用100μL溶于LC-MS级水的1％氢氧化铵、75％异丙醇洗脱肽(例如三次)。洗脱的肽样品可以浓缩至干，重新悬浮于25μL的0.1％甲酸水溶液中，并通过HPLC/MS在发现或靶向质谱模式下进行分析。可以使用Q-ExactiveTM质谱仪(可从Thermo FisherScientific商业获得)进行蛋白质组(MS)分析。
前述和其他方法可以使用户能够从福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)组织的相同切片、片和/或四分体中分离RNA、DNA和蛋白质。当与激光捕获显微切割(LCM)组合时，该方法可以使用户能够关联来自组织的相同部分的RNA、DNA和蛋白质状态和/或特征。因此可以减少获得误导或冲突的基因组和蛋白质组数据的风险(因为分析中涉及到相同切片和/或相同细胞(的蛋白质原料))。此外，由于单个薄切片(约7微米)可用于核酸和蛋白质二者的分析，所以FFPE组织块的其余部分可用于可能需要进一步研究的进一步分析。
在至少一个实施方案中，前述或其它设备、试剂、试剂盒等中的一种或多种可以(流体)偶联、组合和/或连接以形成(单个、独立的)系统，用于一种或多种生物分子(例如核酸，如DNA和/或RNA，蛋白质和/或肽等)的提取、制备、分离和/或蛋白组基因组分析。这样的系统可以提供用于进行各种预期目的的蛋白组基因组分析的高效和成本有效的工具。作为示例，本公开内容的系统、方法和/或产品可用于区分癌症亚型。因此，本公开内容的某些实施方案可以包括用于区分癌症亚型的系统、方法和/或产品。这样的实施方案可以包括、包含和/或并入前述或其它设备、试剂、试剂盒、方法、步骤等中的一种或多种。
一个或多个实施方案可以包括肽的组。所述组可以包含多个肽，用于鉴定样品(例如FFPE组织切片)中一种或多种蛋白质的存在，区分癌症亚型(与鉴定的蛋白质相关)和/或测量药物靶的表达水平。在至少一个实施方案中，可以通过检测蛋白质的一种或多种肽来鉴定、(定量地)测量或确定存在于样品中的指示某些癌症或癌症亚型的蛋白质。
举例来说，可以通过实施本公开内容的一种或多种实施方案，来确定已经被活检和制备为FFPE组织样品的癌性(例如肺或乳腺)组织中的蛋白质MET、EGFR、HER2和KRAS的具体形式。这种确定可用于区分(肺或乳腺)癌症亚型(例如鳞状、腺癌等)并发现这些蛋白质(即潜在的药物靶)的表达水平。
实施组可以包括合适数量的肽，用于鉴定指示特定癌症类型的合适数目(例如约3-5、7-9、10-12个等)的蛋白质变体。每个肽可以具有一个或多个，两个或更多个，多个，至少3个，至少4个，或至少5个过渡离子。在下面的列表中示出了肽的说明性组。该列表包括各种肽，其任何合适数量可用于鉴定指示特定癌症类型如乳腺癌或肺癌的蛋白质变体，如下所示：
上述列表包含用于氨基酸残基的确定的单字母惯例和用于其修饰的标点符号惯例。因此，上述列表对应如下：丙氨酸(A)，精氨酸(R)，天冬酰胺(N)，天冬氨酸(D)，半胱氨酸(C)，谷氨酸(E)，谷氨酰胺(Q)，甘氨酸(G)，组氨酸(H)，异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，赖氨酸(K)，甲硫氨酸(M)，苯丙氨酸(F)，脯氨酸(P)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，色氨酸(W)，酪氨酸(Y)，缬氨酸(V)。此外，氘化残基(赖氨酸和/或精氨酸)以圆括号表示；(X)，磷酸化残基(丝氨酸和/或酪氨酸)以方括号表示；[X]，氧化的甲硫氨酸残基-即甲硫氨酸亚砜-以名称[Met(O)]或(Met[O])表示，脲甲基化(carbamidomethyl，CAM)修饰以所修饰氨基酸残基之后的名称(CAM)表示。
区分癌症亚型的方法可以包括或并入前述系统、方法和/或产品或其部分、步骤或组件中的一个或多个。该方法可以包括检测生物组织样品中上面列出的一种或多种肽(片段)。检测可以包括进行MS分析(如本文所述)。该方法可以包括鉴定与肽相对应的一种或多种蛋白质变体和/或搜索数据库以确定已知表达所鉴定的蛋白质或多肽的癌症或癌症亚型。该方法可以通过本公开内容的某些实施方案自动进行。
可以确定检测到的蛋白质相对于持家蛋白质的量。当经消化的肽样品在LC-MS中以发现模式运行时，确定每个个体肽的峰面积。通过比较每个靶蛋白质峰面积的平均值与持家蛋白质峰面积的平均值，相对定量检测到的蛋白质。为了确定适当的标准化持家蛋白质，将每个样品的总离子计数与根据Δ得分和然后Xcorr值分选的排列最高的持家蛋白质肽>n＝10的平均值进行比较。通过与总离子计数相比最小的标准偏差，来选择所选择的持家蛋白质。合适的持家蛋白质可以包括：GAPDH、βACTIN、RPSL11、TUBA1A、TUBA1B等。相同的过程用于选择靶蛋白质肽进行相对定量。每个蛋白质的平均峰面积除以持家蛋白质的平均峰面积得到相对表达值。
可以对所示的实施方案进行获知本公开内容的相关领域技术人员可以想到的本文所示发明特征的各种改变和/或修改，以及本文所示的原理的额外应用，而不背离权利要求所限定的本发明的精神和范围，并且将被认为在本公开内容的范围内。因此，虽然本文已经公开了各种方面和实施方案，但是还可以包括其他方面和实施方案。可以使用与本文相似或等同的多个方法和组件来实践本公开内容的实施方案，而本文仅描述了某些组件和方法。
还将理解，根据本公开内容的某些实施方案的系统、过程和/或产品可以包括、并入或以其他方式包含属性特征(例如组件(或组分)、构件、元件、部件和/或部分)在本文公开和/或描述的其它实施方案中有描述。因此，某些实施方案的各种特征可以与本发明的其它实施方案兼容、组合、包括在内和/或并入其中。因此，相对于本公开内容的具体实施方案的某些特征的公开不应被解释为将所述特征限制应用或包含于特定实施方案。相反，应当理解，其他实施方案也可以包括所述特征而不脱离本公开内容的范围。此外，除非将特征描述为需要另一特征与其组合，否则本文中的任何特征可以与本文公开的相同或不同实施方案的任何其他特征组合。此外，在这里没有特别详细地描述说明性系统、过程、产品等的各种众所周知的方面，以避免模糊示例性实施方案的方面。然而，这些方面也在本文中考虑。
本公开内容可以其他具体形式实施，而不脱离其精神或基本特征。所描述的实施方案在所有方面仅被认为是说明性(示例性)的而不是限制性的。因此，本发明的范围由所附权利要求而不是前面的描述来表示。虽然为了说明本公开内容的实施方案的目的已经包括本文和所附公开的某些实施方案和细节，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以对本文公开的方法、产品、装置和设备进行各种变化，而不脱离在所附权利要求中限定的本公开内容或本发明的范围。在权利要求的含义和等同范围内的所有变化将被包括在权利要求的范围内。
序列表
<110> 理查德艾伦科学公司（Richard-Allan Scientific Company）
<120> 蛋白组基因组分析系统和方法
<130> 19141 3
<140> 15/347,706
<141> 2016-11-09
<160> 212
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Ile Ile Tyr Asp Arg Lys Phe Leu Met Glu Cys Arg Asn Ser Pro Val
1 5 10 15
Thr Lys Thr Pro Pro Arg
20
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Lys Phe Leu Met Glu Cys Arg
1 5
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
Asn Ser Pro Val Thr Lys Thr Pro Pro Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Phe Leu Met Glu Cys Arg
1 5
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
Asp Leu Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile Lys
1 5 10 15
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
Glu Gly Trp Leu His Lys Arg Gly Glu Tyr Ile Lys Thr Trp Arg Pro
1 5 10 15
Arg
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
Ala Thr Gly Arg Tyr Tyr Ala Met Lys
1 5
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
Leu Pro Phe Tyr Asn Gln Asp His Glu Lys
1 5 10
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
Lys Leu Ser Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu Thr Asp Thr
1 5 10 15
Arg
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
Lys Glu Val Ile Val Ala Lys Asp Glu Val Ala His Thr Leu Thr Glu
1 5 10 15
Asn Arg
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
His Pro Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr His Asp Arg
1 5 10 15
<210> 12
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
Glu Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Ala Arg
1 5 10
<210> 13
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
Met Tyr Ser Gln Cys Val Arg
1 5
<210> 14
<211> 7
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 14
Gln Leu Val His Val Val Lys
1 5
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
Arg Phe Tyr Gln Leu Thr Lys Leu Leu Asp Ser Val Gln Pro Ile Ala
1 5 10 15
Arg
<210> 16
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
Gly Ala Phe Gln Asn Leu Phe Gln Ser Val Arg Glu Val Ile Gln Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro Arg
20
<210> 17
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
Phe Phe Asp Glu Leu Arg
1 5
<210> 18
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
Ser Phe Thr Asn Val Asn Ser Arg Met Leu Tyr Phe Ala Pro Asp Leu
1 5 10 15
Val Phe Asn Glu Tyr Arg
20
<210> 19
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
Ser His Met Val Ser Val Asp Phe Pro Glu Met Met Ala Glu Ile Ile
1 5 10 15
Ser Val Gln Val Pro Lys
20
<210> 20
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
Ser Asn Pro Lys Ser Pro Gln Lys Pro Ile Val Arg Val Phe Leu Pro
1 5 10 15
Asn Lys Gln Arg
20
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
Leu Leu Phe Gln Gly Phe Arg
1 5
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
Asp Leu Lys Ser Asn Asn Ile Phe Leu His Glu Asp Leu Thr Val Lys
1 5 10 15
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
Asp Gln Ile Ile Phe Met Val Gly Arg Gly Tyr Leu Ser Pro Asp Leu
1 5 10 15
Ser Lys Val Arg
20
<210> 24
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 24
Thr Phe Phe Thr Leu Ala Phe Cys Asp Phe Cys Arg
1 5 10
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 25
Leu Asp Ala Leu Gln Gln Arg
1 5
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
Cys Gly Val Thr Val Arg Asp Ser Leu Lys Lys
1 5 10
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 27
Gly Leu Ile Pro Glu Cys Cys Ala Val Tyr Arg
1 5 10
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 28
Gln Thr Ala Gln Gly Met Asp Tyr Leu His Ala Lys
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 29
Arg Leu Met Ala Glu Cys Leu Lys Lys
1 5
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 30
Ser Gly Thr Asp Val Asp Ala Ala Asn Leu Arg
1 5 10
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 31
Leu Phe Ile Ile Gln Ala Cys Arg
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 32
Ile Phe Ile Ile Gln Ala Cys Arg
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 33
Phe Ser Asp Leu Gly Phe Glu Val Lys
1 5
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 34
Arg Gly Ile Ala Leu Ile Phe Asn His Glu Arg
1 5 10
<210> 35
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 35
Gly Asn Gln His Asp Val Pro Val Ile Pro Leu Asp Val Val Asp Asn
1 5 10 15
Gln Thr Glu Lys
20
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 36
Glu Met Phe Asp Pro Ala Glu Lys
1 5
<210> 37
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 37
Gly His Pro Ala Gly Gly Glu Glu Asn Met Thr Glu Thr Asp Ala Phe
1 5 10 15
Tyr Lys
<210> 38
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 38
Val Met Leu Tyr Gln Ile Ser Glu Glu Val Ser Arg Ser Glu Leu Arg
1 5 10 15
<210> 39
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 39
Arg Val Cys Ala Gln Ile Asn Lys
1 5
<210> 40
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 40
Gly Asp Asp Ile Leu Thr Ile Leu Thr Glu Val Asn Tyr Glu Val Ser
1 5 10 15
Asn Lys Asp Asp Lys Lys
20
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 41
Gln Met Pro Gln Pro Thr Phe Thr Leu Arg Lys
1 5 10
<210> 42
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 42
Thr Arg Thr Gly Ser Asn Ile Asp Cys Glu Lys Leu Arg
1 5 10
<210> 43
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 43
Ile Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser Leu Gly Gly Lys
1 5 10 15
Pro Lys
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 44
Gln Met Pro Gly Cys Phe Asn Phe Leu Arg
1 5 10
<210> 45
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 45
Leu Ser Lys Pro Thr Leu Glu Asn Leu Thr Pro Val Val Leu Arg Pro
1 5 10 15
Glu Ile Arg
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 46
Gln Leu Ile Ile Asp Leu Glu Thr Arg
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 47
Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Arg Lys
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 48
Val Lys Leu Asp Ser Val Arg
1 5
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<211> 18
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 49
Ser Ser Asp Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu
1 5 10 15
Glu Arg
<210> 50
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 50
Asp Gln Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 51
His Lys Leu Glu Gln Leu Arg
1 5
<210> 52
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 52
Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu Gln Lys Leu
1 5 10 15
Ile Ser Glu Glu Asp Leu Leu Arg Lys
20 25
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 53
Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg
1 5 10 15
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 54
Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys
1 5 10
<210> 55
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 55
Glu Ala Gly Pro Pro Ala Phe Tyr Arg Pro Asn Ser Asp Asn Arg Arg
1 5 10 15
<210> 56
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 56
Leu Ala Ser Thr Asn Asp Lys Gly Ser Met Ala Met Glu Ser Ala Lys
1 5 10 15
Glu Thr Arg
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<211> 18
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 57
Gln Arg Asp Asp Gly Glu Gly Arg Gly Glu Val Gly Ser Ala Gly Asp
1 5 10 15
Met Arg
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 58
Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 59
Lys Cys Tyr Glu Val Gly Met Met Lys
1 5
<210> 60
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 60
Arg Ser Ile Gln Gly Asn Arg His Asn Asp Tyr Met Cys Pro Ala Thr
1 5 10 15
Asn Gln Cys Thr Ile Asp Lys
20
<210> 61
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 61
Ser Ile Gln Gly His Asn Asp Tyr Met Cys Pro Ala Thr Asn Gln Cys
1 5 10 15
Thr Ile Asp Lys Asn Arg Arg
20
<210> 62
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 62
Ile Ala Asp Pro Glu His Asp His Thr Gly Phe Leu Thr Glu Tyr Val
1 5 10 15
Ala Thr Arg
<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 63
Phe Arg His Glu Asn Val Ile Gly Ile Arg
1 5 10
<210> 64
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 64
Glu Ile Gln Ile Leu Leu Arg
1 5
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 65
Asn Tyr Leu Gln Ser Leu Pro Ser Lys
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 66
Ala Leu Asp Leu Leu Asp Arg
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 67
Thr Lys Val Ala Trp Ala Lys
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 68
Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 69
Leu Phe Pro Lys Ser Asp Ser Lys
1 5
<210> 70
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 70
Asn Gly Lys Glu Phe Lys Pro Asp His Arg
1 5 10
<210> 71
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 71
Thr Ser Asn Arg Gly His Lys Val Glu Val Ser Trp Glu Gln Arg
1 5 10 15
<210> 72
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 72
Phe Lys Cys Pro Ser Ser Gly Thr Pro Asn Pro Thr Leu Arg
1 5 10
<210> 73
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 73
Gly Ala Thr Pro Arg Asp Ser Gly Leu Tyr Ala Cys Thr Ala Ser Arg
1 5 10 15
<210> 74
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 74
His Gln His Trp Ser Leu Val Met Glu Ser Val Val Pro Ser Asp Arg
1 5 10 15
<210> 75
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 75
Val Ala Asp Pro Asp His Asp His Thr Gly Phe Leu Thr Glu Tyr Val
1 5 10 15
Ala Thr Arg
<210> 76
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 76
Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Leu Asn Thr Thr Cys Asp Leu Lys
1 5 10 15
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 77
Leu Phe Pro Asn Ala Asp Ser Lys
1 5
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 78
Gly Gln Val Phe Asp Val Gly Pro Arg
1 5
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 79
Ala Pro Glu Ile Met Leu Asn Ser Lys
1 5
<210> 80
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 80
Leu Lys Glu Leu Ile Phe Glu Glu Thr Ala Arg
1 5 10
<210> 81
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 81
Ile Ser Glu Leu Gly Ala Gly Asn Gly Gly Val Val Phe Lys
1 5 10
<210> 82
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 82
Ile Pro Glu Gln Ile Leu Gly Lys
1 5
<210> 83
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 83
Asp Val Lys Pro Ser Asn Ile Leu Val Asn Ser Arg
1 5 10
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 84
Ser Tyr Met Ser Pro Glu Arg
1 5
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 85
Thr Leu Asp Gln Ser Pro Glu Leu Arg
1 5
<210> 86
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 86
Trp Thr Leu Val Asn Asp Glu Thr Gln Ala Lys Met Ala Arg
1 5 10
<210> 87
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 87
Leu Ala Met Ala Gly Asp Thr Phe Thr Ala Glu Tyr Val Glu Phe Glu
1 5 10 15
Val Lys
<210> 88
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 88
Ser Thr Ala Met Asp Thr Leu Ser Ser Leu Val Phe Gln Leu Gly Lys
1 5 10 15
<210> 89
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 89
Leu Met Asp Thr Asn Thr Lys Gly Asn Lys Arg
1 5 10
<210> 90
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 90
Glu Leu Gln His Tyr Val Thr Met Glu Leu Arg
1 5 10
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<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 91
His Cys Ala Asp His Phe Leu Asn Ser Glu His Lys Glu Ile Arg
1 5 10 15
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 92
Ile Val Glu Asp Trp Gln Lys
1 5
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 93
Gly Asn Asn Leu Gln Asp Thr Leu Arg
1 5
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<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 94
Asp Phe Ser His Asp Asp Thr Leu Asp Val Pro Thr Gln Val Glu Leu
1 5 10 15
Leu Ile Lys
<210> 95
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 95
Gln Thr Thr Ser Pro Ser Gly Ser Leu Leu Arg
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<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 96
Ala Pro Asn Thr Ala Glu Leu Lys Ile Cys Arg
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<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 97
Asn Ser Gly Ser Cys Leu Gly Gly Asp Glu Ile Phe Leu Leu Cys Asp
1 5 10 15
Lys
<210> 98
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 98
Lys Arg Thr Tyr Glu Thr Phe Lys
1 5
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<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 99
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<210> 100
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 100
Leu Pro Pro Val Leu Ser His Pro Ile Phe Asp Asn Arg
1 5 10
<210> 101
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 101
Lys Ser Pro Phe Ser Gly Pro Thr Asp Pro Arg Pro Pro Pro Arg Arg
1 5 10 15
<210> 102
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 102
Lys Glu Ile Glu Ala Ala Ile Glu Arg
1 5
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<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 103
Ile Gln Leu Gly Ile Asp Pro Tyr Asn Ala Gly Ser Leu Lys
1 5 10
<210> 104
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 104
Glu Asp Ile Ser Val Val Phe Ser Arg Ala Ser Trp Glu Gly Arg
1 5 10 15
<210> 105
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 105
Leu Val Gln Gly Ser Ile Leu Lys
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 106
Cys Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ile Thr Leu Arg
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 107
Val Ser Asp Tyr Glu Met Lys
1 5
<210> 108
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 108
Asp Leu Ser His Ile Gly Asp Ala Val Val Ile Ser Cys Ala Lys
1 5 10 15
<210> 109
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 109
Phe Ser Ala Ser Gly Glu Leu Gly Asn Gly Asn Ile Lys
1 5 10
<210> 110
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 110
Ser Glu Gly Phe Asp Thr Tyr Arg Cys Asp Arg
1 5 10
<210> 111
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 111
Met Pro Ser Gly Glu Phe Ala Arg
1 5
<210> 112
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 112
Leu Phe Asn Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu
1 5 10 15
Ile Phe Tyr Cys Thr Phe Arg
20
<210> 113
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 113
Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg
1 5
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 114
Leu Phe Asn Val Thr Ser Thr Leu Arg
1 5
<210> 115
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 115
Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys
1 5
<210> 116
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 116
Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys
1 5 10
<210> 117
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 117
Leu Asn Thr Glu Glu Thr Val Lys Val His Val Arg
1 5 10
<210> 118
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 118
Ala Leu Glu Thr Ser Val Ala Ala Asp Phe Tyr His Arg
1 5 10
<210> 119
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 119
Asp His Glu Ser Val Phe Thr Val Ser Leu Trp Asp Cys Asp Arg Lys
1 5 10 15
<210> 120
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 120
Phe Glu Pro Tyr His Asp Ser Ala Leu Ala Arg
1 5 10
<210> 121
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 121
Ser Phe Leu Gly Ile Asn Lys Glu Arg
1 5
<210> 122
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 122
Tyr Gln Val Val Gln Thr Leu Asp Cys Leu Arg
1 5 10
<210> 123
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 123
Met Ala Glu Val Ala Ser Arg Asp Pro Lys
1 5 10
<210> 124
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 124
Lys Thr Ser Pro His Phe Gln Lys Phe Gln Asp Ile Cys Val Lys
1 5 10 15
<210> 125
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 125
Thr Gln Asp Gln Gln Ser Leu Ser Asp Val Glu Gly Ala Tyr Ser Arg
1 5 10 15
<210> 126
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 126
Lys Cys Cys Gln Ala Gly Met Val Leu Gly Gly Arg Lys
1 5 10
<210> 127
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 127
Phe Tyr Gln Leu Thr Lys Leu Leu Asp Asn Leu His Asp Leu Val Lys
1 5 10 15
<210> 128
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 128
Ala Leu Ser Val Glu Phe Pro Glu Met Met Ser Glu Val Ile Ala Ala
1 5 10 15
Gln Leu Pro Lys
20
<210> 129
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 129
Ser Ser Tyr Ile Arg Glu Leu Ile Lys
1 5
<210> 130
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 130
Arg Ala Met Glu Gly Gln His Asn Tyr Leu Cys Ala Gly Arg Asn Asp
1 5 10 15
Cys Ile Val Asp Lys Ile Arg Arg
20
<210> 131
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 131
Ala Leu Asp Ala Val Ala Leu Pro Gln Pro Val Gly Val Pro Asn Glu
1 5 10 15
Ser Gln Ala Leu Ser Gln Arg
20
<210> 132
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 132
Ser Tyr Lys His Val Ser Gly Gln Met Leu Tyr Phe Ala Pro Asp Leu
1 5 10 15
Ile Leu Asn Glu Gln Arg
20
<210> 133
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 133
Ile Tyr Asn Leu Cys Ala Glu Arg His Tyr Asp Thr Ala Lys Phe Asn
1 5 10 15
Cys Arg
<210> 134
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 134
Ala Gln Glu Ala Leu Asp Phe Tyr Gly Glu Val Arg
1 5 10
<210> 135
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 135
Asp Lys Lys Gly Val Thr Ile Pro Ser Gln Arg Arg
1 5 10
<210> 136
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 136
Val Lys Ile Tyr Ser Ser Asn Ser Gly Pro Thr Arg
1 5 10
<210> 137
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 137
Tyr Phe Ser Pro Asn Phe Lys
1 5
<210> 138
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 138
Asn Asn Ile Asp Asp Val Val Arg
1 5
<210> 139
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 139
Ala Asp Asn Asp Lys Glu Tyr Leu Val Leu Thr Leu Thr Lys Asn Asp
1 5 10 15
Leu Asp Lys
<210> 140
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 140
Ile Ser Ala Phe Gly Tyr Leu Glu Cys Ser Ala Lys
1 5 10
<210> 141
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 141
Phe Lys Arg Phe Pro Cys Leu Ser Leu Leu Ser Ser Trp Gly Tyr Arg
1 5 10 15
<210> 142
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 142
Glu Val Phe Glu Met Ala Thr Arg
1 5
<210> 143
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 143
His Phe Cys Pro Asn Val Pro Ile Ile Leu Val Gly Asn Lys Lys
1 5 10 15
<210> 144
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 144
Lys Lys Leu Val Ile Val Gly Asp Gly Ala Cys Gly Lys
1 5 10
<210> 145
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 145
Ile Gly Ala Phe Gly Tyr Met Glu Cys Ser Ala Lys
1 5 10
<210> 146
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 146
Gln Val Glu Leu Ala Leu Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu Asp Tyr Asp
1 5 10 15
Arg
<210> 147
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 147
Asp Gly Val Arg Glu Val Phe Glu Met Ala Thr Arg Ala Ala Leu Gln
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 148
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 148
Leu Gly Ala Gly Pro Gly Asp Ala Gly Glu Val Gln Ala His Pro Phe
1 5 10 15
Phe Arg
<210> 149
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 149
Phe Ser Leu Ser Gly Gly Tyr Trp Asn Ser Val Ser Asp Thr Ala Lys
1 5 10 15
<210> 150
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 150
Leu Thr Ala Ala Leu Val Leu Arg
1 5
<210> 151
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 151
His Pro Trp Ile Val His Trp Asp Gln Leu Pro Gln Tyr Gln Leu Asn
1 5 10 15
Arg
<210> 152
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 152
Asp Ser Pro Gly Ile Pro Pro Ser Ala Asn Ala His Gln Leu Phe Arg
1 5 10 15
<210> 153
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 153
Thr Ser Phe Thr Ser Val Ser Arg
1 5
<210> 154
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 154
Tyr Glu Glu Leu Gln Gln Thr Ala Gly Arg
1 5 10
<210> 155
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 155
Ala Gln Tyr Glu Glu Ile Ala Asn Arg
1 5
<210> 156
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 156
Glu Tyr Gln Glu Leu Met Asn Thr Lys
1 5
<210> 157
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 157
Phe Val Ser Thr Thr Ser Ser Ser Arg
1 5
<210> 158
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 158
Glu Tyr Gln Glu Leu Met Asn Val Lys
1 5
<210> 159
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 159
Thr Ala Ala Glu Asn Glu Phe Val Thr Leu Lys
1 5 10
<210> 160
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 160
Glu Glu Leu Gln Val Thr Ala Gly Arg
1 5
<210> 161
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 161
Ser Gly Phe Ser Ser Ile Ser Val Ser Arg
1 5 10
<210> 162
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 162
Ala Thr Gly Gly Gly Leu Ser Ser Val Gly Gly Gly Ser Ser Thr Ile
1 5 10 15
Lys
<210> 163
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 163
Leu Asp Ala Asp Pro Ser Leu Gln Arg
1 5
<210> 164
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 164
Gly Gln Leu Glu Ala Leu Gln Val Asp Gly Gly Arg
1 5 10
<210> 165
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 165
Asp Val Asp Ala Ala Tyr Met Ser Lys
1 5
<210> 166
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 166
Asn Glu Ile Ser Glu Met Asn Arg
1 5
<210> 167
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 167
Leu Leu Glu Gly Glu Glu Ser Arg
1 5
<210> 168
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 168
Gln Trp Tyr Glu Thr Asn Ala Pro Arg
1 5
<210> 169
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 169
Leu Glu Gln Glu Ile Ala Thr Tyr Arg
1 5
<210> 170
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 170
Thr Thr Glu Tyr Gln Leu Ser Thr Leu Glu Glu Arg
1 5 10
<210> 171
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 171
Thr Val Val Gln Glu Val Val Asp Gly Lys
1 5 10
<210> 172
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 172
Val Leu Gln Ile Asp Asn Ala Lys Leu Ala Ala Glu Asp Phe Arg
1 5 10 15
<210> 173
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 173
Asp Leu Gly Ser Glu Leu Val Arg
1 5
<210> 174
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 174
Ser Val Ser Pro Thr Thr Glu Met Val Ser Asn Glu Ser Val Asp Tyr
1 5 10 15
Arg
<210> 175
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 175
Ser Val Ser Pro Thr Thr Glu Met Val Ser Asn Glu Ser Val Asp Tyr
1 5 10 15
Arg
<210> 176
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 176
Asn Met Leu Asp Glu Lys
1 5
<210> 177
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 177
Asn Met Val Asp Glu Lys
1 5
<210> 178
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 178
Asp Met Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr Ser Val His Asn Lys
1 5 10
<210> 179
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 179
Asp Met His Asp Lys Glu Tyr Tyr Ser Val His Asn Lys
1 5 10
<210> 180
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 180
Asp Met Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr Ser Val His Asn Lys
1 5 10
<210> 181
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 181
Asp Met Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr Ser Val His Asn Lys
1 5 10
<210> 182
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 182
Asp Met Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr Ser Val His Asn Lys
1 5 10
<210> 183
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 183
Trp Met Ala Leu Glu Ser Leu Gln Thr Gln Lys
1 5 10
<210> 184
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 184
Trp Thr Ala Leu Glu Ser Leu Gln Thr Gln Lys
1 5 10
<210> 185
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 185
Tyr Ser Phe Gly Ala Thr Val Lys
1 5
<210> 186
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 186
Val Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys
1 5 10
<210> 187
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 187
Asn Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg
1 5 10 15
<210> 188
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 188
Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg
1 5
<210> 189
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 189
Gly Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg
1 5
<210> 190
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 190
Glu Leu Val Ser Glu Phe Ser Arg
1 5
<210> 191
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 191
Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu
1 5 10 15
Ala Pro Arg
<210> 192
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 192
Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu
1 5 10 15
Ala Pro Arg
<210> 193
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 193
Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu
1 5 10 15
Ala Pro Arg
<210> 194
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 194
Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu
1 5 10 15
Ala Pro Arg
<210> 195
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 195
Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg
1 5 10 15
<210> 196
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 196
Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg
1 5 10 15
<210> 197
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 197
Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg
1 5 10 15
<210> 198
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 198
Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg
1 5 10 15
<210> 199
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 199
Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10
<210> 200
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 200
Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val Leu Val Gly Asn Lys
1 5 10 15
<210> 201
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 201
Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val Leu Val Gly Asn Lys
1 5 10
<210> 202
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 202
Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr Ser Ala Lys
1 5 10
<210> 203
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 203
Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val Arg
1 5 10
<210> 204
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 204
Phe Ala Ile Gln Tyr Gly Thr Gly Arg Val Asp Gly Ile Leu Ser Glu
1 5 10 15
Asp Lys
<210> 205
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 205
Val Asp Gly Ile Leu Ser Glu Asp Lys
1 5
<210> 206
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 206
Phe Ala Ile Gln Tyr Gly Thr Gly Arg
1 5
<210> 207
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 207
Val Gly Pro Gly Leu Thr Leu Ala Lys
1 5
<210> 208
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 208
Ser Ala Thr Trp Thr Tyr Ser Thr Glu Leu Lys
1 5 10
<210> 209
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 209
Glu Phe Asn Glu Gly Gln Ile Ala Pro Pro Ser His Leu Ile Arg
1 5 10 15
<210> 210
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 210
Ile Cys Ala Pro Gly Arg
1 5
<210> 211
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 211
Glu Thr Tyr Glu Met Leu Leu Lys
1 5
<210> 212
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 212
Thr Pro Ser Ser Ala Ser Thr Val Ser Val Gly Ser Ser Glu Thr Arg
1 5 10 15

Claims (23)

1.从生物样品中提取大分子的方法，所述方法包括：
提供具有含有核酸和蛋白质的多个细胞的生物样品；
裂解所述细胞以产生含有核酸和蛋白质的至少一部分的裂解物；
烷基化、还原和酶促消化所述裂解物中的蛋白质；和
将核酸与经消化的蛋白质分离。
2.权利要求1的方法，其中所述核酸包括DNA和RNA。
3.权利要求1的方法，其中所述生物样品包括福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织切片，并且其中所述方法优选包括在裂解细胞之前对所述生物样品进行脱蜡。
4.权利要求3的方法，其中所述FFPE组织切片的厚度为约3至10微米，优选为约7微米。
5.权利要求3的方法，还包括通过激光捕获显微切割(LCM)捕获所述FFPE组织切片的一部分。
6.权利要求1的方法，其中裂解细胞包括在裂解缓冲液中孵育所述生物样品。
7.权利要求6的方法，其中所述裂解缓冲液包含：
变性剂，变性组分优选包含浓度高达约8M的盐酸胍；
缓冲剂，所述缓冲剂优选包含浓度高达约250mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)；
有机溶剂，所述有机溶剂优选包含浓度高达约10％v/v的正丙醇；和
还原剂，所述还原剂优选包含浓度高达约50mM的二硫苏糖醇(DTT)、二硫代丁胺(DTBA)、2-巯基乙醇(2-ME)或谷胱甘肽，
pH为约4至8.6。
8.权利要求6的方法，其中所述裂解缓冲液包含约8M盐酸胍、约250mMTris-HCl、约2％v/v正丙醇和约50mM二硫苏糖醇(DTT)，pH为约8.6。
9.权利要求6的方法，其中孵育的温度不高于85℃。
10.权利要求6的方法，其中孵育少于30分钟。
11.权利要求6的方法，其中在约65℃孵育约15分钟。
12.权利要求6的方法，其中在约55℃孵育约1小时，然后在约85℃孵育约1小时。
13.权利要求1的方法，其中烷基化包括向所述裂解物中加入烷化剂，烷化剂优选包含浓度为约0至5mM的碘乙酰胺(IAM)或甲基硫代磺酸甲酯(MMTS)。
14.权利要求1的方法，其中还原包括向所述裂解物中加入还原剂，所述还原剂优选包含浓度为约0至50mM的二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦、二硫代丁胺(DTBA)、2-巯基乙醇(2-ME)或谷胱甘肽。
15.权利要求1的方法，其中酶促消化包括在蛋白酶存在下孵育所述裂解物，所述蛋白酶优选包含浓度为约0至50mM或最终蛋白酶与蛋白质之比为1:1至1:1000(w/w)的胰蛋白酶、蛋白酶k或胃蛋白酶。
16.权利要求15的方法，其中酶促消化还包括在添加蛋白酶之前用稀释缓冲液稀释裂解物，所述稀释缓冲液包含：
缓冲剂，所述缓冲剂优选包含浓度高达约1000mM的Tris-HCl；和
金属辅因子，所述金属辅因子优选包含浓度高达约1000mM的CaCl2，
pH为约4至10。
17.权利要求1的方法，其中顺序地进行烷基化、还原和酶促消化。
18.权利要求1的方法，还包括：
对分离的经消化的蛋白质进行质谱分析；和/或
对分离的核酸进行核酸分析。
19.权利要求18的方法，其中：
所述质谱分析包括液相色谱-质谱(LC-MS)；和/或
所述核酸分析包括一种或多种选自由以下组成的组的分析方法：
定量；
扩增；和
测序。
20.制备细胞裂解物的方法，所述方法包括：
在低于80℃的温度将生物样品在裂解缓冲液中孵育少于30分钟，所述生物样品具有含有DNA、RNA和蛋白质的多个细胞，所述裂解缓冲液包含：
变性剂，优选包含浓度为约0至8M的盐酸胍；
缓冲剂，优选包含浓度为约0至250mM的Tris-HCl；
有机溶剂，优选浓度为约0至10％v/v的正丙醇；和
还原剂，优选浓度为约0至50mM的二硫苏糖醇(DTT)、二硫代丁胺(DTBA)、2-巯基乙醇(2-ME)或谷胱甘肽，
pH为约4至8.6，
其中在不高于85℃的温度将所述裂解缓冲液中的生物样品孵育少于30分钟足以从所述细胞的细胞核提取适量的DNA，并将DNA、RNA和蛋白质维持在适合组合的蛋白组基因组分离和分析的条件。
21.权利要求20的方法，其中所述裂解缓冲液包含8M盐酸胍、250mMTris-HCl、2％正丙醇和50mM二硫苏糖醇(DTT)，pH为8.6，在约65℃孵育约15分钟。
22.使用管家蛋白和靶蛋白的平均的排序LC-MS峰面积，通过△得分和Xcorr值，计算相对蛋白质表达的方法。
23.用于区分癌症亚型的组，其包含以下肽中的两个或更多个：
具有氨基酸序列TSFTSVS(R)用于检测CK5-1的肽；
具有氨基酸序列YEELQQTAG(R)用于检测CK5-2的肽；
具有氨基酸序列AQYEEIAN(R)用于检测CK5-3的肽；
具有氨基酸序列EYQELMNT(K)用于检测CK5-4的肽；
具有氨基酸序列FVSTTSSS(R)用于检测CK5-5的肽；
具有氨基酸序列EYQELMNV(K)用于检测CK6-1的肽；
具有氨基酸序列TAAENEFVTL(K)用于检测CK6-2的肽；
具有氨基酸序列EELQVTAG(R)用于检测CK6-3的肽；
具有氨基酸序列SGFSSISVS(R)用于检测CK6-4的肽；
具有氨基酸序列ATGGGLSSVGGGSSTI(K)用于检测CK6-5的肽；
具有氨基酸序列LDADPSLQ(R)用于检测CK7-1的肽；
具有氨基酸序列GQLEALQVDGG(R)用于检测CK7-2的肽；
具有氨基酸序列DVDAAYMS(K)用于检测CK7-3的肽；
具有氨基酸序列NEISEMN(R)用于检测CK7-4的肽；
具有氨基酸序列LLEGEES(R)用于检测CK7-5的肽；
具有氨基酸序列QWYETNAP(R)用于检测CK20-1的肽；
具有氨基酸序列LEQEIATY(R)用于检测CK20-2的肽；
具有氨基酸序列TTEYQLSTLEE(R)用于检测CK20-3的肽；
具有氨基酸序列TVVQEVVDG(K)用于检测CK20-4的肽；
具有氨基酸序列VLQIDNAKLAAEDF(R)用于检测CK20-5的肽；
具有氨基酸序列DLGSELV(R)用于检测MET_1的肽；
具有氨基酸序列SVSPTTEMVSNESVDY(R)用于检测MET_2的肽；
具有氨基酸序列SVSPTTEMVSNESVD[Y](R)用于检测MET_2_pY1003的肽；
具有氨基酸序列N(CAM)MLDE(K)用于检测MET_3_L1213L的肽；
具有氨基酸序列N(CAM)MVDE(K)用于检测MET_3_L1213V的肽；
具有氨基酸序列DMYDKEYYSVHN(K)用于检测MET_4_Y1248Y的肽；
具有氨基酸序列DMHDKEYYSVHN(K)用于检测MET_4_Y1248H的肽；
具有氨基酸序列DMYDKE[Y]YSVHN(K)用于检测MET_4_Y1248Y_pY1234的肽；
具有氨基酸序列DMYDKEY[Y]SVHN(K)用于检测MET_4_Y1248Y_pY1235的肽；
具有氨基酸序列DMYDKE[Y][Y]SVHN(K)用于检测MET_4_Y1248Y_pY1234_pY1235的肽；
具有氨基酸序列WMALESLQTQ(K)用于检测MET_5_M1268M的肽；
具有氨基酸序列WTALESLQTQ(K)用于检测MET_5_M1268T的肽；
具有氨基酸序列YSFGAT(CAM)V(K)用于检测EGFR_1的肽；
具有氨基酸序列V(CAM)NGIGIGEF(K)用于检测EGFR_2的肽；
具有氨基酸序列N(CAM)TSISGDLHILPVAF(R)用于检测EGFR_3的肽；
具有氨基酸序列DPPFC(CAM)VA(R)用于检测HER2_1的肽；
具有氨基酸序列GMSYLEDV(R)用于检测HER2_2的肽；
具有氨基酸序列ELVSEFS(R)用于检测HER2_3的肽；
具有氨基酸序列SGGGDLTLGLEPSEEEAP(R)用于检测HER2_4的肽；
具有氨基酸序列[S]GGGDLTLGLEPSEEEAP(R)用于检测HER2_4_pS1051的肽；
具有氨基酸序列SGGGDLTLGLEP[S]EEEAP(R)用于检测HER2_4_pS1054的肽；
具有氨基酸序列[S]GGGDLTLGLEP[S]EEEAP(R)用于检测HER2_4_pS1051_pS1054的肽；
具有氨基酸序列GLQSLPTHDPSPLQ(R)用于检测HER2_5的肽；
具有氨基酸序列GLQ[S]LPTHDPSPLQ(R)用于检测HER2_5_pS1100的肽；
具有氨基酸序列GLQSLPTHDP[S]PLQ(R)用于检测HER2_5_pS1007的肽；
具有氨基酸序列GLQ[S]LPTHDP[S]PLQ(R)用于检测HER2_5_pS1100_pS1007的肽；
具有氨基酸序列LVVVGAGGVG(K)用于检测KRAS_1的肽；
具有氨基酸序列VKDSEDVPMVLVGN(K)用于检测KRAS_2A的肽；
具有氨基酸序列DSEDVPMVLVGN(K)用于检测KRAS_2B的肽；
具有氨基酸序列SYGIPFIETSA(K)用于检测KRAS_3的肽；
具有氨基酸序列QGVDDAFYTLV(R)用于检测KRAS_4的肽；
具有氨基酸序列FAIQYGTGRVDGILSED(K)用于检测NAPSINA_1A的肽；
具有氨基酸序列VDGILSED(K)用于检测NAPSINA_1B的肽；
具有氨基酸序列FAIQYGTG(R)用于检测NAPSINA_1C的肽；
具有氨基酸序列VGPGLTL(CAM)A(K)用于检测NAPSINA_2的肽；
具有氨基酸序列SATWTYSTEL(K)用于检测P40/63_1的肽；
具有氨基酸序列EFNEGQIAPPSHLI(R)用于检测P40/63_2的肽；
具有氨基酸序列ICA(CAM)PG(R)用于检测P40/63_3的肽；
具有氨基酸序列ETYEMLL(K)用于检测P40/63_4的肽；
具有氨基酸序列TPSSASTVSVGSSET(R)用于检测P40/63_5的肽；
具有氨基酸序列IIYDRKFL(Met[O])EC(CAM)RNSPVTKTPP(R)用于检测4E-BP1_1的肽；
具有氨基酸序列KFLMEC(R)用于检测4E-BP1_2的肽；
具有氨基酸序列NSPVTKTPP(R)用于检测4E-BP1_3的肽；
具有氨基酸序列FLMEC(R)用于检测4E-BP1_4的肽；
具有氨基酸序列DLKLENLMLDKDGHI(K)用于检测AKT_1的肽；
具有氨基酸序列EGWLHKRGEYIKTWRP(R)用于检测AKT_2的肽；
具有氨基酸序列ATGRYYAM(K)用于检测AKT_3的肽；
具有氨基酸序列LPFYNQDHE(K)用于检测AKT_4的肽；
具有氨基酸序列KLSPPFKPQVTSETDT(R)用于检测AKT_5的肽；
具有氨基酸序列KEVIVAKDEVAHTLTEN(R)用于检测AKT_6的肽；
具有氨基酸序列HPFLTALKYSFQTHD(R)用于检测AKT_7的肽；
具有氨基酸序列ERVFSEDRA(R)用于检测AKT_8的肽；
具有氨基酸序列MYSQC(CAM)V(R)用于检测AR_1的肽；
具有氨基酸序列QLVHVV(K)用于检测AR_2的肽；
具有氨基酸序列RFYQLTKLLDSVQPIA(R)用于检测AR_3的肽；
具有氨基酸序列GAFQNLFQSVREVIQNPGP(R)用于检测AR_4的肽；
具有氨基酸序列FFDEL(R)用于检测AR_5的肽；
具有氨基酸序列SFTNVNSRMLYFAPDLVFNEY(R)用于检测AR_6的肽；
具有氨基酸序列SHMVSVDFPEMMAEIISVQVP(K)用于检测AR_7的肽；
具有氨基酸序列SNPKSPQKPIVRVFLPNKQ(R)用于检测BRAF_1的肽；
具有氨基酸序列LLFQGF(R)用于检测BRAF_2的肽；
具有氨基酸序列DLKSNNIFLHEDLTV(K)用于检测BRAF_3的肽；
具有氨基酸序列DQIIFMVGRGYLSPDLSKV(R)用于检测BRAF_4的肽；
具有氨基酸序列TFFTLAFC(CAM)DFC(CAM)(R)用于检测BRAF_5的肽；
具有氨基酸序列LDALQQ(R)用于检测BRAF_6的肽；
具有氨基酸序列C(CAM)GVTVRDSLK(K)用于检测BRAF_7的肽；
具有氨基酸序列GLIPEC(CAM)C(CAM)AVY(R)用于检测BRAF_8的肽；
具有氨基酸序列QTAQGMDYLHA(K)用于检测BRAF_9的肽；
具有氨基酸序列RLMAEC(CAM)LK(K)用于检测BRAF_10的肽；
具有氨基酸序列SGTDVDAANL(R)用于检测胱天蛋白酶3_1的肽；
具有氨基酸序列LFIIQAC(R)用于检测胱天蛋白酶3_2的肽；
具有氨基酸序列IFIIQAC(CAM)(R)用于检测胱天蛋白酶6_1的肽；
具有氨基酸序列FSDLGFEV(K)用于检测胱天蛋白酶6_2的肽；
具有氨基酸序列RGIALIFNHE(R)用于检测胱天蛋白酶6_3的肽；
具有氨基酸序列GNQHDVPVIPLDVVDNQTE(K)用于检测胱天蛋白酶6_4的肽；
具有氨基酸序列EMFDPAE(K)用于检测胱天蛋白酶6_5的肽；
具有氨基酸序列GHPAGGEENMTETDAFY(K)用于检测胱天蛋白酶6_6的肽；
具有氨基酸序列V(Met[O])LYQISEEVSRSEL(R)用于检测胱天蛋白酶8_1的肽；
具有氨基酸序列RVC(CAM)AQIN(K)用于检测胱天蛋白酶8_2的肽；
具有氨基酸序列GDDILTILTEVNYEVSNKDDK(K)用于检测胱天蛋白酶8_3的肽；
具有氨基酸序列QMPQPTFTLR(K)用于检测胱天蛋白酶8_4的肽；
具有氨基酸序列TRTGSNIDC(CAM)EKL(R)用于检测胱天蛋白酶9_1的肽；
具有氨基酸序列IVNIFNGTSC(CAM)PSLGGKP(K)用于检测胱天蛋白酶9_2的肽；
具有氨基酸序列QMPGC(CAM)FNFL(R)用于检测胱天蛋白酶9_3的肽；
具有氨基酸序列LSKPTLENLTPVVLRPEI(R)用于检测胱天蛋白酶9_4的肽；
具有氨基酸序列QLIIDLET(R)用于检测胱天蛋白酶9_5的肽；
具有氨基酸序列LASYQAAR(K)用于检测cMyc_1的肽；
具有氨基酸序列VKLDSV(R)用于检测cMyc_2的肽；
具有氨基酸序列SSDTEENVKRRTHNVLE(R)用于检测cMyc_3的肽；
具有氨基酸序列DQIPELENNEKAP(K)用于检测cMyc_4的肽；
具有氨基酸序列HKLEQL(R)用于检测cMyc_5的肽；
具有氨基酸序列KATAYILSVQAEEQKLISEEDLLR(K)用于检测cMyc_6的肽；
具有氨基酸序列A(Met[O])HVAQPAVVLASS(R)用于检测CTLA4_1的肽；
具有氨基酸序列A(Met[O])DTGLYIC(CAM)(K)用于检测CTLA4_2的肽；
具有氨基酸序列EAGPPAFYRPNSDNR(R)用于检测ER_1的肽；
具有氨基酸序列LASTNDKGSMAMESAKET(R)用于检测ER_2的肽；
具有氨基酸序列QRDDGEGRGEVGSAGDM(R)用于检测ER_3的肽；
具有氨基酸序列LLFAPNLLLD(R)用于检测ER_4的肽；
具有氨基酸序列KC(CAM)YEVGMM(K)用于检测ER_5的肽；
具有氨基酸序列RSIQGNRHNDY[Met(O)]CPATNQCTID(K)用于检测ER_6的肽；
具有氨基酸序列SIQGHNDY[Met(O)]C(CAM)PATNQC(CAM)TIDKNR(R)用于检测ER_7的肽；
具有氨基酸序列IADPEHDHTGFLTEYVAT(R)用于检测ERK_1的肽；
具有氨基酸序列FRHENVIGI(R)用于检测ERK_2的肽；
具有氨基酸序列EIQILL(R)用于检测ERK_3的肽；
具有氨基酸序列NYLQSLPS(K)用于检测ERK_4的肽；
具有氨基酸序列ALDLLD(R)用于检测ERK_5的肽；
具有氨基酸序列TKVAWA(K)用于检测ERK_6的肽；
具有氨基酸序列IC(CAM)DFGLA(R)用于检测ERK_7的肽；
具有氨基酸序列LFPKSDS(K)用于检测ERK_8的肽；
具有氨基酸序列NGKEFKPDH(R)用于检测FGFR1_1的肽；
具有氨基酸序列TSNRGHKVEVSWEQ(R)用于检测FGFR1_2的肽；
具有氨基酸序列FKC(CAM)PSSGTPNPTL(R)用于检测FGFR1_3的肽；
具有氨基酸序列GATPRDSGLYACTAS(R)用于检测FGFR2_1的肽；
具有氨基酸序列HQHWSLVMESVVPSD(R)用于检测FGFR4_1的肽；
具有氨基酸序列VADPDHDHTGFLTEYVAT(R)用于检测MAPK_1的肽；
具有氨基酸序列DLKPSNLLLNTTC(CAM)DL(K)用于检测MAPK_2的肽；
具有氨基酸序列LFPNADS(K)用于检测MAPK_3的肽；
具有氨基酸序列GQVFDVGP(R)用于检测MAPK_4的肽；
具有氨基酸序列APEI(Met[O])LNS(K)用于检测MAPK_5的肽；
具有氨基酸序列LKELIFEETA(R)用于检测MAPK_6的肽；
具有氨基酸序列ISELGAGNGGVVF(K)用于检测MEK1_1的肽；
具有氨基酸序列IPEQILG(K)用于检测MEK1_2的肽；
具有氨基酸序列DVKPSNILVNS(R)用于检测MEK1_3的肽；
具有氨基酸序列SYMSPE(R)用于检测MEK1_4的肽；
具有氨基酸序列TLDQSPEL(R)用于检测mTOR_1的肽；
具有氨基酸序列DFSHDDTLDVPTQVELLI(K)用于检测mTOR_10的肽；
具有氨基酸序列WTLVNDETQAKMA(R)用于检测mTOR_2的肽；
具有氨基酸序列LAMAGDTFTAEYVEFEV(K)用于检测mTOR_3的肽；
具有氨基酸序列STAMDTLSSLVFQLG(K)用于检测mTOR_4的肽；
具有氨基酸序列LMDTNTKGNK(R)用于检测mTOR_5的肽；
具有氨基酸序列ELQHYVTMEL(R)用于检测mTOR_6的肽；
具有氨基酸序列HC(CAM)ADHFLNSEHKEI(R)用于检测mTOR_7的肽；
具有氨基酸序列IVEDWQ(K)用于检测mTOR_8的肽；
具有氨基酸序列GNNLQDTL(R)用于检测mTOR_9的肽；
具有氨基酸序列QTTSPSGSLL(R)用于检测NFkB-p100_1的肽；
具有氨基酸序列APNTAELKIC(CAM)(R)用于检测NFkB-p65_1的肽；
具有氨基酸序列NSGSC(CAM)LGGDEIFLLC(CAM)D(K)用于检测NFkB-p65_2的肽；
具有氨基酸序列KRTYETF(K)用于检测NFkB-p65_3的肽；
具有氨基酸序列TPPYADPSLQAPV(R)用于检测NFkB-p65_4的肽；
具有氨基酸序列LPPVLSHPIFDN(R)用于检测NFkB-p65_5的肽；
具有氨基酸序列KSPFSGPTDPRPPPR(R)用于检测NFkB-p65_6的肽；
具有氨基酸序列KEIEAAIE(R)用于检测NFkB-relB_1的肽；
具有氨基酸序列IQLGIDPYNAGSL(K)用于检测NFkB-relB_2的肽；
具有氨基酸序列EDISVVFSRASWEG(R)用于检测NFkB-relB_3的肽；
具有氨基酸序列LVQGSIL(K)用于检测PCNA_1的肽；
具有氨基酸序列C(CAM)AGNEDIITL(R)用于检测PCNA_2的肽；
具有氨基酸序列VSDYEM(K)用于检测PCNA_3的肽；
具有氨基酸序列DLSHIGDAVVISCA(K)用于检测PCNA_4的肽；
具有氨基酸序列FSASGELGNGNI(K)用于检测PCNA_5的肽；
具有氨基酸序列SEGFDTYRC(CAM)D(R)用于检测PCNA_6的肽；
具有氨基酸序列[Met(O)]PSGEFA(R)用于检测PCNA_7的肽；
具有氨基酸序列LFNVTSTLRINTTTNEIFYC(CAM)TF(R)用于检测PDL1_1的肽；
具有氨基酸序列LQDAGVY(R)用于检测PDL1_2的肽；
具有氨基酸序列LFNVTSTL(R)用于检测PDL1_3的肽；
具有氨基酸序列VNAPYN(K)用于检测PDL1_4的肽；
具有氨基酸序列CMISYGGADY(K)用于检测PDL1_5的肽；
具有氨基酸序列LNTEETVKVHV(R)用于检测PI3K_1的肽；
具有氨基酸序列ALETSVAADFYH(R)用于检测PI3K_2的肽；
具有氨基酸序列DHESVFTVSLWDC(CAM)DR(K)用于检测PI3K_3的肽；
具有氨基酸序列FEPYHDSALA(R)用于检测PI3K_4的肽；
具有氨基酸序列SFLGINKE(R)用于检测PI3K_5的肽；
具有氨基酸序列YQVVQTLDC(CAM)L(R)用于检测PI3K_6的肽；
具有氨基酸序列MAEVASRDP(K)用于检测PI3K_7的肽；
具有氨基酸序列KTSPHFQKFQDIC(CAM)V(K)用于检测PI3K_8的肽；
具有氨基酸序列TQDQQSLSDVEGAYS(R)用于检测PR_1的肽；
具有氨基酸序列KC(CAM)C(CAM)QAGMVLGGR(K)用于检测PR_2的肽；
具有氨基酸序列FYQLTKLLDNLHDLV(K)用于检测PR_3的肽；
具有氨基酸序列ALSVEFPE(Met[O])(Met[O])SEVIAAQLP(K)用于检测PR_4的肽；
具有氨基酸序列SSYIRELI(K)用于检测PR_5的肽；
具有氨基酸序列RA[Met(O)]EGQHNYLC(CAM)AGRNDC(CAM)IVDKIR(R)用于检测PR_6的肽；
具有氨基酸序列ALDAVALPQPVGVPNESQALSQ(R)用于检测PR_7的肽；
具有氨基酸序列SYKHVSGQMLYFAPDLILNEQ(R)用于检测PR_8的肽；
具有氨基酸序列IYNLC(CAM)AERHYDTAKFNC(CAM)(R)用于检测PTEN_1的肽；
具有氨基酸序列AQEALDFYGEV(R)用于检测PTEN_2的肽；
具有氨基酸序列DKKGVTIPSQR(R)用于检测PTEN_3的肽；
具有氨基酸序列VKIYSSNSGPT(R)用于检测PTEN_4的肽；
具有氨基酸序列YFSPNF(K)用于检测PTEN_5的肽；
具有氨基酸序列NNIDDVV(R)用于检测PTEN_6的肽；
具有氨基酸序列ADNDKEYLVLTLTKNDLD(K)用于检测PTEN_7的肽；
具有氨基酸序列ISAFGYLEC(CAM)SA(K)用于检测rhoA_1的肽；
具有氨基酸序列FKRFPCLSLLSSWGY(R)用于检测rhoA_6的肽；
具有氨基酸序列EVFE(Met[O])AT(R)用于检测rhoAC_1的肽；
具有氨基酸序列HFC(CAM)PNVPIILVGNK(K)用于检测rhoAC_2的肽；
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具有氨基酸序列IGAFGYMECSA(K)用于检测rhoC_1的肽；
具有氨基酸序列QVELALWDTAGQEDYD(R)用于检测rhoC_2的肽；
具有氨基酸序列DGVREVFEMATRAALQA(R)用于检测rhoC_3的肽；
具有氨基酸序列LGAGPGDAGEVQAHPFF(R)用于检测S6K_1的肽；
具有氨基酸序列FSLSGGYWNSVSDTA(K)用于检测S6K_2的肽；
具有氨基酸序列LTAALVL(R)用于检测S6K_3的肽；
具有氨基酸序列HPWIVHWDQLPQYQLN(R)用于检测S6K_4的肽；和
具有氨基酸序列DSPGIPPSANAHQLF(R)用于检测S6K_5的肽，
其中A表示丙氨酸，R表示精氨酸，N表示天冬酰胺，D表示天冬氨酸，C表示半胱氨酸，E表示谷氨酸，Q表示谷氨酰胺，G表示甘氨酸，H表示组氨酸，I表示异亮氨酸，L表示亮氨酸，K表示赖氨酸，M表示甲硫氨酸，F表示苯丙氨酸，P表示脯氨酸，S表示丝氨酸，T表示苏氨酸，W表示色氨酸，Y表示酪氨酸，V表示缬氨酸，(K)表示氘化赖氨酸，(R)表示氘化精氨酸，[S]表示磷酸化丝氨酸，[Y]表示磷酸化酪氨酸，[Met(O)]或(Met[O])表示氧化的甲硫氨酸残基，(CAM)表示其前的氨基酸残基的脲甲基化修饰。
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