CN115128148A - 一种单细胞蛋白检测双层水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种超灵敏的单细胞蛋白检测双层水凝胶，涉及痕量蛋白检测凝胶技术领域。包括位于下层的聚丙烯酰胺凝胶，所述聚丙烯酰胺凝胶上间隔均匀设置有微孔阵列，所述微孔阵列内载入有单细胞悬液，且聚丙烯凝胶上方铺设有琼脂糖凝胶盖，所述琼脂糖凝胶盖覆盖所述微孔阵列内的单细胞悬液并形成双层水凝胶的上层。本发明通过在聚丙烯酰胺微孔阵列凝胶上形成一层封闭的琼脂糖凝胶，既有闭合微孔降低蛋白溶液损失的优势，又可以保证蛋白质更好的变性便于后续的蛋白质电泳，检测灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的痕量蛋白检测凝胶，特别是涉及一种单细胞蛋白检测双层水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
在任何的细胞群体中，单个细胞之间的差异总是存在的。在肿瘤研究领域，其细胞异质性在很大程度上真正反映了癌症的发生发展。探究细胞间的异质性在癌症的临床治疗和预测中至关重要。对于细胞间基因组和转录组的异质性研究正在大量开展，然而，研究发现mRNA和蛋白质表达是不相关的。蛋白质执行细胞的功能，细胞的蛋白质含量的变化会直接影响着细胞的表型。为了充分的了解癌症细胞群体中的多样复杂性，研究人员需要在现有的蛋白分析技术基础上达到单细胞分辨率的精度分析。
单细胞免疫印迹分析技术是Amy Herr研究团队提出的一项能够测量复杂细胞群中细胞间异质性的高特异性蛋白质分析技术。其结合了聚丙烯酰胺凝胶蛋白质电泳的分子筛效应，基于微孔阵列芯片完成了单细胞的分离，通过原位裂解细胞以及原位电泳的方式实现了单细胞蛋白检测。
该技术基于一块聚丙烯酰胺凝胶的微孔阵列芯片，操作步骤如下：(1)悬浮的单细胞受重力沉降落入芯片上的微孔内；(2)倒入细胞裂解和电泳液，细胞裂解；(3)对微孔内的细胞蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；(4)将凝胶芯片取出暴露在紫外光下，蛋白质跟凝胶内基质反应从而被固定在凝胶上；(5)对固定在芯片上的蛋白进行荧光抗体孵育，芯片荧光扫描仪对荧光信号检出。在这个过程中，基于原位裂解的方式目前存在一定的问题：
开放式的微孔腔室内的细胞在经过裂解后，蛋白溶液会随着热的电泳液溢出孔外，尤其是在加热的电泳液倒入之后，细胞裂解后，一部分蛋白会由于热分子运动流失在电泳液里，从而没有参与后续的凝胶电泳。该步骤造成将近90％的蛋白质损失，损失的蛋白质后续不会被检出，大大的降低了单细胞蛋白免疫检测的灵敏度，这种由于扩散而导致的蛋白质损失有不确定性，会干扰分析单细胞蛋白表达之间的异质性，并且，这也不适用于对于低表达量的蛋白检测，比如最近几年发现的CRISPR-Cas9敲除细胞系里产生的截短蛋白，这种蛋白被证明是低于正常蛋白的表达量的，因而，对于单细胞中痕量蛋白的检测十分不利。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种新型的超灵敏的单细胞蛋白检测水凝胶，应用于单细胞的痕量蛋白免疫印迹研究。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种可以用于单细胞痕量蛋白检测的一种新型的超灵敏的单细胞蛋白检测双层水凝胶及其制备方法和应用，其通过在聚丙烯酰胺微孔阵列凝胶上形成一层封闭的琼脂糖凝胶，既有闭合微孔降低蛋白溶液损失的优势，又可以保证蛋白质更好的变性便于后续的蛋白质电泳。
为实现上述目的，本发明提供了一种超灵敏的单细胞蛋白检测双层水凝胶，包括位于下层的聚丙烯酰胺凝胶，所述聚丙烯酰胺凝胶上间隔均匀设置有微孔阵列，所述微孔阵列内载入有单细胞悬液，且聚丙烯凝胶上方铺设有琼脂糖凝胶盖，所述琼脂糖凝胶盖覆盖所述微孔阵列内的单细胞悬液并形成双层水凝胶的上层。
其中，本发明中，所述琼脂糖凝胶采用如下方法制备：将1％的琼脂糖加热后溶解在裂解缓冲液中，然后置于55℃水浴锅中保存。
进一步的，所述裂解缓冲液为RIPA-like裂解液，所述RIPA-like裂解液终浓度为0.5％SDS、0.1％v/v Triton X-100、0.25％脱氧胆酸钠、12.5mM Tris、96mM glycine的混合液，pH 8.3。
本发明的另一个目的是还提供了一种上述的超灵敏的单细胞蛋白检测双层水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
S1聚丙烯酰胺凝胶的制备：在1.5ml Ep管内，加入25μL 1.5M pH8.8 Tris-Hcl，和166.70μL 30％的混合液，所述混合液为丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺的混合液，再依次加入265.30μL ddH2O和4μL的光敏分子,配置成胶前体溶液，最后加入10μL 5％SDS，10μL 5％TritonX-100，4μL APS，4μL TEMED，轻轻摇匀，即得；
S2制备微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶：滴加S1中制备得到的聚丙烯酰胺凝胶溶液于微孔模具上，并轻缓盖上玻片，避免气泡产生，静置20min，待胶凝固，剥离模具，制成微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶；
S3载入单细胞悬液：将单细胞悬液从微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶上方注入，单个细胞被微孔捕获；
S4双层水凝胶的制备：将琼脂糖凝胶溶液放置室温后，从微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶边缘缓慢滴加琼脂糖凝胶，琼脂糖凝胶在5秒内迅速凝胶化，并在微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶上形成一薄层盖子，得到封闭的含有单细胞的双层水凝胶。
作为本发明的其中一个实施例，步骤S1中，所述混合液中丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的体积比为29:1。
作为本发明的其中一个实施例，步骤S2中，所述微孔模具为硅片上含有1000个直径和高度都是60μm的微孔。
作为本发明的其中一个实施例，步骤S3中，所述单细胞悬液的细胞浓度为1×105个/mL，滴加到所述微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶上的单细胞悬液体积为200μL。
作为本发明的其中一个实施例，步骤S4中，从微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶边缘滴加的琼脂糖凝胶的体积为500μL。
此外，本发明还提供了一种上述的超灵敏的单细胞蛋白检测双层水凝胶或通过上述的超灵敏的单细胞蛋白检测双层水凝胶的制备方法制备而成的双层水凝胶在单细胞蛋白检测中的应用。
具体的，所述双层水凝胶用于单细胞蛋白检测的方法如下：
S11将双层水凝胶放入电泳槽后，缓缓倒入20mL的RIPA-like裂解液，孵育裂解10s，然后进行单细胞免疫印迹凝胶电泳；
S12待电泳完成后，取下琼脂糖凝胶，然后放入紫外灯下固定电泳后的蛋白，再进行抗体孵育和信号检测。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.高蛋白溶液利用率。微孔中的细胞经过裂解液裂解后，由于琼脂糖凝胶的封闭作用，蛋白溶液不会随着孔外的溶液流动而损失。大部分蛋白可以被电泳并且固定在凝胶内。
2.高白变性率。让蛋白溶液不容易渗出而损失的同时，保证了溶液和蛋白质的接触时间，提高蛋白质和裂解溶液的接触时间，让蛋白充分变性，便于后续的蛋白电泳。
3.高单细胞蛋白质检测的灵敏度。通过优化的裂解液孵育时间，优化电泳条件和抗体孵育条件，改进信号分析手段等提高检测灵敏度。
4.保证不会损伤蛋白质二级结构。采用的所有新材料为琼脂糖，新方法操作保证不会影响细胞并且不会损伤蛋白质，影响后续的抗体结合。
5.操作简单，检测快速，以最少的花费成本达到了高灵敏检测的目标。
附图说明
图1为本发明双层水凝胶的结构及工作流程示意图；其中，a.单细胞落孔b.双层凝胶示意图c.凝胶电泳示意图；
图2为本发明中相同条件下有无封闭盖的荧光蛋白的电泳信号对比图；
图3为本发明中相同条件下有无封闭盖的细胞蛋白的电泳信号对比图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1：双层水凝胶结构
如图1所示的一种超灵敏的单细胞蛋白检测双层水凝胶，包括位于下层的聚丙烯酰胺凝胶，在聚丙烯酰胺凝胶上间隔均匀设置有微孔阵列，其中，微孔阵列内载入有单细胞悬液，且聚丙烯凝胶上方铺设有琼脂糖凝胶盖，琼脂糖凝胶盖覆盖微孔阵列内的单细胞悬液并形成双层水凝胶的上层。
通过在微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶上设计一个可以封闭微孔的琼脂糖凝胶盖子，凝胶盖子里主要成分是琼脂糖，琼脂糖成胶后的高密度结构可以防止蛋白质流失，研究表明，在2％的琼脂糖凝胶中，蛋白质大分子的扩散速率是2.7×10-5cm2/s。为了保证盖子的存在不会在后续电泳过程中引入额外的离子，琼脂糖凝胶采用如下方法制备：将1％的琼脂糖加热后溶解在RIPA-like裂解缓冲液(RIPA-like裂解液终浓度为0.5％SDS、0.1％v/vTriton X-100、0.25％脱氧胆酸钠、12.5mM Tris、96mM glycine的混合液，pH 8.3)中，然后置于55℃水浴锅中保存。
实施例2：双层水凝胶的制备
本实施例提供了实施例1的一种双层水凝胶的的制备方法，主要包括以下步骤：
S1聚丙烯酰胺凝胶的制备：在1.5ml Ep管内，加入25μL 1.5M pH8.8 Tris-Hcl，和166.70μL 30％的混合液，其中，混合液为丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺的混合液，且混合液中，丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的体积比为29:1，然后再依次加入265.30μL ddH2O和4μL的光敏分子,配置成胶前体溶液，最后加入10μL 5％SDS，10μL 5％TritonX-100，4μL APS，4μLTEMED，轻轻摇匀，即得；
S2制备微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶：滴加S1中制备得到的聚丙烯酰胺凝胶溶液于微孔模具上，其中，微孔模具为硅片上含有1000个直径和高度都是60μm的微孔，这样，在硅片上凝的聚丙烯酰胺凝胶就有1000个这样尺寸的微孔，方便捕获单细胞，然后轻缓盖上玻片，避免气泡产生，静置20min，待胶凝固，剥离模具，制成微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶；
S3载入单细胞悬液：将细胞浓度为1×105个/mL、体积为200μL的单细胞悬液从微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶上方注入，使单个细胞被微孔捕获；
S4双层水凝胶的制备：将提前准备好的琼脂糖溶液放置室温(约25℃)后，从微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶边缘缓慢滴加500μL琼脂糖凝胶，琼脂糖凝胶在5秒内迅速凝胶化，并在微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶上形成一薄层盖子，即得到封闭的含有单细胞的双层水凝胶。
实施例3：实施例1的双层水凝胶在单细胞蛋白检测中的应用
如图1所示，凝胶主体是载入单细胞悬液的微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶(1(a)双层凝胶的下层)，上层是注入的琼脂糖凝胶盖1(b)。
其工作流程如下：
(1)首先制得PBS单细胞悬液1-2mL(细胞浓度，1×105个/ML)，再将200μL细胞悬液从微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶上方注入，其中单个细胞被微孔捕获，如附图1(a)所示；
(2)将提前准备好的琼脂糖溶液放置室温(约25℃)后，从微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶边缘缓慢滴加500μL琼脂糖凝胶；
(3)琼脂糖在5秒内迅速凝胶化，并在微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶上形成一薄层盖子，此时得到封闭的含有单细胞的微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶1(b)；
(4)将含有单细胞的微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶放入电泳槽后缓缓倒入20mL的RIPA-like裂解液，孵育裂解10s，进行单细胞免疫印迹凝胶电泳。(5)电泳完成后，取下琼脂糖凝胶，然后放入紫外灯下固定电泳后的蛋白，之后再进行抗体孵育和信号检测。(附图1(c)所示)
对比例
取现有技术中，未进行封盖(即上层并未添加琼脂糖凝胶)的水凝胶进行荧光蛋白电泳检测，并在相同条件下，采用本发明制备得到的双层水凝胶进行荧光蛋白电泳检测，其结果分别如图2、图3所示。从中可以看出，由本发明制备得到的双层水凝胶即封闭的水凝胶，较未进行封盖即开放的水凝胶具有更强的荧光蛋白电泳信号和细胞蛋白电泳信号。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种超灵敏的单细胞蛋白检测双层水凝胶，其特征在于：包括位于下层的聚丙烯酰胺凝胶，所述聚丙烯酰胺凝胶上间隔均匀设置有微孔阵列，所述微孔阵列内载入有单细胞悬液，且聚丙烯凝胶上方铺设有琼脂糖凝胶盖，所述琼脂糖凝胶盖覆盖所述微孔阵列内的单细胞悬液并形成双层水凝胶的上层。
2.如权利要求1所述的超灵敏的单细胞蛋白检测双层水凝胶，其特征在于：所述琼脂糖凝胶采用如下方法制备：将1％的琼脂糖加热后溶解在裂解缓冲液中，然后置于55℃水浴锅中保存。
3.如权利要求2所述的超灵敏的单细胞蛋白检测双层水凝胶，其特征在于：所述裂解缓冲液为RIPA-like裂解液，所述RIPA-like裂解液终浓度为0.5％SDS、0.1％v/v Triton X-100、0.25％脱氧胆酸钠、12.5mM Tris、96mM glycine的混合液，pH 8.3。
4.如权利要求1-3任一项所述的超灵敏的单细胞蛋白检测双层水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1聚丙烯酰胺凝胶的制备：在1.5ml Ep管内，加入25μL 1.5M pH8.8 Tris-Hcl，和166.70μL 30％的混合液，所述混合液为丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺的混合液，再依次加入265.30μL ddH2O和4μL的光敏分子,配置成胶前体溶液，最后加入10μL 5％SDS，10μL 5％TritonX-100，4μL APS，4μL TEMED，轻轻摇匀，即得；
S2制备微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶：滴加S1中制备得到的聚丙烯酰胺凝胶溶液于微孔模具上，并轻缓盖上玻片，避免气泡产生，静置20min，待胶凝固，剥离模具，制成微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶；
S3载入单细胞悬液：将单细胞悬液从微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶上方注入，单个细胞被微孔捕获；
S4双层水凝胶的制备：将琼脂糖凝胶溶液放置室温后，从微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶边缘缓慢滴加琼脂糖凝胶，琼脂糖凝胶在5秒内迅速凝胶化，并在微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶上形成一薄层盖子，得到封闭的含有单细胞的双层水凝胶。
5.如权利要求4所述的超灵敏的单细胞蛋白检测双层水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述混合液中丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的体积比为29:1。
6.如权利要求4所述的超灵敏的单细胞蛋白检测双层水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述微孔模具为硅片上含有1000个直径和高度都是60μm的微孔。
7.如权利要求4所述的超灵敏的单细胞蛋白检测双层水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤S3中，所述单细胞悬液的细胞浓度为1×105个/mL，滴加到所述微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶上的单细胞悬液体积为200μL。
8.如权利要求4所述的超灵敏的单细胞蛋白检测双层水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤S4中，从微孔阵列的聚丙烯酰胺凝胶边缘滴加的琼脂糖凝胶的体积为500μL。
9.一种如权利要求1-3任一项所述的超灵敏的单细胞蛋白检测双层水凝胶或如权利要求4-8任一项所述的超灵敏的单细胞蛋白检测双层水凝胶的制备方法制备而成的双层水凝胶在单细胞蛋白检测中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述双层水凝胶用于单细胞蛋白检测的方法如下：
S11将双层水凝胶放入电泳槽后，缓缓倒入20mL的RIPA-like裂解液，孵育裂解10s，然后进行单细胞免疫印迹凝胶电泳；
S12待电泳完成后，取下琼脂糖凝胶，然后放入紫外灯下固定电泳后的蛋白，再进行抗体孵育和信号检测。
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