DE102017219909A1

DE102017219909A1 - Proteogenomisches Analysesystem und -verfahren

Info

Publication number: DE102017219909A1
Application number: DE102017219909.1A
Authority: DE
Inventors: Jared Isaac; Craig Dufresne; David Sarracino; Robert Brown; Kirk Elliott
Original assignee: Richard Allan Scientific LLC
Current assignee: Richard Allan Scientific LLC
Priority date: 2016-11-09
Filing date: 2017-11-09
Publication date: 2018-05-09
Also published as: CN108059649A; GB2561039A; GB201717399D0; US20180128832A1

Abstract

Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäure- und Proteinmolekülen aus einem einzigen Formalin-fixierten, in Paraffin eingebettetem (FFPE) Gewebeprobenschnitt schließen Lysieren der Zellen des Gewebeprobenschnitts, Alkylieren, Reduzieren und enzymatisches Verdauen von Proteinen in dem Lysat und Separieren von Nucleinsäuren, welche in dem Lysat vorhanden sind, von den verdauten Proteinen, ein. Die Zelllyse wird unter Bedingungen durchgeführt, die Extraktion von DNA, RNA und Proteinen, die für die genomische und proteomische Analyse geeignet sind, erlauben. Insbesondere sind die Pufferbedingungen, die Reaktionszeit und die Temperatur der Lysereaktion so, dass eine geeignete Menge an DNA, RNA und Proteinen freigesetzt wird und in einem stabilen Zustand zur Separierung und proteogenomischen Analyse ist. Systeme zur Durchführung von Verfahren umfassen Reagenzien und Geräte zur Durchführung von Schritten des Verfahrens. Panels zum Detektieren des Vorhandenseins und Levels der Expression von Peptiden zur Unterscheidung zwischen Krankheitszuständen schließen eine Vielzahl von Peptiden ein.

Description

HINTERGRUND
Technisches Gebiet
Die vorliegende Offenbarung betrifft die Isolierung von Nucleinsäure- und Proteinmolekülen aus einer biologischen Probe und insbesondere Systeme, Verfahren und Produkte zur Isolierung von proteogenomischem Material aus einem einzelnen Schnitt von Formalin-fixiertem, in Paraffin eingebettetem (formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE)) Gewebe.
Relevante Technologie
Formalin-fixiertes, in Paraffin eingebettetes (FFPE) Gewebe ist ein übliches Verfahren zur Konservierung und Archivierung von klinischen Proben. FFPE-Gewebeproben können in dünne Gewebeschnitte mit einem Mikrotom oder Cryostaten geschnitten werden und auf pathologische, histologische und molekularbiologische Charakteristika untersucht werden, um Erkrankungen und andere Gewebezustände zu diagnostizieren.
Historisch gesehen wurden FFPE-Proben nicht als eine brauchbare Quelle für molekulare Analysen gesehen. Kürzlich wurde jedoch entdeckt, dass bei geeigneter Verarbeitung ausreichende Mengen DNA oder RNA aus FFPE-Proben isoliert werden können. Die gereinigten Nucleinsäuren können sogar für nachgeschaltete Genom- und Genexpressionsanalysen, wie Polymerase-Kettenreaktion (PCR), quantitative reverse Transkriptions-PCR (qRT-PCR), Mikroarray, Array-basierte vergleichende genomische Hybridisierung (CGH), microRNA, Next Generation Sequencing (NGS) und Methylierungsmusteranalyse, geeignet sein. FFPE-Proben können alternativ verarbeitet werden, um Proteine oder Peptide zu isolieren, die für die nachfolgende Proteomanalyse geeignet sind, einschließlich Massenspektrometrie (MS) oder Immunoassay.
FFPE-Verarbeitungstechniken und -reagenzien, die zur Isolierung von bestimmten zellulärem Material geeignet sind, sind nicht dafür bekannt, zur Isolierung von anderem zellulären Material geeignet zu sein. Zum Beispiel sind harsche Detergenzien und andere Reaktionsbedingungen (wie Zeit und Temperatur), die bei der Verarbeitung von FFPE-Proben zur Isolierung von Zellkern-DNA verwendet werden, nicht für die Isolierung von Proteinen oder RNA, welche zur Analyse geeignet sind, geeignet. Ebenso ist die Verwendung von milden Reagenzien oder Reaktionsbedingungen, welche optimal für die Proteinisolierung und -analyse sind, nicht dafür bekannt, dass sie auch robust genug für die Aufreinigung von Zellkern-DNA sind und können RNA zerstören. Ähnlich sind Bedingungen für die Isolierung von RNA zur weiteren Analyse nicht geeignet für die Isolierung und Analyse von DNA und Protein.
Um diese und andere Probleme zu vermeiden, wurden separate FFPE-Schnitte zur Isolierung und Analyse von DNA, RNA bzw. Proteinen bearbeitet. Ein großer Nachteil bei der Verwendung von separaten Schnitten ist das Risiko, irreführende oder widersprüchliche genomische und proteomische Daten zu erhalten. In einigen Fällen enthalten z.B. benachbarte oder sequentielle Schnitte Zellen mit unterschiedlichen genomischen und proteomischen Profilen. Darüber hinaus sind biopsierte Gewebeproben oft klein, sodass eine begrenzte Anzahl von Microtom- oder Cryostat-Schnitten zur Verfügung steht. Verwendung separater Schnitte für jeden Assay kann die Verfügbarkeit von Gewebeproben, die für Folgestudien zur Verfügung stehen, verringern.
Dementsprechend werden Systeme, Verfahren und Produkte benötigt, welche einige oder alle der oben genannten Unzulänglichkeiten und andere auf dem Fachgebiet bekannte Mängel beheben.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG
Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung lösen ein oder mehrere der vorher genannten Probleme oder andere Probleme auf dem Fachgebiet mit Systemen, Verfahren und Produkten zum Isolieren von Nucleinsäure- und Proteinmolekülen aus einer Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebeprobe. Eine veranschaulichende Ausführungsform schließt Extrahieren von DNA, RNA und Proteinen aus einem einzelnen dünnen Schnitt der FFPE-Gewebeprobe ein. Das Verfahren kann Bereitstellen einer biologischen Probe, die eine Vielzahl von Zellen aufweist, welche Nucleinsäuren (z.B. DNA und/oder RNA) und Proteine enthalten, einschließen. Das Verfahren kann Herstellen eines Lysats der Zellen einschließen, sodass das Lysat die Nucleinsäuren und Proteine unter Bedingungen enthält, die die Extraktion von Nucleinsäuren und Proteinen ermöglichen, welche für eine molekularbiologische Analyse geeignet sind. Zum Beispiel kann in einigen Ausführungsformen die biologische Probe (z.B. der Gewebeschnitt) in einem Lysepuffer inkubiert werden. Die Pufferbedingungen, die Reaktionszeit und/oder die Temperatur der Lysereaktion können so angepasst oder konfiguriert werden, dass eine geeignete Menge an Nucleinsäure und Protein freigesetzt wird und in einem stabilen Zustand zur Separierung und proteogenomischer Analyse ist.
In einigen Ausführungsformen kann das Verfahren (der Reihe nach) Alkylieren, Reduzieren, Verdünnen und/oder enzymatisches Verdauen von Proteinen in dem Lysat einschließen. Geeignete Mengen und/oder Arten von Alkylierungsmittel, Reduktionsmittel, Verdünnungsmittel und/oder Protease können die Eignung der Proteine (oder Peptide) für die Proteomanalyse aufrechterhalten. Nucleinsäuren können von (verdauten) Proteinen (oder Peptiden), welche in der Lysat- oder Reaktionsprobe vorhanden sind, separiert werden. Nucleinsäuren können auf einer Vielzahl von Arten durch eine Vielzahl von Mitteln (z.B. durch Fluorimeter (oder Fluorometer), Spektrometer, Bioanalyzer usw.) quantifiziert werden, (z.B. durch PCR) amplifiziert werden und/oder (z.B. durch NGS) sequenziert werden. Massenspektrometrische Analyse (z.B. Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS)) der separierten verdauten Proteine kann auch durchgeführt werden.
Systeme und Produkte zum Durchführen der Verfahren können Reagenzien und Geräte zum Durchführen von Schritten der vorhergehenden oder anderen hierin beschriebenen Verfahren einschließen. Panels zum Nachweisen des Vorhandenseins und des Levels der Expression von Proteinen, um zwischen Krankheitszuständen (z.B. Krebs-Subtypen) zu unterscheiden, werden hierin auch betrachtet und beschrieben. Solche Panels können eine Vielzahl von Peptiden einschließen, welche angepasst oder konfiguriert sind, um spezifische Proteine oder Peptide, welche in der Probe vorhanden sind, zu detektieren und/oder zu quantifizieren.
Zusätzliche Merkmale und Vorteile beispielhafter Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung werden in der nachfolgenden Beschreibung dargelegt und werden zum Teil aus der Beschreibung offensichtlich oder können durch die Praxis solcher beispielhafter Ausführungsformen erlernt werden. Die Merkmale und Vorteile solcher Ausführungsformen können mittels der in den beigefügten Ansprüchen besonders hervorgehobenen Instrumente und Kombinationen realisiert und erzielt werden. Diese und andere Merkmale werden aus der folgenden Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen vollständiger ersichtlich oder können durch die Praxis solcher beispielhafter Ausführungsformen, wie hiernach dargelegt, erlernt werden.
Es wird darauf hingewiesen, dass jedes der vorher genannten, nachfolgenden und/oder anderen hierin beschriebenen Merkmale eine unterschiedliche Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung darstellen kann. Darüber hinaus stellen Kombinationen von zwei oder mehreren solcher Merkmale unterschiedliche Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung dar. Solche Ausführungsformen können auch in irgendeiner geeigneten Kombination und/oder Reihenfolge kombiniert werden, ohne vom Umfang dieser Offenbarung abzuweichen. Somit kann jedes der hierin beschriebenen Merkmale mit irgendeinem oder mehreren anderen hierin beschriebenen Merkmal/en in irgendeiner geeigneten Kombination und/oder Reihenfolge kombinierbar sein. Dementsprechend ist die vorliegende Offenbarung nicht auf die spezifischen Kombinationen von beispielhaften Ausführungsformen, welche hierin im Detail beschrieben sind, beschränkt.
Figurenliste
Um die Art und Weise, in welcher bestimmte Vorteile und Merkmale der vorliegenden Offenbarung erzielt werden können, zu beschreiben, wird eine Beschreibung der Offenbarung unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen davon, welche in den beigefügten Abbildungen dargestellt sind, erbracht. Es ist zu verstehen, dass diese Abbildungen nur typische Ausführungsformen der Offenbarung darstellen und daher nicht als Einschränkung ihres Umfangs angesehen werden sollten, wobei die Offenbarung mit zusätzlicher Spezifität und zusätzlichem Detail durch die Verwendung der begleitenden Abbildungen beschrieben und erläutert wird, in denen:

1 ein Flussdiagramm ist, das ein Protokoll für die Isolierung von proteogenomischem Material aus einer biologischen Probe gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung zeigt.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Bevor verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung im Detail beschrieben werden, ist zu verstehen, dass diese Offenbarung nicht auf die spezifischen Parameter und die Beschreibung der besonderen beispielhaften Systeme, Verfahren und/oder Produkte, die von einer Ausführungsform zur anderen variieren können, beschränkt ist. Während somit Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung im Detail mit Bezugnahme auf spezifische Konfigurationen, Parameter, Komponenten, Reagenzien usw. beschrieben werden, sind die Beschreibungen veranschaulichend und sollen nicht so ausgelegt werden, dass sie den Umfang der vorliegenden Offenbarung und/oder der beanspruchten Erfindung beschränken. Zusätzlich dient die hier verwendete Terminologie dem Zweck der Beschreibung der Ausführungsformen und soll nicht notwendigerweise den Umfang der vorliegenden Offenbarung und/oder der beanspruchten Erfindung beschränken.
Sofern nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke dieselbe Bedeutung, wie sie üblicherweise von einem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet, auf die sich die vorliegende Offenbarung bezieht, verstanden wird.
Verschiedene Aspekte der vorliegenden Offenbarung, welche Systeme, Verfahren und/oder Produkte einschließen, können mit Bezug auf eine oder mehrere Ausführungsform/en oder Implementierung/en, welche von beispielhafter Natur sind, veranschaulicht werden. Wie hierin verwendet, bedeuten die Ausdrücke „Ausführungsform“ und „Implementierung“ „dienen als ein Beispiel, eine Variante oder eine Veranschaulichung“ und sollten nicht notwendigerweise als bevorzugt oder vorteilhaft gegenüber anderen hier offenbarten Aspekten ausgelegt werden. Zusätzlich schließt der Bezug auf eine „Implementierung“ der vorliegenden Offenbarung oder Erfindung eine spezifische Bezugnahme auf eine oder mehrere Ausführungsform/en, und anders herum, ein und soll veranschaulichende Beispiele ohne den Umfang der Erfindung zu beschränken, der durch die beigefügten Ansprüche und nicht durch die Beschreibung davon angegeben wird, bereitstellen.
Wie in dieser Anmeldung durchgehend verwendet, werden Wörter „können“ und „dürfen“ in einem zulässigen Sinn (d.h. bedeutend mit dem Potenzial zu) anstelle des verbindlichen Sinns (d.h. bedeutend muss) verwendet. Zusätzlich sollen die Ausdrücke „einschließend/einschließlich“, „habend/mit“, „einbeziehend“, „enthaltend“, „gekennzeichnet durch“ sowie Varianten davon (z.B. „schließt ein“, „hat“ und „bezieht ein/involviert“, „enthält“ usw.) und ähnliche Ausdrücke, wie hierin verwendet, einschließlich der Ansprüche allumfassend sein und/oder offen sein, sollen die gleiche Bedeutung wie das Wort „umfassend“ und Varianten davon (z.B. „umfassen“ und „umfasst“) haben und nicht zusätzliche, nicht aufgezählte Elemente und Verfahrensschritte veranschaulichend ausschließen.
Wie in dieser Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen verwendet, berücksichtigen die Singular-Formen „ein“, „eine“ und „der/die/das“ auch Plural-Bezeichnungen, sofern der Zusammenhang nicht eindeutig etwas anderes vorschreibt. Somit schließt z.B. die Bezugnahme auf eine „Nucleinsäure“ eine, zwei oder mehrere Nucleinsäure/n oder Art/en von Nucleinsäure ein. In ähnlicher Weise sollte die Bezugnahme auf eine Vielzahl von Bezugnahmen so interpretiert werden, dass diese eine einzelne Bezugnahme und/oder eine Vielzahl von Bezugnahmen umfassen, sofern nicht der Inhalt und/oder Kontext eindeutig etwas anderes vorschreibt. Somit erfordert die Bezugnahme auf „Nucleinsäuren“ nicht notwendigerweise eine Vielzahl solcher Nucleinsäuren oder eine Vielzahl von Arten der Nucleinsäuren. Stattdessen wird es anerkannt, dass unabhängig von der Konjugation, eine oder mehrere Nucleinsäure/n oder Art/en davon hierin Betracht gezogen wird/werden.
Es versteht sich auch, dass, wenn zwei oder mehrere Werte oder ein Bereich von Werten (z.B. kleiner als, größer als, mindestens und/oder bis zu einem bestimmten Wert, und/oder zwischen zwei genannten Werten) offenbart oder genannt werden/wird, jeder spezifische Wert oder Bereich von Werten, die in die offenbarten Werte oder den Bereich von Werten fallen/fällt, ebenfalls hierin offenbart ist und in Betracht gezogen wird. Somit schließt die Offenbarung einer veranschaulichenden Messung (z.B. Volumen, Konzentration usw.), welche weniger als oder gleich etwa 10 Einheiten oder zwischen 0 und 10 Einheiten ist, eine spezifische Offenbarung veranschaulichend ein: (i) eine Messung von 9 Einheiten, 5 Einheiten, 1 Einheit oder irgendein anderer Wert zwischen 0 und 10 Einheiten, einschließlich 0 Einheiten und/oder 10 Einheiten; und/oder (ii) eine Messung zwischen 9 Einheiten und 1 Einheit, zwischen 8 Einheiten und 2 Einheiten, zwischen 6 Einheiten und 4 Einheiten und/oder irgendeinen anderen Bereich von Werten zwischen 0 und 10 Einheiten.
In bestimmten Ausführungsformen kann die Anordnung und/oder Positionierung bestimmter Verfahrensschritte und/oder Systemkomponenten zur Wirksamkeit und/oder Funktionalität der Ausführungsform beitragen und sogar diese bestimmen. Zusätzlich kann die Durchführung eines ersten Schritts vor einem zweiten Schritt eine nützliche Vorverarbeitung bereitstellen und kann das Ergebnis des zweiten Schritts verändern. Ebenso kann die Durchführung eines zweiten Schritts nach einem ersten Schritt beim Bestimmen des Ergebnisses des zweiten Schritts nützlich sein.
Um das Verständnis zu erleichtern, wurden ähnliche Bezeichnungen (d.h. wie Benennung und/oder Nummerierung von Komponenten und/oder Elementen), wenn möglich, verwendet, um ähnliche Komponenten und/oder Elemente zu bezeichnen, die der schriftlichen Beschreibung und/oder Figuren gemeinsam sind. Es versteht sich jedoch, dass keine Beschränkung des Umfangs der Offenbarung dadurch beabsichtigt ist. Vielmehr sollte es so verstanden werden, dass die Sprache, welche verwendet wird, um die beispielhaften Ausführungsformen zu beschreiben, nur veranschaulichend ist und nicht so auszulegen ist, dass sie den Umfang der Offenbarung einschränkt (sofern eine solche Sprache hierin ausdrücklich als wesentlich beschrieben wird).
Die hierin verwendeten Überschriften dienen nur organisatorischen Zwecken und sollen nicht dazu dienen, den Umfang der Beschreibung oder der Ansprüche einzuschränken.
Die vorliegende Offenbarung betrifft Systeme, Verfahren und Produkte zur Isolierung von Nucleinsäure- und Proteinmolekülen aus einer biologischen Probe, wie beispielsweise einem einzelnen Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebeprobeschnitt. Bestimmte Verfahren können einschließen: (i) Bereitstellen einer biologischen Probe, die eine Vielzahl von Zellen, die Nucleinsäuren (z.B. DNA und/oder RNA) und Proteine enthalten, aufweist, (ii) Herstellen eines Lysats der Zellen unter Bedingungen, die Extraktion von Nucleinsäuren und Proteinen, die für eine molekularbiologische Analyse geeignet sind, erlauben, sodass das Lysat die Nucleinsäuren und Proteine enthält, (iii) Alkylieren, Reduzieren, Verdünnen und/oder enzymatisches Verdauen von Proteinen in dem Lysat, (iv) Separieren von Nucleinsäuren, welche in der Lysat- oder Reaktionsprobe aus verdauten Proteinen oder Peptiden, welche in der Lysat- oder Reaktionsprobe vorhanden sind, vorhanden sind und/oder (v) Durchführen einer molekularbiologischen Analyse, wie Next Generation Sequencing (NGS) und/oder Massenspektrometrie der separierten Nucleinsäuren und/oder Proteine oder Peptide.
Verfahren können es Benutzern ermöglichen, RNA, DNA und Protein aus dem gleichen Schnitt, Stück und/oder FFPE-Gewebe zu isolieren, was Benutzer ferner befähigt, RNA-, DNA- und Proteinstatus und/oder -Charakteristika aus dem gleichen Teil eines Gewebes zu korrelieren. Das Risiko, irreführende oder widersprüchliche genomische und proteomische Daten zu erhalten, kann dadurch verringert werden, da protegenomisches Material aus dem gleichen Schnitt und/oder den gleichen Zellen in die Analyse einbezogen wird. Da ferner ein einzelner dünner Schnitt (ungefähr 7 µm dick) sowohl für die Nucleinsäure- als auch die Proteinanalytik verwendet werden kann, kann der Rest des FFPE-Gewebeblocks für weitere Analysen, welche für spätere Studien benötigt werden können, verfügbar sein.
Systeme und Produkte zum Durchführen von Verfahren können Reagenzien und Geräte zum Durchführen von Schritten der vorhergehenden oder anderer hierin beschriebener Verfahren einschließen. Zum Beispiel können zwei oder mehrere Geräte miteinander verbunden sein oder in Fluidkommunikation angeordnet sein, sodass ein System gebildet wird. Zusätzlich können Peptidpanels zum Detektieren des Vorhandenseins und des Levels der Expression der Peptide zum Unterscheiden zwischen Krankheitszuständen (z.B. Krebs-Subtypen) eine Vielzahl von Peptiden einschließen, die so angepasst oder konfiguriert sind, um spezifische Proteine oder Peptide, die in der Probe vorhanden sind, zu detektieren und/oder zu quantifizieren.
Wie hierin verwendet, betrifft der Ausdruck „Systeme“ auch Vorrichtungen, Geräte, Zusammensetzungen, Baugruppen, Kits usw. Ähnlich betrifft der Ausdruck „Verfahren“ auch Prozesse, Prozeduren, Schritte usw. Darüber hinaus betrifft der Ausdruck „Produkte“ auch Vorrichtungen, Geräte, Zusammensetzungen, Baugruppen, Kits usw.
In mindestens einer Ausführungsform sind die Ausdrücke „Form“, „formen“ und dergleichen offen, sodass Komponenten, die kombiniert, gemischt, gekoppelt usw. werden, ein System, eine Baugruppe, eine Mischung usw. bilden, nicht notwendigerweise das gesamte System, die gesamte Baugruppe, die Mischung usw. bilden. Dementsprechend kann das System, die Baugruppe, das Gemisch usw. genannte Komponenten umfassen, ohne notwendigerweise entweder ganz oder im Wesentlichen aus genannten Komponenten zu bestehen.
Wie hierin verwendet, können die Ausdrücke „Mischung“, „fließfähige Mischung“, „flüssige Mischung“ und dergleichen jede geeignete Zusammensetzung und/oder Kombination der spezifischen Komponenten davon umfassen. Zum Beispiel kann eine fließfähige oder flüssige Mischung eine Lösung, eine Suspension, eine kolloidale Mischung, eine Emulsion oder andere Mischungen flüssiger und/oder nicht-flüssiger Komponenten umfassen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „biologisch“ auf Organismen (z.B. Mikroben, wie Bakterien, Hefe, usw., Pflanzen, Tiere usw.), ob lebend oder nicht-lebend, und/oder Komponenten davon, welche durch diese hergestellt wurden, einschließlich Zellen, Moleküle/Verbindungen (z.B. Nucleinsäuren, Proteine, Fette, Fettsäuren usw.) oder (eine) Kombination(en), (ein) Aggregat(e), (ein) Kristall(e) oder (ein) Präzipitat(e) davon.
Wie hierin verwendet, werden die Ausdrücke „gekoppelt“, „angebracht“, „verbunden“ und/oder „gebunden“ verwendet, um entweder eine direkte Assoziation zwischen zwei Komponenten oder gegebenenfalls eine indirekte Assoziation miteinander durch dazwischenliegende oder zwischengeschaltete Komponenten anzugeben. Wenn im Gegensatz dazu eine Komponente als „direkt gekoppelt“, „direkt angebracht“, „direkt verbunden“ und/oder „direkt gebunden“ mit/an einer andere/n Komponente bezeichnet wird, sind keine dazwischenliegenden Elemente vorhanden oder vorgesehen.
Des Weiteren können Aspekte der vorliegenden Offenbarung durch Beschreiben der Komponenten veranschaulicht werden, die in einer Fluidkommunikation sind oder fließfähig gekoppelt, verbunden usw. sind. Eine solche Fluidkommunikation oder -verbindung wird für den Fachmann auf dem Fachgebiet so verstanden, dass sie mindestens eine Route oder einen Flussweg zwischen den Komponenten impliziert. Im Allgemeinen erfordert eine solche Fluidkommunikation oder -verbindung mindestens einen Fluideinlass und/oder Fluidauslass, der zwischen Komponenten in der Fluidkommunikation und/oder zum Bewirken der Fluidverbindung angeordnet ist. Zusätzlich können „Fluidverbindungen“, „Fluidkopplungen“ und dergleichen, wie hierin verwendet, Fluidströmungswege umfassen, wie sie in Fluidleitungen, -rohren usw. zu finden sind.
Es wird nun Bezug auf die Figuren der vorliegenden Offenbarung genommen. Es ist anzumerken, dass die Figuren nicht notwendigerweise maßstabsgetreu gezeichnet sind und dass die Größe, Reihenfolge, Ausrichtung, Position und/oder Beziehung von oder zwischen verschiedenen Komponenten, welche in den Figuren dargestellt sind, in einigen Ausführungsformen geändert werden können, ohne vom Umfang dieser Offenbarung abzuweichen.
1 ist ein Flussdiagramm, das ein Protokoll oder Verfahren 10 für die Isolierung von proteogenomischem Material aus einer biologischen Probe (z.B. einem einzelnen Schnitt einer FFPE-Gewebeprobe) zeigt. Es versteht sich, dass 1 verschiedene Schritte veranschaulicht, die beim Ausführen bestimmter Aspekte der vorliegenden Offenbarung nützlich sein können. Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung können jedoch weniger Schritte und/oder zusätzliche Schritte als solche, welche explizit in 1 veranschaulicht sind, einschließen.
Veranschaulichend kann eine Ausführungsform einen Schritt 12 des Durchführens einer Gewebebiopsie und/oder Bereitstellens eines Biopsiegewebes einschließen. Schritt 12 kann z.B. durch einen Chirurgen durchgeführt werden. Das Gewebe kann jeder geeignete biologische Gewebetyp, ob erkrankt oder gesund, kanzerös (bösartig) oder gutartig, nekrotisch oder lebend sein oder umfassen. In mindestens einer Ausführungsform kann das Gewebe kanzeröses Gewebe, wie ein(en) Tumor oder eine andere Masse sein oder umfassen. Dementsprechend kann das Biopsiegewebe einen Tumor oder eine andere Biopsie in bestimmten Ausführungsformen umfassen. Eine Liste von Krebsarten, welche biopsiert oder auf andere Weise entnommen werden können, um Gewebe, welches nützlich in den Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung ist, bereitzustellen, kann unter cancer.gov/types gefunden werden, wobei die Liste hierin durch spezifische Bezugnahme aufgenommen wird.
In mindestens einer Ausführungsform kann das Gewebe kleinzelliges oder nicht-kleinzelliges Lungenkrebs- oder -tumorgewebe umfassen. In einigen Ausführungsformen kann das Gewebe einen oder mehrere Subtyp(en) des Lungenkrebs, wie z.B. Plattenepithelzellkarzinom (Epidermoidkarzinom), Adenokarzinom, adenosquamöses Karzinom, sarcomatoides Karzinom usw. umfassen. Bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung können beim Unterscheiden von Krebs-Subtypen nützlich sein. In einigen Ausführungsformen kann das Gewebe Brustkrebs- oder -tumorgewebe sein. Es wird verstanden werden, dass andere Krebstypen und/oder Subtypen hierin auch in Betracht gezogen werden.
Einige Ausführungsformen können einen Schritt 14 des Formalien-Fixierens und des Einbettens der Gewebeprobe in Paraffin umfassen. Systeme, Verfahren und Produkte zur Formalin-Fixierung und Paraffin-Einbettung von Gewebe sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden hierin in Betracht gezogen. Es versteht sich auch, dass einige Ausführungsformen Verwenden von frischem oder frisch gefrorenem Gewebe einschließen können. Das Gewebe kann geschnitten oder anderweitig zur Verarbeitung vorbereitet werden. Zum Beispiel können bestimmte Ausführungsformen einen Schritt 16 des Schneidens von FFPE-Gewebe einschließen. Ein dünner Schnitt des FFPE- oder frisch gefrorenen Gewebeblocks kann unter Verwendung eines Mikrotom- oder Cryostatinstruments, wie solche, kommerziell erhältlich von Thermo Fisher Scientific, hergestellt werden. In einigen Ausführungsformen können FFPE-Gewebeschnitte (oder -scheiben) zwischen 50 Nanometer (nm) und 100 Mikrometer (µm), vorzugsweise zwischen etwa 3-20 µm, bevorzugter zwischen etwa 5-10 µm, am bevorzugtesten etwa 7 µm dick sein.
Einige Ausführungsformen können einen Schritt 18 zum Entparaffinieren des FFPE-Gewebeschnitts einschließen, wie auf dem Fachgebiet bekannt ist. Zum Beispiel kann ein einzelner FFPE-Gewebeschnitt in einen Behälter, wie z.B. ein Probenröhrchen, eine Probenvertiefung, oder ein Gefäß, welcher/welche/welches ein Volumen von zwischen etwa 0,5-15 Milliliter (mL), vorzugsweise zwischen etwa 1-5 mL, bevorzugter zwischen etwa 1,5-2,5 mL, am bevorzugtesten etwa 2 mL, in bestimmten Ausführungsformen überführt und/oder angeordnet werden.
In bestimmten Ausführungsformen kann der FFPE-Gewebeschnitt mit einem organischen Klärungsmittel, wie Xylol, gemischt werden, das auf den Gewebeschnitt aufgebracht und/oder zu dem Behälter hinzugefügt werden kann. Die Probe kann aus dem Gemisch z.B. durch Zentrifugation bei Raumtemperatur (RT) oder anderer Temperatur gewonnen werden.
Die Probe und/oder das Röhrchen können 1-10 Minuten, vorzugsweise etwa 3 Minuten bei zwischen etwa 20-100°C, vorzugsweise zwischen etwa 37-65°C, bevorzugter zwischen etwa 42-58°C, am bevorzugtesten etwa 56°C erwärmt werden, um Paraffin zu schmelzen. Erwärmte Proben können (bei RT oder anderer Temperatur) mit zwischen etwa 1-20.000 UpM, vorzugsweise zwischen etwa 1.000-15.000 UpM, bevorzugter zwischen etwa 5.000-12.000 UpM, am bevorzugtesten etwa 12.000 UpM und/oder zwischen etwa 1-10 Minuten, vorzugsweise zwischen etwa 2-5 Minuten, bevorzugter etwa 2 Minuten zentrifugiert werden, um das Gewebe zu pelletieren.
Das Xylol kann aus dem Behälter und/oder dem pelletierten Gewebe ohne Zerstören des Pellets durch Dekantieren, Pipettieren usw. entfernt werden. Das Pellet kann dann mit einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol (MeOH), Ethanol (EtOH) oder Isopropanol, vorzugsweise Ethanol, gemischt werden. Zum Beispiel können zwischen 0,5-2 mL, vorzugsweise 1 mL 10-100%-iges (in Wasser), vorzugsweise 100%-iges EtOH zu dem Pellet zugefügt werden. Die Probe kann dann (bei RT oder anderer Temperatur) mit zwischen etwa 1-20.000 UpM, vorzugsweise zwischen etwa 1.000-15.000 UpM, bevorzugter zwischen etwa 5.000-12.000 UpM, am bevorzugtesten etwa 12.000 UpM und/oder zwischen etwa 1-10 Minuten, vorzugsweise zwischen etwa 2-5 Minuten, bevorzugter etwa 2 Minuten zentrifugiert werden, um das Gewebe zu pelletieren.
Das organische Lösungsmittel kann aus dem Behälter und/oder dem pelletierten Gewebe ohne Zerstören des Pellets durch Dekantieren, Pipettieren usw. entfernt werden. Das Pellet kann einmal oder mehrere zusätzliche Male nacheinander mit einem organischen Lösungsmittel, wie oben beschrieben, gemischt werden. Das Pellet kann beispielsweise durch Vakuum, Luftströmung oder passiv (für zwischen etwa 1-20 Minuten, vorzugsweise etwa 15 Minuten, bei zwischen etwa 20-100°C, vorzugsweise etwa 37°C) getrocknet werden, bis das Pellet trocken ist und/oder im Wesentlichen das gesamte Lösungsmittel entfernt ist. Das Pellet, welches die entparaffinierte Gewebeprobe umfasst, kann dann verwendet werden, um dann das Multi-Analyt-Lysat, wie hierin weiter beschrieben, herzustellen.
In mindestens einer Ausführungsform kann das Gewebe entparaffiniert werden und/oder ausgewählte Bereiche des FFPE-Gewebeschnitts können beispielsweise durch Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM), wie in Schritt 20, isoliert werden.-Zum Beispiel können FFPE-Gewebeschnitte auf Glas oder einem speziellen LCM-Objektträger, wie ein Polyethylennaphthalat (PEN)-Membranobjektträger geklebt werden. Zum Beispiel kann der Objektträger und/oder der anhaftende Gewebeschnitt ein oder mehrere Mal(e) (z.B. 2-, 3-, 4- oder 5-mal) nacheinander mit und/oder in einer geeigneten Menge eines organischen Klärungsmittels, wie Xylol, behandelt werden. Jede Entwachsungsbehandlung kann 1-5 Minuten, vorzugsweise 3 Minuten, dauern.
Der Objektträger und/oder der anhaftende Gewebeschnitt kann dann ein oder mehrere Mal(e) (z.B. 2-, 3-, 4- oder 5-mal) nacheinander mit einer geeigneten Menge eines organischen Lösungsmittel, wie MeOH, EtOH oder Isopropanol, vorzugsweise 10-100%-iges EtOH, bevorzugter 100%-iges EtOH behandelt werden. Das Gewebe kann dann beispielsweise mit Heamatoxylin und/oder Eosin und/oder, vorzugsweise, dem Arcturus® Paradise® Plus-Färbemittel, welches kommerziell erhältlich von Thermo Fisher Scientific ist, gefärbt werden. Der Färbeschritt kann zwischen etwa 0,1-10 Minuten, vorzugsweise zwischen etwa 0,5-1 Minute dauern. Die gefärbte Probe kann beispielsweise durch abgestufte und/oder aufeinanderfolgende EtOH-Xylol-Behandlungen getrocknet (oder entwässert) werden. Die Objektträger können (dann) (z.B. bei 4°C), bis die LCM, z.B. unter Verwendung eines ArcturusXT™-LCM-Instruments, welches kommerziell von Thermo Fisher Scientific ist, durchgeführt wird, gelagert werden. Proben, die aus einem Gewebeschnitt seziert wurden, können in LCM-Kappen aufgenommen werden und/oder können verwendet werden, um ein Multi-Analyt-Lysat, wie hierin weiter beschrieben, herzustellen.
Ein veranschaulichendes Verarbeitungsprotokoll für Objektträger mit anhaftendem Gewebeschnitt ist nachstehend beschrieben:

Xylol - 3 Minuten
Xylol - 3 Minuten
Xylol - 3 Minuten
Xylol - 3 Minuten
100%-iges Ethanol - 1 Minute
100%-iges Ethanol - 1 Minute
95%-iges Ethanol - 1 Minute
H₂O - 1 Minute
Färbemittel - 5 Minuten (7 µm) und 1 Minute (20 µm)
H₂O - 1 Minute
100%-iges Ethanol - 1 Minute
100%-iges Ethanol -1 Minute
100%-iges Ethanol - 1 Minute
Xylol - 3 Minuten
Xylol - 3 Minuten
Xylol - 3 Minuten

In mindestens einer Ausführungsform kann ein gesamter Schnitt des Gewebes zur globalen Korrelation proteogenomischer Daten verwendet werden. In mindestens einer Ausführungsform kann die Laser-Capture-Mikrodissektion zur gezielten Selektion spezifischer Zelltypen verwendet werden.
Einige Ausführungsformen können die Herstellung eines Multi-Analyt-Lysats einschließen. Zum Beispiel kann eine Ausführungsform einen Schritt 22 des Lysierens der entparaffinierten FFPE-Probe umfassen. Zellen des entparaffinierten FFPE-Gewebeprobenschnitts können beispielsweise durch WärmeLyse in einem geeigneten Lysepuffer, für eine geeignete Dauer, lysiert werden. Insbesondere kann die Zelllyse unter Bedingungen durchgeführt werden, welche Extraktion von Nucleinsäuren (z.B. DNA und/oder RNA) und Proteinen, die für eine genomische und proteomische Analyse geeignet sind oder in einem Zustand für eine genomische oder proteomische Analyse sind, erlauben. Zum Beispiel können die Pufferbedingungen, die Reaktionszeit und die Temperatur der Lysereaktion angepasst oder konfiguriert werden, sodass eine geeignete Menge an DNA, RNA und Proteinen freigesetzt wird und in einem stabilen Zustand für die Separierung und proteogenomische Analyse ist.
In mindestens einer Ausführungsform kann der Lysepuffer (oder die Löyse-Puffer-Lösung) ein Denaturierungsmittel, wie Guanidin-HCl, in einer Konzentration zwischen etwa 0-8 M, ein Puffermittel, wie Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Hydrochlorid (Tris-HCl) in einer Konzentration zwischen etwa 0-250 mM, ein organisches Lösungsmittel, wie etwa n-Propanol, in einer Konzentration zwischen etwa 0-10% V/V, ein chaotropes Mittel, wie Harnstoff, in einer Konzentration von 0-8 M, Natriumcitrat in einer Konzentration von 0-8 M und/oder ein Reduktionsmittel, wie Dithiothreitol (DTT), Dithiobutylamin (DTBA), 2-Mercaptoethanol (2-ME) oder Glutathion, in einer Konzentration zwischen etwa 0-50 mM, bei einem pH zwischen etwa 4-12 einschließen. In einer beispielhaften Ausführungsform kann der Lysepuffer 8 M Guanidin-Hydrochlorid (Gu-HCl), 250 mM Tris-HCl, 2% n-Propanol und 50 mM Dithiothreitol (DTT) bei einem pH von 8,6 umfassen. In einer anderen beispielhaften Ausführungsform kann der Lysepuffer 0,4 M Harnstoff, 200 mM Tris-HCl, 25 mM Natriumcitrat und 50 mM DTT bei pH 7,4 umfassen.
Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, kann die vorhergehende Formulierung oder Zusammensetzung für die Stabilität von RNA, DNA und/oder Protein während der Wärmelyse optimal sein. In anderen Ausführungsformen kann jedoch die Lysepuffer-Formulierung oder -Zusammensetzung für die Stabilität von RNA, DNA und/oder Protein während der Wärmelyse suboptimal sein. Insbesondere können die optimalen Reagenzien, Konzentrationen usw. zur Lyse von DNA anders als zur Lyse von RNA sein, welche (jeweils) anders als zur Lyse von Proteinen sein können. Dementsprechend kann ein Benutzer in bestimmten Ausführungsformen (wenn nötig) auswählen, für welches (proteogenomisches) Makromolekül die Lösung optimiert werden soll. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Lysepuffer-Formulierung oder -Zusammensetzung für (Erhöhen der Stabilität von) RNA-Moleküle(n) in der Probe optimal sein.
In einer Ausführungsform kann die entparaffinierte FFPE-Gewebeprobe (vollständige Schnitte oder LCM) (aus der 7 µm-Scheibe) mit ungefähr 0,5-1,0 mL (0,5 mL, 0,75 mL, 1,0 mL) einer Lysepuffer-Lösung gemischt werden. Andere Mengen werden hierin auch in Betracht gezogen und können von der Dicke des FFPE-Schnitts abhängen.
In einigen Ausführungsformen kann die Lysereaktion bei einer bestimmten Temperatur oder zwischen und/oder innerhalb einem/eines bestimmten Temperaturbereich(s) erfolgen, stattfinden und/oder durchgeführt werden. Zum Beispiel kann die Lyse-Reaktionstemperatur zwischen etwa 25-95°C, vorzugsweise zwischen etwa 55-85°C, bevorzugter zwischen etwa 55-65°C, am meisten bevorzugt etwa 65°C, sein. In einigen Ausführungsformen kann die Lyse-Reaktionstemperatur weniger als etwa 80°C, 78°C, 75°C, 72°C, 70°C, 69°C, 68°C, 67°C oder 66°C und/oder größer als etwa 30°C, 32°C, 37°C, 42°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 61°C, 62°C, 63°C oder 64°C sein.
In einigen Ausführungsformen kann die Lysereaktion für oder über eine bestimmte Zeit oder einen bestimmten Zeitbereich erfolgen, stattfinden und/oder durchgeführt werden. Zum Beispiel kann die Lysereaktionszeit zwischen etwa 0-2 Stunden, vorzugsweise zwischen etwa 2 Minuten bis etwa 1 Stunde, bevorzugter zwischen etwa 5 Minuten bis etwa 30 Minuten, noch bevorzugter zwischen etwa 10 Minuten bis etwa 20 Minuten, am bevorzugtesten etwa 15 Minuten, liegen. In mindestens einer Ausführungsform kann die Lysereaktion ein einzelner/einen einzelnen Lyseschritt oder Zeitraum bei einer einzelnen Lysetemperatur oder einem Lysetemperaturbereich sein oder umfassen.
In einer Ausführungsform kann der Lysepuffer (Reagenzien, gefunden in) MagMAX™-Kit-Lysepuffer, welcher kommerziell erhältlich von Thermo Fisher Scientific™ ist, sein oder umfassen.
In einigen Ausführungsformen kann die Lysereaktion einen ersten Lyseschritt bei einer ersten Temperatur und einen zweiten, nachfolgenden Lyseschritt bei einer zweiten Temperatur umfassen. Die erste Lyseschritttemperatur kann zwischen etwa 25-95°C, vorzugsweise zwischen etwa 45-65°C, bevorzugter zwischen etwa 50-60°C, am bevorzugtesten bei etwa 55°C, liegen. In einigen Ausführungsformen kann die Temperatur des ersten Lyseschritts weniger als etwa 80°C, 78°C, 75°C, 72°C, 70°C, 68°C, 65°C, 60°C, 58°C oder 56°C und/oder größer als etwa 30°C, 32°C, 37°C, 42°C, 45°C, 50°C, 52°C oder 54°C sein. Die Temperatur des zweiten Lyseschritts kann zwischen etwa 25-95°C, vorzugsweise zwischen etwa 65-90°C, bevorzugter zwischen etwa 80-88°C, am bevorzugtesten bei etwa 85°C, liegen. In einigen Ausführungsformen kann die Temperatur des zweiten Lyseschritts weniger als etwa 95°C, 92°C, 90°C, 88°C oder 86°C und/oder größer als etwa 30°C, 32°C, 37°C, 42°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 78°C, 80°C, 82°C oder 84°C sein.
In einigen Ausführungsformen kann in jedem Schritt die Lysereaktion für oder über eine bestimmte Zeit oder einen bestimmten Zeitbereich erfolgen, stattfinden und/oder durchgeführt werden. Zum Beispiel kann die Dauer des ersten Lyseschritts zwischen etwa 0-2 Stunden, vorzugsweise zwischen etwa 15 Minuten bis etwa 1,5 Stunden, bevorzugter zwischen etwa 30 Minuten bis etwa 1,25 Stunden, noch bevorzugter zwischen etwa 45 Minuten bis etwa 1 Stunde, am bevorzugtesten etwa 1 Stunde sein. Die Dauer des zweiten Lyseschritts kann zwischen etwa 0-2 Stunden, vorzugsweise zwischen etwa 15 Minuten bis etwa 1,5 Stunden, bevorzugter zwischen etwa 30 Minuten bis etwa 1,25 Stunden, noch bevorzugter zwischen etwa 45 Minuten bis etwa 1 Stunde, am bevorzugtesten etwa 1 Stunde, sein.
In einer beispielhaften Ausführungsform kann das entparaffinierte FFPE-Gewebe mit ungefähr 0,5 bis 1,0 mL Lysepuffer gemischt werden, welcher 8 M Guanidin-Hydrochlorid (Gu-HCl), 250 mM Tris-HCl, 2% n-Propanol und 50 mM Dithiothreitol (DTT), bei einem pH von 8,6 umfasst und auf 65°C zur Exposition gegenüber dem FFPE-Gewebeschnitt für eine Dauer von ungefähr 15 Minuten erwärmt wird. In einer anderen beispielhaften Ausführungsform kann der Lysepuffer 0,4 M Harnstoff, 200 mM Tris-HCl, 25 mM Natriumcitrat und 50 mM DTT, bei einem pH von 7,4 umfassen, welcher auf ungefähr 55°C zur Exposition gegenüber einem FFPE-Gewebeschnitt für ungefähr 1 Stunde erwärmt wird und dann auf 85°C zur Exposition gegenüber dem Gewebeschnitt für eine weitere Stunde erwärmt wird. In noch einer anderen Ausführungsform kann die entparaffinierte FFPE-Gewebeprobe (ganze Schnitte oder LCM) (aus der 7 µm-Scheibe) mit etwa 0,5 bis 1,0 mL (0,5 mL, 0,75 mL, 1,0 mL) MagMAX™-Kit-Lysepuffer gemischt werden und auf 55°C 1 Stunde und dann auf 85°C 1 Stunde erwärmt werden. Andere Mengen werden hierin auch in Betracht gezogen und können von der Dicke des FFPE-Schnitts abhängen.
Einige Ausführungsformen können einen Schritt 24 des Alkylierens von Proteinen in dem Lysat einschließen. In mindestens einer Ausführungsform kann Alkylieren von Proteinen in dem Lysat Zufügen eines Alkylierungsmittels, wie Iodacetamid (IAM) oder Methylmethanthiosulfonat (MMTS) zu dem Lysat umfassen. Das Alkylierungsmittel kann zu dem Lysat in oder bei einer Konzentration von zwischen etwa 0-5 mM, vorzugsweise zwischen etwa 1-5 mM, bevorzugter zwischen etwa 2-4 mM, am meisten bevorzugt etwa 3,75 mM, abhängig von dem verwendeten Mittel, zugefügt werden. Zum Beispiel kann eine Ausführungsform Zufügen zwischen etwa 1-10 µL, vorzugsweise zwischen etwa 2-5 µL, bevorzugter etwa 3,75 µL 1M IAM oder MMTS (z.B. in 1M Natriumhydrogencarbonat, bei einem pH zwischen etwa 0-10, vorzugsweise bei einem pH von 9), zu dem Lysat einschließen. In mindestens einer Ausführungsform kann die Alkylierungsreaktion im Dunkeln und/oder bei Raumtemperatur (oder anderer geeigneter Temperatur) für eine Dauer zwischen etwa 0-2 Stunden, vorzugsweise zwischen etwa 5 Minuten und etwa 1 Stunde, bevorzugter zwischen etwa 10 Minuten und etwa 45 Minuten, noch bevorzugter zwischen etwa 15 Minuten und etwa 30 Minuten, erfolgen.
Einige Ausführungsformen können einen Schritt 26 des Reduzierens der alkylierten Proteine in dem Lysat einschließen. In mindestens einer Ausführungsform kann Reduzieren der Proteine in dem Lysat Zufügen eines Reduktionsmittels, wie Dithiothreitol (DTT), Tris(2-carboxylethyl)phosphin, Dithiobutylamin (DTBA), 2-Mercaptoethanol (2-ME) oder Glutathion zu dem Lysat umfassen. Das Reduktionsmittel kann zu dem Lysat in oder bei einer Konzentration von zwischen etwa 0-50 mM, vorzugsweise zwischen etwa 0,5-5 mM, bevorzugter zwischen etwa 1-2 mM, am bevorzugtesten etwa 1 mM, abhängig von dem verwendeten Mittel, zugefügt werden. Zum Beispiel kann eine Ausführungsform Zufügen zwischen etwa 0-1000 µL, vorzugsweise zwischen etwa 0,5-5 µL, bevorzugter etwa 1 µL 1M DTT (oder 0,5 µL 2M DTT), zu dem Lysat einschließen. In mindestens einer Ausführungsform kann die Reduktionsreaktion im Dunkeln und/oder bei Raumtemperatur (oder anderer geeigneter Temperatur) für einen Dauer zwischen etwa 0-2 Stunden, vorzugsweise zwischen etwa 5 Minuten und etwa 1 Stunde, bevorzugter zwischen etwa 10 Minuten und etwa 45 Minuten, noch mehr bevorzugt zwischen etwa 15 Minuten und etwa 30 Minuten erfolgen.
Einige Ausführungsformen können einen Schritt 28 des Verdünnens von alkylierten und/oder reduzierten Proteinen in dem Lysat einschließen. Zum Beispiel kann das Lysat mit einem Verdünnungspuffer oder einer Verdünnungslösung verdünnt werden. Der Verdünnungspuffer oder die Verdünnungslösung kann z.B. 0-1000 mM Tris-HCl und 0-1000 mM CaCl₂ bei einem pH zwischen etwa 4-10,0 umfassen. Eine bevorzugte Ausführungsform kann Verdünnen des Lysats in (960 µL) 50 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl₂ mit einer geeigneten Menge (z.B. 40 µL) eines RNase-Inaktivierungsreagens, wie RNAsecure (kommerziell erhältlich von Thermo Fisher Scientific), bei ungefähr pH 8,0 umfassen.
Einige Ausführungsformen können einen Schritt 30 des enzymatischen Verdauens der alkylierten und/oder reduzierten Proteine in dem Lysat einschließen. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, kann enzymatischer Verdau unter Bedingungen durchgeführt werden, welche wirksam sind, Protein-gebundene RNA, DNA innerhalb des Zellkerns und verknüpfte Proteine in Mengen freizusetzen, welche zur nachfolgenden proteogenomischen Analyse ausreichend sind. In mindestens einer Ausführungsform kann enzymatisches Verdauen von Proteinen in dem Lysat Inkubieren des Lysats in der Gegenwart einer Protease, wie Trypsin, Proteinase K, Pepsin usw. umfassen. Die Protease kann zu dem Lysat in oder bei einer Konzentration von zwischen etwa 0-50 mM oder einem Protease-zu-Protein-Endverhältnis von 1:1 bis 1:1000 (G/G), vorzugsweise 1:20 bis 1:100 (G/G), bevorzugter 1:20, abhängig von der verwendeten Protease und/oder der Gesamtproteinkonzentration des Gewebeschnitts zugefügt werden. In mindestens einer Ausführungsform kann die Verdauungsreaktion bei zwischen etwa 25°C bis 62°C, vorzugsweise zwischen etwa 32°C bis 42°C, bevorzugter bei etwa 37°C und/oder für eine Dauer zwischen etwa 1-96 Stunden, vorzugsweise etwa 4-24 Stunden, bevorzugter etwa 16 Stunden erfolgen. Die Verdauungsreaktion kann durch Lagern der Probe bei zwischen etwa -20 bis -80°C, vorzugsweise etwa -20°C, für 0,25-96 Stunden, gestoppt werden.
Eine Ausführungsform kann Rekonstituieren eines 20 µg lyophilisierten Vorrats einer hochaufgereinigten (MSgrade/MS-Qualität) Protease, wie Trypsin, mit zwischen etwa 5-50 µL, vorzugsweise 20 µL, 0,01-1 M, vorzugsweise 50 mM Essigsäure, Adipinsäure, Apfelsäure, Milchsäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure oder Picrinsäure, vorzugsweise Essigsäure, in einer Konzentration zwischen etwa 0,001-10 mg/mL, vorzugsweise etwa 1 mg/mL, einschließen. Das hergestellte Proteaseenzym kann frisch oder aliquotiert in Einzelgebrauchsvolumina verwendet werden und bei -20 bis-80°C, vorzugsweise etwa -80°C, gelagert werden. Dementsprechend können Proteine, welche in dem Lysat vorhanden sind, unter Verwendung eines 1:20-Verhältnises von Trypsin in MS-Qualität (in 50 mM Essigsäure) zu Gesamtprotein, verdaut werden und ungefähr 16 Stunden bei 37°C mit Schütteln inkubiert werden. In einer Ausführungsform kann das Trypsin immobilisiertes Trypsin sein, um eine größere Spezifität und Effizienz der Proteinverdauung zu erreichen.
In mindestens einer Ausführungsform kann die Probe verarbeitet werden, ohne die Proteine irgendeiner signifikanten Menge an Natriumdodecylsulfat (SDS) auszusetzen, welche die Proteomanalyse, wie MS (z.B. durch Beschichten des Proteins und/oder Verhindern der Ionisierung davon), beeinträchtigen, damit interferieren oder stören kann. Verarbeiten von Proben ohne SDS kann jedoch eine wesentliche Herausforderung darstellen, um DNA aus dem Inneren des Zellkerns während der Lyse und/oder des Verdaus freizusetzen und/oder zu isolieren.
In mindestens einer Ausführungsform kann der Verdauungsschritt 30 mit oder unter Verwendung von Proteinase K z.B. in MagMAX™ oder einem anderen Puffer, welcher SDS enthalten kann, durchgeführt werden. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, kann die Verwendung von Proteinase K und/oder SDS eine größere Menge an DNA aus dem Zellkern (verglichen mit tryptischem Verdau und/oder SDS-freier Verarbeitung) freisetzen, während freigesetzte Mengen an RNA und/oder Protein mindestens so hoch mit Proteinase-K-Verdau, wie mit tryptischem Verdau sein kann. Jedoch können Proteinase-K-Verdau- und/oder SDS-Puffer nicht ideal für die nachfolgende Proteomanalyse sein. Trypsin-Verdau- und/oder Guanidin-HCl-Puffer können für die Proteomanalyse besser geeignet sein. Trypsin-Verdau- und/oder Guanidin-HCl-Puffer können jedoch weniger wirksam DNA während der Lyse und/oder des Verdaus freisetzen und/oder isolieren. Zusätzlich kann der verlängerte Zeitraum, der benötigt wird, um DNA unter Verwendung von tryptischem Verdau- und/oder Guanidin-HCl-Puffern freizusetzen und/oder zu isolieren, schädlich für die Stabilität der RNA in der Reaktionsprobe sein.
Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung können einen Kompromiss zwischen dem Bedarf an robuster DNA-Extraktion, sanfter RNA-Behandlung und Proteinanalyseanforderungen erzielen. Solche Kompromiss-Ausführungsformen können nicht die idealsten Reagenzien und/oder Reaktionsbedingungen zur Isolierung von irgendeinem von DNA, RNA und/oder Proteinen darstellen. Jedoch können bestimmte Kompromiss-Ausführungsformen ausreichende Mengen an DNA, RNA und Protein in geeigneten Bedingungen zur nachfolgenden proteogenomischen Analyse, wie PCR, qRT-PCR, CGH, NGS und/oder MS (z.B. LC-MS), herstellen.
Einige Ausführungsformen können einen Schritt 32 des Separierens von Nucleinsäuren (DNA und/oder RNA) von verdauten Proteinen in der Lysat- und/oder Reaktionsprobe einschließen. Zum Beispiel kann RNA, DNA und Protein in Lysat- und/oder Reaktionsprobe unter Verwendung von Magnetpartikelseparationstechnologie, wie in dem Fachgebiet bekannt ist, vorzugsweise unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkeitsbearbeitungssystems, wie das Kingfisher™-Magnetische-Partikel-Instrument und verwandte Kits (z.B. Kingfisher Pure RNA™-Isolierungskit), welche kommerziell erhältlich von Thermo Fisher Scientific sind, separiert werden.
Beispielsweise kann/können ein oder mehrere Aliquot(e) von jeweils ungefähr 450 µL aus dem Reaktionsgemisch (für jede RNA-Extraktion und DNA-Extraktion) entfernt werden. RNAse A oder DNase I kann gegebenenfalls zu dem Aliquot zur Verdauung von RNA (im Fall der DNA-Isolierung) oder DNA (im Fall der RNA-Isolierung) hinzugefügt werden, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist. RNA oder DNA können dann aus der Probe entfernt werden. Zum Beispiel können magnetische Kügelchen zu der Reaktionsprobe hinzugefügt werden. Die Kügelchen können freie Nucleinsäuren (NA) binden oder, andersherum, aus dem Lysat gebunden werden. Ein magnetischer Stab oder ein anderes Element kann die magnetischen Kügelchen mit gebundenen NA, welche gewaschen werden können (z.B. mit Alkohol und/oder geeignetem Waschpuffer), entfernen. Die NA können dann von den Kügelchen (z.B. mit (Nuclease-freiem) Wasser und/oder geeignetem Elutionspuffer) eluiert werden und für nachfolgende Assays (z.B. PCR, RTqPCR, Mikroarray, CGH und/oder NGS) vorbereitet werden. In einigen Ausführungsformen können 25-100 µL, vorzugsweise 50 µL, NA für jedes Aliquot eluiert werden.
Einige Ausführungsformen können einen Schritt 34 des Analysierens von separierten Nucleinsäuren (DNA und/oder RNA) einschließen. RNA und/oder DNA können zum Beispiel mit einem Qubit®-Fluorometer (kommerziell erhältlich von Thermo Fisher Scientific), um die Menge an NA in der Probe zu quantifizieren, mit einem Bioanalyzer-Instrument (z.B. der Agilent™ 2100-Bioanalyzer, kommerziell erhältlich von Agilent Technologies), um Fragment-NA zu detektieren, und/oder mit einem NanoDrop™ 2000c-Spektrophotometer (kommerziell erhältlich von Thermo Fisher Scientific), um die relative Reinheit der Probe zu messen, quantifiziert werden.
Nach der Quantifizierung können RNA und DNA durch analytische Verfahren, einschließlich Amplifikation (mittels PCR, qPCR, RTqPCR usw.) und Next-Generation-Sequencing (NGS), wie sie in dem Fachgebiet bekannt sind, analysiert werden. Genomische Analyse (mittels NGS) kann unter Verwendung des Ion Torrent™ Personal Gene Machine™ (PGM)-Instruments, welches kommerziell erhältlich von Thermo Fisher Scientific ist, unter Verwendung von Kits, welche zur Verwendung mit dem PGM-Instrument entworfen wurden (z.B. AmpliSeq™ Cancer Hotspot-Panelprodukte, welche 50 Gene targetieren, erhältlich von Thermo Fisher Scientific), durchgeführt werden.
Proteine können auch aus der Lysat- oder Reaktionsmischung gewonnen werden. Zum Beispiel kann mindestens ein Teil der verbliebenen Lysat- oder Reaktionsprobe (nach Entnehmen der Aliquote zur NA-Isolierung, -Reinigung und/oder -Analyse) zur Proteingewinnung verarbeitet werden. Proteine können auch (oder alternativ) aus einem oder mehreren (der) DNA- und/oder RNA-Aliquot(e) (z.B. nach magnetischem Entfernen der NA) gewonnen werden. In mindestens einer Ausführungsform kann die verbliebene Lysat- oder Reaktionsprobe mit den separierten DNA- und RNA-Aliquotresten kombiniert werden und zur nachfolgenden Reinigung und Proteinanalyse durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) vorbereitet werden. Die kombinierten RNA- und DNA-Reste können zwischen etwa 900-1800 µL Probe bereitstellen und das ursprüngliche, nicht verwendete, mit Protease verdaute Lysat kann etwa 100 µL Probe in bestimmten Ausführungsformen bereitstellen.
Einige Ausführungsformen können einen Schritt 36 des Analysierens von Proteinen und/oder Peptiden, wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, einschließen. In bestimmten Ausführungsformen kann die Analyse LC-MS einschließen. Beispielsweise kann/können eine einzelne oder kombinierte Probe(n) zum Beispiel unter Verwendung eines Vakuum-Konzentrators (z.B. Speedvac™ Vacuum Concentrator, kommerziell erhältlich von Thermo Fisher Scientific) getrocknet werden. Die getrocknete Probe kann dann auf ein Endvolumen von 1 mL unter Verwendung 0,1% Ameisensäure in Wasser mit LC-MS-Qualität, wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, gebracht werden. Peptide können ferner durch Festphasen-Extraktion unter Verwendung von C4-, C12- oder C18- (C18)-Harz in Kartuschen oder Platten z.B. einer HyperSep™ Retain CX (30 mg) 96-Well-Platte, kommerziell erhältlich von Thermo Fisher Scientific, aufgereinigt und konzentriert werden. Die Platten können mit 1 mL 1% Ammoniumhydroxid, 75% Isopropylalkohol in Wasser mit LC-MS-Qualität und Anlegen von Vakuumdruck konditioniert werden. Die Wells können mit 1 mL 0,1% Ameisensäure in Wasser mit LC-MS-Qualität und Anlegen von Vakuumdruck äquilibriert werden. Die Platten können nochmals mit 1 mL 1% Ammoniumhydroxid, 75% Isopropylalkohol in Wasser mit LC-MS-Qualität und Anlegen von Vakuumdruck konditioniert werden.
In einigen Ausführungsformen kann ein konditioniertes und äquilibriertes Well mit 1 mL der hergestellten Peptidprobe beladen werden. In einem Hochdurchsatzsystem können in separierte konditionierte bzw. äquilibrierte Wells mit verschiedenen hergestellten Peptidproben beladen werden. Vakuumdruck kann angelegt werden, um die Proben durch das/die Well(s) laufen zu lassen. Das/die Well(s) kann/können mit 1 mL 0,1% Ameisensäure in Wasser mit LC-MS-Qualität gewaschen werden und (z.B. zweimal) mit 1 mL 10-100%-igem Isopropylalkohol (IPA), vorzugsweise 10%-igem IPA, in 0,1%-iger Ameisensäure gewaschen werden.
Die Peptide können unter Verwendung von 100 µL 1% Ammoniumhydroxid, 75% Isopropylalkohol in Wasser mit LC-MS-Qualität (z.B. dreimal) eluiert werden. Die eluierten Peptidproben können zur Trockene konzentriert werden, in 25 µL 0,1% Ameisensäure in Wasser resuspendiert werden und durch HPLC/MS in Erkennungs- oder gezielten Massenspektrometrie-Modi analysiert werden. Proteomische (MS)-Analyse kann unter Verwendung des Q-Exactive™-Massenspektrometers (kommerziell erhältlich von Thermo Fisher Scientific) durchgeführt werden.
Die vorangegangenen oder andere Verfahren können es den Benutzern ermöglichen, RNA, DNA und Protein aus dem gleichen Schnitt, Stück und/oder Quadrant des Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebes zu isolieren. In Kombination mit Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) können die Verfahren den Benutzern ermöglichen, RNA-, DNA- und Proteinstatus und/oder -Eigenschaften aus dem gleichen Teil eines Gewebes zu korrelieren. Das Risiko, irreführende oder widersprüchliche genomische und proteomische Daten zu erhalten, kann dadurch verringert werden (da (proteogenomisches Material aus (dem)) der gleiche(n) Schnitt und/oder (den) die gleichen Zellen in die Analyse einbezogen werden). Da ein einzelner dünner Schnitt (ungefähr 7 µm) sowohl für Nucleinsäureals auch Proteinanalytik verwendet werden kann, kann der Rest des FFPE-Gewebeblocks für weitere Analysen, wie sie für spätere Studien benötigt werden können, verfügbar sein.
In mindestens einer Ausführungsform kann/können ein oder mehrere der vorangegangenen oder andere Geräte, Reagenzien, Kits usw. (Fluid) gekoppelt, kombiniert und/oder verbunden sein, um ein (einzelnes, eigenständiges) System zur Extraktion, Herstellung, Isolierung und/oder proteogenomischen Analyse eines oder mehrerer biologischen Moleküls/biologischer Moleküle (z.B. Nucleinsäure, wie DNA und/oder RNA, Proteine und/oder Peptide usw.) zu bilden. Solche Systeme können effiziente und kosteneffektive Mittel zur Durchführung der proteogenomischen Analyse für eine Vielzahl von beabsichtigten Zwecken bereitstellen. Beispielsweise können Systeme, Verfahren und/oder Produkte der vorliegenden Offenbarung bei der Differenzierung von Krebs-Subtypen nützlich sein. Dementsprechend können bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung Systeme, Verfahren und/oder Produkte zur Differenzierung von Krebs-Subtypen einschließen. Solche Ausführungsformen kann/können ein oder mehrere der vorangegangenen oder andere Geräte, Reagenzien, Kits, Verfahren, Schritte usw. einschließen, umfassen und/oder einbeziehen.
Eine oder mehrere Ausführungsform(en) kann/können ein Peptidpanel einschließen. Das Panel kann eine Vielzahl von Peptiden zum Identifizieren des Vorhandenseins eines oder mehrerer Protein(e) in einer Probe, wie einem FFPE-Gewebeschnitt, umfassen, wobei zwischen Krebs-Subtypen (die mit den identifizierten Proteinen assoziiert sind) unterschieden wird und/oder wobei Level der Expression des Wirkstofftargets gemessen wird. In mindestens einer Ausführungsform können Proteine, die auf bestimmte Krebsarten oder Krebs-Subtypen hinweisen, identifiziert werden, (quantitativ) gemessen oder das Vorhandensein kann in einer Probe durch Detektieren eines oder mehrerer Peptids/Peptide der Proteine bestimmt werden.
Beispielsweise kann die spezifische Form der Proteine MET, EGFR, HER2 und KRAS in einem kanzerösem (z.B. Lungen- oder Brust-) Gewebe, welches biopsiert und als FFPE-Gewebeprobe präpariert wurde, durch Implementierung von einer oder mehreren Ausführungsform(en) der vorliegenden Offenbarung bestimmt werden. Solch eine Bestimmung kann zum Unterscheiden zwischen (Lungen- oder Brust-) Krebs-Subtypen (z.B. Epithelkarzinom, Adenokarzinom usw.) und zur Erkennung des Levels der Expression dieser Proteine (d.h. potentielle Wirkstofftargets) nützlich sein.

Das Panel kann eine geeignete Anzahl Peptide zum Identifizieren einer geeigneten Anzahl (z.B. zwischen etwa 3-5, 7-9, 10-12 usw.) von Proteinvarianten, die einen bestimmten Krebstyp anzeigen, einschließen. Jedes Peptid kann ein oder mehrere, zwei oder mehrere, eine Vielzahl, mindestens 3, mindestens 4 oder mindestens 5 Übergangsmetallionen haben. Ein veranschaulichendes Panel von Peptiden ist in der folgenden Liste veranschaulicht. Die Auflistung schließt eine Vielzahl von Peptiden ein, von denen eine geeignete Anzahl zum Identifizieren von Proteinvarianten, die auf einen bestimmten Krebstyp, wie Brust- oder Lungenkrebs, hinweisen, nützlich sein kann wie nachstehend angegeben:

Proteinname	Peptidsequenz
BRUST
4E-BP1_1	IIYDRKFL(Met[O])EC(CAM)RNSPVTKTPP(R)
4E-BP1_2	KFLMEC(R)
4E-BP1_3	NSPVTKTPP(R)
4E-BP1_4	FLMEC(R)
AKT_1	DLKLENLMLDKDGHI(K)
AKT_2	EGWLHKRGEYIKTWRP(R)
AKT_3	ATGRYYAM(K)
AKT_4	LPFYNQDHE(K)
AKT_5	KLSPPFKPQVTSETDT(R)
AKT_6	KEVIVAKDEVAHTLTEN(R)
AKT_7	HPFLTALKYSFQTHD(R)
AKT_8	ERVFSEDRA(R)
AR_1	MYSQC(CAM)V(R)
AR_2	QLVHVV(K)
AR_3	RFYQLTKLLDSVQPIA(R)
AR_4	GAFQNLFQSVREVIQNPGP(R)
AR_5	FFDEL(R)
AR_6	SFTNVNSRMLYFAPDLVFNEY(R)
AR_7	SHMVSVDFPEMMAEIISVQVP(K)
BRAF_1	SNPKSPQKPIVRVFLPNKQ(R)
BRAF_10	RLMAEC(CAM)LK(K)
BRAF_2	LLFQGF(R)
BRAF_3	DLKSNNIFLHEDLTV(K)
BRAF_4	DQIIFMVGRGYLSPDLSKV(R)
BRAF_5	TFFTLAFC(CAM)DFC(CAM)(R)
BRAF_6	LDALQQ(R)
BRAF_7	C(CAM)GVTVRDSLK(K)
BRAF_8	GLIPEC(CAM)C(CAM)AVY(R)
BRAF_9	QTAQGMDYLHA(K)
Caspase3_1	SGTDVDAANL(R)
Caspase3_2	LFIIQAC(R)
Caspase6_1	IFIIQAC(CAM)(R)
Caspase6_2	FSDLGFEV(K)
Caspase6_3	RGIALIFNHE(R)
Caspase6_4	GNQHDVPVIPLDVVDNQTE(K)
Caspase6_5	EMFDPAE(K)
Caspase6_6	GHPAGGEENMTETDAFY(K)
Caspase8_1	V(Met[O])LYQISEEVSRSEL(R)
Caspase8_2	RVC(CAM)AQIN(K)
Caspase8_3	GDDILTILTEVNYEVSNKDDK(K)
Caspase8_4	QMPQPTFTLR(K)
Caspase9_1	TRTGSNIDC(CAM)EKL(R)
Caspase9_2	IVNIFNGTSC(CAM)PSLGGKP(K)
Caspase9_3	QMPGC(CAM)FNFL(R)
Caspase9_4	LSKPTLENLTPVVLRPEI(R)
Caspase9_5	QLIIDLET(R)
cMyc_1	LASYQAAR(K)
cMyc_2	VKLDSV(R)
cMyc_3	SSDTEENVKRRTHNVLE(R)
cMyc_4	DQIPELENNEKAP(K)
cMyc_5	HKLEQL(R)
cMyc_6	KATAYILSVQAEEQKLISEEDLLR(K)
CTLA4_1	A(Met[O])HVAQPAVVLASS(R)
CTLA4_2	A(Met[O])DTGLYIC(CAM)(K)
ER_1	EAGPPAFYRPNSDNR(R)
ER_2	LASTNDKGSMAMESAKET(R)
ER_3	QRDDGEGRGEVGSAGDM(R)
ER_4	LLFAPNLLLD(R)
ER_5	KC(CAM)YEVGMM(K)
ER_6	RSIQGNRHNDY[Met(O)]CPATNQCTID(K)
ER_7	SIQGHNDY[Met(O)]C(CAM)PATNQC(CAM)TID KNR(R)
ERK_1	IADPEHDHTGFLTEYVAT(R)
ERK_2	FRHENVIGI(R)
ERK_3	EIQILL(R)
ERK_4	NYLQSLPS(K)
ERK_5	ALDLLD(R)
ERK_6	TKVAWA(K)
ERK_7	IC(CAM)DFGLA(R)
ERK_8	LFPKSDS(K)
FGFR1_1	NGKEFKPDH(R)
FGFR1_2	TSNRGHKVEVSWEQ(R)
FGFR1_3	FKC(CAM)PSSGTPNPTL(R)
FGFR2_1	GATPRDSGLYACTAS(R)
FGFR4_1	HQHWSLVMESVVPSD(R)
MAPK_1	VADPDHDHTGFLTEYVAT(R)
MAPK_2	DLKPSNLLLNTTC(CAM)DL(K)
MAPK_3	LFPNADS(K)
MAPK_4	GQVFDVGP(R)
MAPK_5	APEI(Met[O])LNS(K)
MAPK_6	LKELIFEETA(R)
MEK1_1	ISELGAGNGGVVF(K)
MEK1_2	IPEQILG(K)
MEK1_3	DVKPSNILVNS(R)
MEK1_4	SYMSPE(R)
mTOR_1	TLDQSPEL(R)
mTOR_10	DFSHDDTLDVPTQVELLI(K)
mTOR_2	WTLVNDETQAKMA(R)
mTOR_3	LAMAGDTFTAEYVEFEV(K)
mTOR_4	STAMDTLSSLVFQLG(K)
mTOR_5	LMDTNTKGNK(R)
mTOR_6	ELQHYVTMEL(R)
mTOR_7	HC(CAM)ADHFLNSEHKEI(R)
mTOR_8	IVEDWQ(K)
mTOR_9	GNNLQDTL(R)
NFkB-p100_1	QTTSPSGSLL(R)
NFkB-p65_1	APNTAELKIC(CAM)(R)
NFkB-p65_2	NSGSC(CAM)LGGDEIFLLC(CAM)D(K)
NFkB-p65_3	KRTYETF(K)
NFkB-p65_4	TPPYADPSLQAPV(R)
NFkB-p65_5	LPPVLSHPIFDN(R)
NFkB-p65_6	KSPFSGPTDPRPPPR(R)
NFkB-relB_l	KEIEAAIE(R)
NFkB-relB_2	IQLGIDPYNAGSL(K)
NFkB-relB_3	EDISVVFSRASWEG(R)
PCNA_1	LVQGSIL(K)
PCNA_2	C(CAM)AGNEDIITL(R)
PCNA_3	VSDYEM(K)
PCNA_4	DLSHIGDAVVISCA(K)
PCNA_5	FSASGELGNGNI(K)
PCNA_6	SEGFDTYRC(CAM)D(R)
PCNA_7	[Met(O)]PSGEFA(R)
PDL1_1	LFNVTSTLRINTTTNEIFYC(CAM)TF(R)
PDL1_2	LQDAGVY(R)
PDL1_3	LFNVTSTL(R)
PDL1_4	VNAPYN(K)
PDL1_5	CMISYGGADY(K)
PI3K_1	LNTEETVKVHV(R)
PI3K_2	ALETSVAADFYH(R)
PI3K_3	DHESVFTVSLWDC(CAM)DR(K)
PI3K_4	FEPYHDSALA(R)
PI3K_5	SFLGINKE(R)
PI3K_6	YQVVQTLDC(CAM)L(R)
PI3K_7	MAEVASRDP(K)
PI3K_8	KTSPHFQKFQDIC(CAM)V(K)
PR_1	TQDQQSLSDVEGAYS(R)
PR_2	KC(CAM)C(CAM)QAGMVLGGR(K)
PR_3	FYQLTKLLDNLHDLV(K)
PR_4	ALSVEFPE(Met[O])(Met[O])SEVIAAQLP(K)
PR_5	SSYIRELI(K)
PR_6	RA[Met(O)]EGQHNYLC(CAM)AGRNDC(CAM)I VDKIR(R)
PR_7	ALDAVALPQPVGVPNESQALSQ(R)
PR_8	SYKHVSGQMLYFAPDLILNEQ(R)
PTEN_1	IYNLC(CAM)AERHYDTAKFNC(CAM)(R)
PTEN_2	AQEALDFYGEV(R)
PTEN_3	DKKGVTIPSQR(R)
PTEN_4	VKIYSSNSGPT(R)
PTEN_5	YFSPNF(K)
PTEN_6	NNIDDVV(R)
PTEN_7	ADNDKEYLVLTLTKNDLD(K)
rhoA_1	ISAFGYLEC(CAM)SA(K)
rhoA_6	FKRFPCLSLLSSWGY(R)
rhoAC_1	EVFE(Met[O])AT(R)
rhoAC_2	HFC(CAM)PNVPIILVGNK(K)
rhoAC_3	KKLVIVGDGAC(CAM)G(K)
rhoC_1	IGAFGYMECSA(K)
rhoC_2	QVELALWDTAGQEDYD(R)
rhoC_3	DGVREVFEMATRAALQA(R)
S6K_1	LGAGPGDAGEVQAHPFF(R)
S6K_2	FSLSGGYWNSVSDTA(K)
S6K_3	LTAALVL(R)
S6K_4	HPWIVHWDQLPQYQLN(R)
S6K_5	DSPGIPPSANAHQLF(R)
LUNGE
CK5_1	TSFTSVS(R)
CK5_2	YEELQQTAG(R)
CK5_3	AQYEEIAN(R)
CK5_4	EYQELMNT(K)
CK5_5	FVSTTSSS(R)
CK6_1	EYQELMNV(K)
CK6_2	TAAENEFVTL(K)
CK6_3	EELQVTAG(R)
CK6_4	SGFSSISVS(R)
CK6_5	ATGGGLSSVGGGSSTI(K)
CK7_1	LDADPSLQ(R)
CK7_2	GQLEALQVDGG(R)
CK7_3	DVDAAYMS(K)
CK7_4	NEISEMN(R)
CK7_5	LLEGEES(R)
CK20_1	QWYETNAP(R)
CK20_2	LEQEIATY(R)
CK20_3	TTEYQLSTLEE(R)
CK20_4	TVVQEVVDG(K)
CK20_5	VLQIDNAKLAAEDF(R)
MET_1	DLGSELV(R)
MET_2	SVSPTTEMVSNESVDY(R)
MET_2_pY1003	SVSPTTEMVSNESVD[Y](R)
MET_3_L1213L	N(CAM)MLDE(K)
MET_3_L1213V	N(CAM)MVDE(K)
MET_4_Y1248Y	DMYDKEYYSVHN(K)
MET_4_Y1248H	DMHDKEYYSVHN(K)
MET_4_Y1248Y_pY1234	DMYDKE[Y]YSVHN(K)
MET_4_Y1248Y_pY1235	DMYDKEY[Y]SVHN(K)
MET_4_Y1248Y_pY1234_pY1235	DMYDKE[Y][Y]SVHN(K)
MET_5_M1268M	WMALESLQTQ(K)
MET_5_M1268T	WTALESLQTQ(K)
EGFR_1	YSFGAT(CAM)V(K)
EGFR_2	V(CAM)NGIGIGEF(K)
EGFR_3	N(CAM)TSISGDLHILPVAF(R)
HER2_1	DPPFC(CAM)VA(R)
HER2_2	GMSYLEDV(R)
HER2_3	ELVSEFS(R)
HER2_4	SGGGDLTLGLEPSEEEAP(R)
HER2_4_pS1051	[S]GGGDLTLGLEPSEEEAP(R)
HER2_4_pS1054	SGGGDLTLGLEP[S]EEEAP(R)
HER2_4_pS1051_pS1054	[S]GGGDLTLGLEP[S]EEEAP(R)
HER2_5	GLQSLPTHDPSPLQ(R)
HER2_5_pS1100	GLQ[S]LPTHDPSPLQ(R)
HER2_5_pS1007	GLQSLPTHDP[S]PLQ(R)
HER2_5_pS1100_pS1007	GLQ[S]LPTHDP[S]PLQ(R)
KRAS_1	LVVVGAGGVG(K)
KRAS_2A	VKDSEDVPMVLVGN(K)
KRAS_2B	DSEDVPMVLVGN(K)
KRAS_3	SYGIPFIETSA(K)
KRAS_4	QGVDDAFYTLV(R)
NAPSINA_1A	FAIQYGTGRVDGILSED(K)
NAPSINA_1B	VDGILSED(K)
NAPSINA_1C	FAIQYGTG(R)
NAPSINA_2	VGPGLTL(CAM)A(K)
P40/63_1	SATWTYSTEL(K)
P40/63_2	EFNEGQIAPPSHLI(R)
P40/63_3	ICA(CAM)PG(R)
P40/63_4	ETYEMLL(K)
P40/63_5	TPSSASTVSVGSSET(R)

Die obige Auflistung beinhaltet die etablierte Ein-Buchstaben-Konvention für Aminosäurereste und die Interpunktionskonvention für deren Modifikation. Somit entspricht die obige Auflistung dem Folgenden: Alanin (A), Arginin (R), Asparagin (N), Asparaginsäure (D), Cystein (C), Glutaminsäure (E), Glutamin (Q), Glycin (G), Histidin (H), Isoleucin (I), Leucin (L), Lysin (K), Methionin (M), Phenylalanin (F), Prolin (P), Serin (S), Threonin (T), Tryptophan (W), Tyrosin (Y), Valin (V). Darüber hinaus sind deuterierte Reste (Lysin und/oder Arginin) durch Parenthese gekennzeichnet; (X), phosphorylierte Reste (Serin und/oder Tyrosin) sind durch Klammern gekennzeichnet; [X], oxidierte Methioninreste - d.h. Methioninsulfoxid - sind durch die Bezeichnung [Met(O)] oder (Met[O]) gekennzeichnet und Carbamidomethylierung (CAM)-Modifikationen sind durch die Bezeichnung (CAM) nach dem modifizierten Aminosäurereste gekennzeichnet.
Ein Verfahren zur Unterscheidung von Krebs-Subtypen kann ein/e oder mehrere der vorangehenden System(e), Verfahren und/oder Produkt(e) oder Teil(e), Schritt(e) oder Komponente(n) davon einschließen oder einbeziehen. Das Verfahren kann Detektieren eines oder mehrerer des/der Peptid/Peptide (Fragments/Fragmente), welche oben aufgeführt sind, in einer biologischen Gewebeprobe einschließen. Detektion kann Durchführen einer MS-Analyse (wie hierin beschrieben) einschließen. Das Verfahren kann Identifizieren einer oder mehrerer der Proteinvariante/n, welche den Peptiden entspricht/entsprechen, und/oder Durchsuchen einer Datenbank einschließen, um einen Krebs oder einen Krebs-Subtyp, von dem bekannt ist, dass er das/die identifizierte(n) Protein(e) oder Peptid(e) exprimiert, zu bestimmen. Das Verfahren kann automatisch durch bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung durchgeführt werden.
Die relative Menge an detektiertem Protein im Vergleich zu Housekeeping-Proteinen kann bestimmt werden. Wenn verdaute Peptidproben im Erkennungsmodus in LC-MS betrieben werden, werden Peakflächen für jedes der einzelnen Peptide bestimmt. Detektierte Proteine werden durch Vergleichen des Durchschnitts jeder Targetprotein-Peakfläche mit dem Durchschnitt von Housekeeping-Protein-Peakflächen relativ quantifiziert. Um das geeignete Normalisierungs-Housekeeping-Protein zu bestimmen, wird die Gesamtionenzahl für jede Probe mit dem Durchschnitt der Housekeeping-Proteinpeptide mit dem höchsten Rang >n=10, die durch Delta-Score und dann Xcorr-Value sortiert wurden, verglichen. Das ausgewählte Housekeeping-Protein wird durch die kleinste Standardabweichung im Vergleich zur Gesamtionenzahl ausgewählt. Geeignete Housekeeping-Proteine können einschließen: GAPDH, βACTIN, RPSL11, TUBA1A, TUBA1B und andere. Derselbe Prozess wird zur Auswahl der Targetproteinpeptide zur relativen Quantifizierung verwendet. Die gemittelte Peakfläche jedes Proteins dividiert durch die gemittelte Peakfläche der Housekeeping-Proteine liefert den relativen Expressionswert.
Verschiedene Abänderungen und/oder Modifikationen der hierin dargestellten, erfinderischen Merkmale und zusätzliche Anwendungen der hierin dargestellten Prinzipien, welche dem Fachmann auf dem relevanten Fachgebiet und mit dem Besitz dieser Offenbarung einfallen würden, können an den dargestellten Ausführungsformen, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung, wie definiert durch die Ansprüche, abzuweichen, durchgeführt werden und sollen im Umfang dieser Offenbarung liegen. Während verschiedene Aspekte und Ausführungsformen hierin offenbart wurden, werden somit andere Aspekte und Ausführungsformen in Betracht gezogen. Während eine Anzahl von Verfahren und Komponenten ähnlich oder äquivalent zu solchen, welche hierin beschrieben wurden, verwendet werden können, um Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung auszuüben, werden hierin nur bestimmte Komponenten und Verfahren beschrieben.
Es versteht sich auch, dass Systeme, Prozesse und/oder Produkte gemäß bestimmter Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung Eigenschaftsmerkmale (z.B. Komponenten, Mitglieder, Elemente, Teile und/oder Bereiche), welche in anderen Ausführungsformen, die offenbart und/oder hierin beschrieben wurden, einschließen oder anderweitig umfassen können, oder einbezogen werden können. Dementsprechend können die verschiedenen Merkmale bestimmter Ausführungsformen mit anderen Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung kompatibel sein, mit diesen kombiniert werden, darin eingeschlossen sein und/oder in diese einbezogen werden. Somit sollte die Offenbarung bestimmte Merkmale in Bezug auf eine spezifische Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung nicht so ausgelegt werden, dass sie die Anwendung oder Einbeziehung genannter Merkmale auf die spezifische Ausführungsform einschränkt. Es versteht sich vielmehr, dass andere Ausführungsformen auch genannte Merkmale ohne notwendigerweise von dem Umfang der vorliegenden Offenbarung abzuweichen, einschließen können. Darüber hinaus kann, sofern nicht ein Merkmal beschrieben wird, dass dieses ein anderes Merkmal in Kombination mit diesem erfordert, irgendein Merkmal hierin mit einem anderen Merkmal einer gleichen oder einer anderen hierin offenbarten Ausführungsform kombiniert werden. Des Weiteren werden verschiedene gut bekannte Aspekte von dargestellten Systemen, Prozessen, Produkten und dergleichen hierin nicht im besonderen Detail beschrieben, um zu vermeiden, Aspekte der beispielhaften Ausführungsformen zu verschleiern. Solche Aspekte werden jedoch auch hierin in Betracht gezogen.
Die vorliegende Offenbarung kann in anderen spezifischen Formen ausgeführt werden, ohne von ihrem Geist oder ihren wesentlichen Merkmalen abzuweichen. Die beschriebenen Ausführungsformen sind in jeder Hinsicht nur als veranschaulichend und nicht als beschränkend zu betrachten. Der Umfang der Erfindung ist daher eher durch die beigefügten Ansprüche als durch die vorhergehende Beschreibung angegeben. Während bestimmte ausführungsformen und Details hierin eingeschlossen sind und in der beigefügten Offenbarung zum Zweck der Veranschaulichung von Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung dienen, wird es für den Fachmann offensichtlich sein, dass verschiedene Änderungen in den Verfahren, Produkten, Vorrichtungen und Geräten, welche hierin offenbart sind, durchgeführt werden können, ohne von dem Umfang der Offenbarung oder der Erfindung, welche in den beigefügten Ansprüchen definiert ist, abzuweichen. Alle Änderungen, welche innerhalb der Bedeutung und des Äquivalenzbereichs der Ansprüche liegen, sollen innerhalb ihres Umfangs enthalten sein.

Claims

Verfahren zum Extrahieren von Makromolekülen aus einer biologischen Probe, wobei das Verfahren umfasst: Bereitstellen einer biologischen Probe mit einer Vielzahl von Zellen, welche Nucleinsäuren und Proteine enthalten; Lysieren der Zellen, um ein Lysat herzustellen, welches mindestens einen Teil der Nucleinsäuren und Proteine enthält; Alkylieren, Reduzieren und enzymatisches Verdauen der Proteine in dem Lysat; und Separieren der Nucleinsäuren von den verdauten Proteinen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nucleinsäuren DNA und RNA einschließen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die biologische Probe einen Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebeschnitt umfasst, und wobei das Verfahren vorzugsweise Entparaffinieren der biologischen Probe vor dem Lysieren der Zellen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der FFPE-Gewebeschnitt zwischen etwa 3-10 µm dick, vorzugsweise etwa 7 µm dick ist.
Verfahren nach Anspruch 3, ferner umfassend das Erfassen eines Teils des FFPE-Gewebeschnitts durch Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM).
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Lysieren der Zellen das Inkubieren der biologischen Probe in einem Lysepuffer umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Lysepuffer umfasst: ein Denaturierungsmittel, wobei die denaturierende Komponente vorzugsweise Guanidin-HCl in einer Konzentration von bis zu etwa 8 M umfasst; ein Puffermittel, wobei das Puffermittel vorzugsweise Tris(hydroxylmethyl)aminomethan-Hydrochlorid (Tris-HCl) in einer Konzentration von bis zu etwa 250 mM umfasst; ein organisches Lösungsmittel, wobei das organische Lösungsmittel vorzugsweise- n-Propanol in einer Konzentration von bis zu etwa 10 % V/V umfasst und ein Reduktionsmittel, wobei das Reduktionsmittel vorzugsweise Dithiothreitol (DTT), Dithiobutylamin (DTBA), 2-Mercaptoethanol (2-ME) oder Glutathion in einer Konzentration von bis zu etwa 50 mM umfasst, bei einem pH von etwa 4 - 8,6.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Lysepuffer ungefähr 8 M Guanidin-HCl, ungefähr 250 mM Tris-HCl, ungefähr 2 % V/V n-Propanol und ungefähr 50 mM Dithiothreitol (DTT) bei einem pH von ungefähr 8,6 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Inkubieren bei einer Temperatur von nicht mehr als 85°C erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Inkubieren für weniger als 30 Minuten erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Inkubieren bei etwa 65°C etwa 15 Minuten erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Inkubieren bei etwa 55°C etwa 1 Stunde und dann bei etwa 85°C etwa 1 Stunde erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Alkylieren die Zugabe eines Alkylierungsmittels zu dem Lysat umfasst, wobei das Alkylierungsmittel vorzugsweise Iodacetamid (IAM) oder Methylmethanthiosulfonat (MMTS) in einer Konzentration von etwa 0-5 mM umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Reduzieren Hinzufügen eines Reduktionsmittels zu dem Lysat umfasst, wobei das Reduktionsmittel vorzugsweise Dithiothreitol (DTT), Tris(2-carboxyethyl)phosphin, Dithiobutylamin (DTBA), 2-Mercaptoethanol (2-ME) oder Glutathion in einer Konzentration zwischen etwa 0-50 mM umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei enzymatisches Verdauen Inkubieren des Lysats in Gegenwart einer Protease umfasst, wobei die Protease vorzugsweise Trypsin, Proteinase k oder Pepsin in einer Konzentration zwischen etwa 0-50 mM oder in einem endgültigen Verhältnis von Protease zu Protein von 1:1 bis 1:1000 (G/G) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das enzymatische Verdauen ferner das Verdünnen des Lysats mit einem Verdünnungspuffer vor Hinzufügen der Protease umfasst, wobei der Verdünnungspuffer umfasst: ein Puffermittel, wobei das Puffermittel vorzugsweise Tris-HCl in einer Konzentration von bis zu etwa 1000 mM umfasst und einen Metall-Cofaktor, wobei der Metall-Cofaktor vorzugsweise CaCl₂ in einer Konzentration von bis zu etwa 1000 mM umfasst, bei einem pH von etwa 4-10.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Alkylieren, Reduzieren und enzymatisches Verdauen der Reihe nach durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend: Durchführen massenspektrometrischer Analyse der separierten verdauten Proteine und/oder Durchführen einer Nucleinsäureanalyse der separierten Nucleinsäuren.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei: die massenspektrometrische Analyse Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) umfasst und/oder die Nucleinsäureanalyse eine oder mehrere analytische Methode/n, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Quantifizierung; Amplifizierung und Sequenzierung, einschließt.
Verfahren zur Herstellung eines Zelllysats, wobei das Verfahren umfasst: Inkubieren einer biologischen Probe in einem Lysepuffer für weniger als 30 Minuten bei einer Temperatur unter 80°C, wobei die biologische Probe eine Vielzahl von Zellen, die DNA, RNA und Proteine enthalten, aufweist, wobei der Lysepuffer umfasst: ein Denaturierungsmittel, vorzugsweise umfassend Guanidin-HCl in einer Konzentration zwischen etwa 0-8 M; ein Puffermittel, vorzugsweise umfassend Tris-HCl in einer Konzentration zwischen etwa 0-250 mM; ein organisches Lösungsmittel, vorzugsweise n-Propanol in einer Konzentration zwischen etwa 0-10% V/V; und ein Reduktionsmittel, vorzugsweise Dithiothreitol (DTT), Dithiobutylamin (DTBA), 2-Mercapotehtanol (2-ME) oder Glutathion in einer Konzentration zwischen etwa 0-50 mM, bei einem pH zwischen etwa 4-8,6, wobei Inkubieren der biologischen Probe in dem Lysepuffer für weniger als 30 Minuten bei einer Temperatur von nicht mehr als 85°C ausreichend ist, um eine geeignete Menge an DNA aus Zellkernen der Zellen zu extrahieren und die DNA, RNA und Proteine in einem Zustand zu halten, der für eine kombinierte proteogenomische Isolierung und Analyse geeignet ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Lysepuffer 8 M Guanidin-HCl, 250 mM Tris-HCl, 2% n-Propanol und 50 mM Dithiothreitol (DTT) bei einem pH von 8,6 umfasst und das Inkubieren bei etwa 65°C etwa 15 Minuten erfolgt.
Verfahren zur Berechnung der relativen Proteinexpression unter Verwendung von gemittelten, eingestuften LC-MS-Peakflächen von Housekeeping- und Targetproteinen durch Delta-Score und Xcorr-Value.
Panel zur Unterscheidung von Krebs-Subtypen, umfassend zwei oder mehr von: einem Peptid mit Aminosäuresequenz TSFTSVS(R) zum Detektieren von CK5-1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz YEELQQTAG(R) zum Detektieren von CK5-2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz AQYEEIAN(R) zum Detektieren von CK5-3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz EYQELMNT(K) zum Detektieren von CK5-4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz FVSTTSSS(R) zum Detektieren von CK5-5; einem Peptid mit Aminosäuresequenz EYQELMNV(K) zum Detektieren von CK6-1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz TAAENEFVTL(K) zum Detektieren von CK6-2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz EELQVTAG(R) zum Detektieren von CK6-3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz SGFSSISVS(R) zum Detektieren von CK6-4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz ATGGGLSSVGGGSSTI(K) zum Detektieren von CK6-5; einem Peptid mit Aminosäuresequenz LDADPSLQ(R) zum Detektieren von CK7-1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz GQLEALQVDGG(R) zum Detektieren von CK7-2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz DVDAAYMS(K) zum Detektieren von CK7-3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz NEISEMN(R) zum Detektieren von CK7-4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz LLEGEES(R) zum Detektieren von CK7-5; einem Peptid mit Aminosäuresequenz QWYETNAP(R) zum Detektieren von CK20-1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz LEQEIATY(R) zum Detektieren von CK20-2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz TTEYQLSTLEE(R) zum Detektieren von CK20-3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz TVVQEVVDG(K) zum Detektieren von CK20-4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz VLQIDNAKLAAEDF(R) zum Detektieren von CK20-5; einem Peptid mit Aminosäuresequenz DLGSELV(R) zum Detektieren von MET_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz SVSPTTEMVSNESVDY(R) zum Detektieren von MET 2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz SVSPTTEMVSNESVD[Y](R) zum Detektieren von MET_2_pY1003; einem Peptid mit Aminosäuresequenz N(CAM)MLDE(K) zum Detektieren von MET_3_L1213L; einem Peptid mit Aminosäuresequenz N(CAM)MVDE(K) zum Detektieren von MET_3_L1213V; einem Peptid mit Aminosäuresequenz DMYDKEYYSVHN(K) zum Detektieren von MET_4_Y1248Y; einem Peptid mit Aminosäuresequenz DMHDKEYYSVHN(K) zum Detektieren von MET_4_Y1248H; einem Peptid mit Aminosäuresequenz DMYDKE[Y]YSVHN(K) zum Detektieren von MET_4_Y1248Y_pY1234; einem Peptid mit Aminosäuresequenz DMYDKEY[Y]SVHN(K) zum Detektieren von MET_4_Y1248Y_pY1235; einem Peptid mit Aminosäuresequenz DMYDKE[Y][Y]SVHN(K) zum Detektieren von MET_4_Y1248Y_pY1234_pY1235; einem Peptid mit Aminosäuresequenz WMALESLQTQ(K) zum Detektieren von MET_5_M1268M; einem Peptid mit Aminosäuresequenz WTALESLQTQ(K) zum Detektieren von MET_5_M1268T; einem Peptid mit Aminosäuresequenz YSFGAT(CAM)V(K) zum Detektieren von EGFR_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz V(CAM)NGIGIGEF(K) zum Detektieren von EGFR_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz N(CAM)TSISGDLHILPVAF(R) zum Detektieren von EGFR_3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz DPPFC(CAM)VA(R) zum Detektieren von HER2_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz GMSYLEDV(R) zum Detektieren von HER2_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz ELVSEFS(R) zum Detektieren von HER2_3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz SGGGDLTLGLEPSEEEAP(R) zum Detektieren von HER2_4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz [S]GGGDLTLGLEPSEEEAP(R) zum Detektieren von HER2_4_pS1051; einem Peptid mit Aminosäuresequenz SGGGDLTLGLEP[S]EEEAP(R) zum Detektieren von HER2_4_pS1054; einem Peptid mit Aminosäuresequenz [S]GGGDLTLGLEP[S]EEEAP(R) zum Detektieren von HER2_4_pS1051_pS1054; einem Peptid mit Aminosäuresequenz GLQSLPTHDPSPLQ(R) zum Detektieren von HER2_5; einem Peptid mit Aminosäuresequenz GLQ[S]LPTHDPSPLQ(R) zum Detektieren von HER2_5_pS1100; einem Peptid mit Aminosäuresequenz GLQSLPTHDP[S]PLQ(R) zum Detektieren von HER2_5_pS1007; einem Peptid mit Aminosäuresequenz GLQ[S]LPTHDP[S]PLQ(R) zum Detektieren von HER2_5_pS1100_pS1007; einem Peptid mit Aminosäuresequenz LVVVGAGGVG(K) zum Detektieren von KRAS_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz VKDSEDVPMVLVGN(K) zum Detektieren von KRAS_2A; einem Peptid mit Aminosäuresequenz DSEDVPMVLVGN(K) zum Detektieren von KRAS_2B; einem Peptid mit Aminosäuresequenz SYGIPFIETSA(K) zum Detektieren von KRAS_3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz QGVDDAFYTLV(R) zum Detektieren von KRAS_4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz FAIQYGTGRVDGILSED(K) zum Detektieren von NAPSINA_1A; einem Peptid mit Aminosäuresequenz VDGILSED(K) zum Detektieren von NAPSINA_1B; einem Peptid mit Aminosäuresequenz FAIQYGTG(R) zum Detektieren von NAPSINA_1C; einem Peptid mit Aminosäuresequenz VGPGLTL(CAM)A(K) zum Detektieren von NAPSINA_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz SATWTYSTEL(K) zum Detektieren von P40/63_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz EFNEGQIAPPSHLI(R) zum Detektieren von P40/63_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz ICA(CAM)PG(R) zum Detektieren von P40/63_3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz ETYEMLL(K) zum Detektieren von P40/63_4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz TPSSASTVSVGSSET(R) zum Detektieren von P40/63_5; einem Peptid mit Aminosäuresequenz IIYDRKFL(Met[O])EC(CAM) RNSPVTKTPP(R) zum Detektieren von 4E-BP1_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz KFLMEC(R)zum Detektieren von 4E-BP1_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz NSPVTKTPP(R) zum Detektieren von 4E-BP1_3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz FLMEC(R) zum Detektieren von 4E-BP1_4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz DLKLENLMLDKDGHI(K) zum Detektieren von AKT_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz EGWLHKRGEYIKTWRP(R) zum Detektieren von AKT_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz ATGRYYAM(K) zum Detektieren von AKT_3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz LPFYNQDHE(K) zum Detektieren von AKT_4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz KLSPPFKPQVTSETDT(R) zum Detektieren von AKT_5; einem Peptid mit Aminosäuresequenz KEVIVAKDEVAHTLTEN(R) zum Detektieren von AKT_6; einem Peptid mit Aminosäuresequenz HPFLTALKYSFQTHD(R) zum Detektieren von AKT_7; einem Peptid mit Aminosäuresequenz ERVFSEDRA(R) zum Detektieren von AKT_8; einem Peptid mit Aminosäuresequenz MYSQC(CAM)V(R) zum Detektieren von AR_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz QLVHVV(K) zum Detektieren von AR_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz RFYQLTKLLDSVQPIA(R) zum Detektieren von AR_3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz GAFQNLFQSVREVIQNPGP(R) zum Detektieren von AR_4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz FFDEL(R) zum Detektieren von AR_5; einem Peptid mit Aminosäuresequenz SFTNVNSRMLYFAPDLVFNEY(R) zum Detektieren von AR_6; einem Peptid mit Aminosäuresequenz SHMVSVDFPEMMAEIISVQVP(K) zum Detektieren von AR_7; einem Peptid mit Aminosäuresequenz SNPKSPQKPIVRVFLPNKQ(R) zum Detektieren von BRAF_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz LLFQGF(R) zum Detektieren von BRAF_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz DLKSNNIFLHEDLTV(K) zum Detektieren von BRAF_3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz DQIIFMVGRGYLSPDLSKV(R) zum Detektieren von BRAF_4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz TFFTLAFC(CAM)DFC(CAM)(R) zum Detektieren von BRAF_5; einem Peptid mit Aminosäuresequenz LDALQQ(R) zum Detektieren von BRAF_6; einem Peptid mit Aminosäuresequenz C(CAM)GVTVRDSLK(K) zum Detektieren von BRAF_7; einem Peptid mit Aminosäuresequenz GLIPEC(CAM)C(CAM)AVY(R) zum Detektieren von BRAF_8; einem Peptid mit Aminosäuresequenz QTAQGMDYLHA(K) zum Detektieren von BRAF_9; einem Peptid mit Aminosäuresequenz RLMAEC(CAM)LK(K) zum Detektieren von BRAF_10; einem Peptid mit Aminosäuresequenz SGTDVDAANL(R) zum Detektieren von Caspase3_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz LFIIQAC(R) zum Detektieren von Caspase3_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz IFIIQAC(CAM)(R) zum Detektieren von Caspase6_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz FSDLGFEV(K) zum Detektieren von Caspase6_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz RGIALIFNHE(R) zum Detektieren von Caspase6_3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz GNQHDVPVIPLDVVDNQTE(K) zum Detektieren von Caspase6_4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz EMFDPAE(K) zum Detektieren von Caspase6_5; einem Peptid mit Aminosäuresequenz GHPAGGEENMTETDAFY(K) zum Detektieren von Caspase6_6; einem Peptid mit Aminosäuresequenz V(Met[O])LYQISEEVSRSEL(R) zum Detektieren von Caspase8_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz RVC(CAM)AQIN(K) zum Detektieren von Caspase8_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz GDDILTILTEVNYEVSNKDDK(K) zum Detektieren von Caspase8_3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz QMPQPTFTLR(K) zum Detektieren von Caspase8_4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz TRTGSNIDC(CAM)EKL(R) zum Detektieren von Caspase9_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz IVNIFNGTSC(CAM)PSLGGKP(K) zum Detektieren von Caspase9_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz QMPGC(CAM)FNFL(R) zum Detektieren von Caspase9_3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz LSKPTLENLTPVVLRPEI(R) zum Detektieren von Caspase9_4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz QLIIDLET(R) zum Detektieren von Caspase9_5; einem Peptid mit Aminosäuresequenz LASYQAAR(K) zum Detektieren von cMyc_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz VKLDSV(R) zum Detektieren von cMyc_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz SSDTEENVKRRTHNVLE(R) zum Detektieren von cMyc_3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz DQIPELENNEKAP(K) zum Detektieren von cMyc_4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz HKLEQL(R) zum Detektieren von cMyc_5; einem Peptid mit Aminosäuresequenz KATAYILSVQAEEQKLISEEDLLR(K) zum Detektieren von cMyc_6; einem Peptid mit Aminosäuresequenz A(Met[O])HVAQPAVVLASS(R) zum Detektieren von CTLA4_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz A(Met[O])DTGLYIC(CAM)(K) zum Detektieren von CTLA4_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz EAGPPAFYRPNSDNR(R) zum Detektieren von ER_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz LASTNDKGSMAMESAKET(R) zum Detektieren von ER_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz QRDDGEGRGEVGSAGDM(R) zum Detektieren von ER 3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz LLFAPNLLLD(R) zum Detektieren von ER 4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz KC(CAM)YEVGMM(K) zum Detektieren von ER_5; einem Peptid mit Aminosäuresequenz RSIQGNRHNDY[Met(O)]CPATNQCTID(K) zum Detektieren von ER_6; einem Peptid mit Aminosäuresequenz SIQGHNDY[Met(O)]C(CAM)PATNQC(CAM)TIDKNR(R) zum Detektieren von ER_7; einem Peptid mit Aminosäuresequenz IADPEHDHTGFLTEYVAT(R) zum Detektieren von ERK 1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz FRHENVIGI(R) zum Detektieren von ERK_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz EIQILL(R) zum Detektieren von ERK 3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz NYLQSLPS(K) zum Detektieren von ERK_4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz ALDLLD(R) zum Detektieren von ERK_5; einem Peptid mit Aminosäuresequenz TKVAWA(K) zum Detektieren von ERK_6; einem Peptid mit Aminosäuresequenz IC(CAM)DFGLA(R) zum Detektieren von ERK_7; einem Peptid mit Aminosäuresequenz LFPKSDS(K) zum Detektieren von ERK_8; einem Peptid mit Aminosäuresequenz NGKEFKPDH(R) zum Detektieren von FGFR1_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz TSNRGHKVEVSWEQ(R) zum Detektieren von FGFR1_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz FKC(CAM)PSSGTPNPTL(R) zum Detektieren von FGFR1_3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz GATPRDSGLYACTAS(R) zum Detektieren von FGFR2_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz HQHWSLVMESVVPSD(R) zum Detektieren von FGFR4_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz VADPDHDHTGFLTEYVAT(R) zum Detektieren von MAPK_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz DLKPSNLLLNTTC(CAM)DL(K) zum Detektieren von MAPK_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz LFPNADS(K) zum Detektieren von MAPK 3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz GQVFDVGP(R) zum Detektieren von MAPK_4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz APEI(Met[O])LNS(K) zum Detektieren von MAPK 5; einem Peptid mit Aminosäuresequenz LKELIFEETA(R) zum Detektieren von MAPK 6; einem Peptid mit Aminosäuresequenz ISELGAGNGGVVF(K) zum Detektieren von MEK1_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz IPEQILG(K) zum Detektieren von MEK1_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz DVKPSNILVNS(R) zum Detektieren von MEK1_3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz SYMSPE(R) zum Detektieren von MEK1_4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz TLDQSPEL(R) zum Detektieren von mTOR_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz DFSHDDTLDVPTQVELLI(K) zum Detektieren von mTOR_10; einem Peptid mit Aminosäuresequenz WTLVNDETQAKMA(R) zum Detektieren von mTOR_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz LAMAGDTFTAEYVEFEV(K) zum Detektieren von mTOR_3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz STAMDTLSSLVFQLG(K) zum Detektieren von mTOR_4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz LMDTNTKGNK(R) zum Detektieren von mTOR_5; einem Peptid mit Aminosäuresequenz ELQHYVTMEL(R) zum Detektieren von mTOR_6; einem Peptid mit Aminosäuresequenz HC(CAM)ADHFLNSEHKEI(R) zum Detektieren von mTOR_7; einem Peptid mit Aminosäuresequenz IVEDWQ(K) zum Detektieren von mTOR_8; einem Peptid mit Aminosäuresequenz GNNLQDTL(R) zum Detektieren von mTOR_9; einem Peptid mit Aminosäuresequenz QTTSPSGSLL(R) zum Detektieren von NFkB-p100_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz APNTAELKIC(CAM)(R) zum Detektieren von NFkB-p65_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz NSGSC(CAM)LGGDEIFLLC(CAM)D(K) zum Detektieren von NFkB-p65_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz KRTYETF(K) zum Detektieren von NFkB-p65_3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz TPPYADPSLQAPV(R) zum Detektieren von NFkB-p65_4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz LPPVLSHPIFDN(R) zum Detektieren von NFkB-p65_5; einem Peptid mit Aminosäuresequenz KSPFSGPTDPRPPPR(R) zum Detektieren von NFkB-p65_6; einem Peptid mit Aminosäuresequenz KEIEAAIE(R) zum Detektieren von NFkB-relB_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz IQLGIDPYNAGSL(K) zum Detektieren von NFkB-relB_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz EDISVVFSRASWEG(R) zum Detektieren von NFkB-relB_3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz LVQGSIL(K) zum Detektieren von PCNA_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz C(CAM)AGNEDIITL(R) zum Detektieren von PCNA_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz VSDYEM(K) zum Detektieren von PCNA_3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz DLSHIGDAVVISCA(K) zum Detektieren von PCNA_4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz FSASGELGNGNI(K) zum Detektieren von PCNA_5; einem Peptid mit Aminosäuresequenz SEGFDTYRC(CAM)D(R) zum Detektieren von PCNA_6; einem Peptid mit Aminosäuresequenz [Met(O)]PSGEFA(R) zum Detektieren von PCNA_7; einem Peptid mit Aminosäuresequenz LFNVTSTLRINTTTNEIFYC(CAM)TF(R) zum Detektieren von PDL1_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz LQDAGVY(R) zum Detektieren von PDL1_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz LFNVTSTL(R) zum Detektieren von PDL1_3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz VNAPYN(K) zum Detektieren von PDL1_4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz CMISYGGADY(K) zum Detektieren von PDL1_5; einem Peptid mit Aminosäuresequenz LNTEETVKVHV(R) zum Detektieren von PI3K_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz ALETSVAADFYH(R) zum Detektieren von PI3K_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz DHESVFTVSLWDC(CAM)DR(K) zum Detektieren von PI3K_3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz FEPYHDSALA(R) zum Detektieren von PI3K_4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz SFLGINKE(R) zum Detektieren von PI3K_5; einem Peptid mit Aminosäuresequenz YQVVQTLDC(CAM)L(R) zum Detektieren von PI3K_6; einem Peptid mit Aminosäuresequenz MAEVASRDP(K) zum Detektieren von PI3K_7; einem Peptid mit Aminosäuresequenz KTSPHFQKFQDIC(CAM)V(K) zum Detektieren von PI3K_8; einem Peptid mit Aminosäuresequenz TQDQQSLSDVEGAYS(R) zum Detektieren von PR_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz KC(CAM)C(CAM)QAGMVLGGR(K) zum Detektieren von PR_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz FYQLTKLLDNLHDLV(K) zum Detektieren von PR_3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz ALSVEFPE(Met[O])(Met[O])SEVIAAQLP(K) zum Detektieren von PR_4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz SSYIRELI(K) zum Detektieren von PR_5; einem Peptid mit Aminosäuresequenz RA[Met(O)]EGQHNYLC(CAM)AGRNDC(CAM)IVDKIR(R) zum Detektieren von PR_6; einem Peptid mit Aminosäuresequenz ALDAVALPQPVGVPNESQALSQ(R) zum Detektieren von PR_7; einem Peptid mit Aminosäuresequenz SYKHVSGQMLYFAPDLILNEQ(R) zum Detektieren von PR_8; einem Peptid mit Aminosäuresequenz IYNLC(CAM)AERHYDTAKFNC(CAM)(R) zum Detektieren von PTEN_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz AQEALDFYGEV(R) zum Detektieren von PTEN_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz DKKGVTIPSQR(R) zum Detektieren von PTEN_3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz VKIYSSNSGPT(R) zum Detektieren von PTEN_4; einem Peptid mit Aminosäuresequenz YFSPNF(K) zum Detektieren von PTEN_5; einem Peptid mit Aminosäuresequenz NNIDDVV(R) zum Detektieren von PTEN_6; einem Peptid mit Aminosäuresequenz ADNDKEYLVLTLTKNDLD(K) zum Detektieren von PTEN_7; einem Peptid mit Aminosäuresequenz ISAFGYLEC(CAM)SA(K) zum Detektieren von rhoA_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz FKRFPCLSLLSSWGY(R) zum Detektieren von rhoA_6; einem Peptid mit Aminosäuresequenz EVFE(Met[O])AT(R) zum Detektieren von rhoAC_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz HFC(CAM)PNVPIILVGNK(K) zum Detektieren von rhoAC_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz KKLVIVGDGAC(CAM)G(K) zum Detektieren von rhoAC_3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz IGAFGYMECSA(K) zum Detektieren von rhoC_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz QVELALWDTAGQEDYD(R) zum Detektieren von rhoC_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz DGVREVFEMATRAALQA(R) zum Detektieren von rhoC_3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz LGAGPGDAGEVQAHPFF(R) zum Detektieren von S6K_1; einem Peptid mit Aminosäuresequenz FSLSGGYWNSVSDTA(K) zum Detektieren von S6K_2; einem Peptid mit Aminosäuresequenz LTAALVL(R) zum Detektieren von S6K_3; einem Peptid mit Aminosäuresequenz HPWIVHWDQLPQYQLN(R) zum Detektieren von S6K_4 und einem Peptid mit Aminosäuresequenz DSPGIPPSANAHQLF(R) zum Detektieren von S6K_5, wobei A Alanin bedeutet, R Arginin bedeutet, N Asparagin bedeutet, D Asparaginsäure bedeutet, C Cystein bedeutet, E Glutaminsäure bedeutet, Q Glutamin bedeutet, G Glycin bedeutet, H Histidin bedeutet, I Isoleucin bedeutet, L Leucin bedeutet, K Lysin bedeutet, M Methionin bedeutet, F Phenylalanin bedeutet, P Prolin bedeutet, S Serin bedeutet, T Threonin bedeutet, W Tryptophan bedeutet, Y Tyrosin bedeutet, V Valin bedeutet, (K) deuteriertes Lysin bedeutet, (R) deuteriertes Arginin bedeutet, [S] phosphoryliertes Serin bedeutet, [Y] phosphoryliertes Tyrosin bedeutet, [Met(O)] oder (Met[O]) oxidierte Methioninreste bedeutet und (CAM) eine Carbamidomethylierungsmodifikation des vorhergehenden Aminosäurerestes bedeutet.