CN106718181B - 一种鉴定植物对根结线虫抗性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定植物对根结线虫抗性的方法。本发明提供的方法包括如下步骤：(1)将线虫接种植物，进行培养；(2)完成步骤(1)后，取植物根组织，观察线虫在植物根组织中的发育状态；(3)完成步骤(1)后，取植物根组织，对植物根组织中的线虫进行计数；综合上述结果判断植物对线虫的抗性。本研究将甲苯胺蓝应用于根结石蜡切片的染色，找出最佳染色时间，可以很清晰的观察到线虫和巨细胞的发育状态，而且染色时间比较快，效果比较好。针对线虫个数的统计，将研磨法和过筛法结合起来，找出最佳的研磨时间，方便根中线虫个数的统计。这两种方法结合起来应用，可以从线虫的发育状态和线虫的个数两个方面说明植株对线虫的抗性。

Description

一种鉴定植物对根结线虫抗性的方法

技术领域

本发明涉及一种鉴定植物对根结线虫抗性的方法。

背景技术

近年来根结线虫病在设施蔬菜栽培中越来越严重。根结线虫是一种专性寄生线虫，在植物组织中完成它们的生活史。二龄幼虫(J2)从接近分生区部位进入植物组织，向着根尖的中柱移动。伴随着根尖细胞的发育和伸长，其可以迁移到根的成熟区，找到合适的取食位点后，定居下来发育成为三龄幼虫(J3)，刺激头部周围的4-5个薄壁细胞形成大型多核的、新陈代谢活跃的巨细胞，并逐渐形成适合自己生活需要的维管组织，以便于其从巨大细胞中摄取植物营养，直至发育为成虫。雄虫会离开取食位点，雌虫会产卵。卵块会继续孵化成J2，再次侵染植物的根组织。在寄主植物和线虫长期互作的过程中，宿主植物会有某些防御措施来抵抗线虫入侵或破坏线虫的发育。

为了观察根组织中的线虫发育情况，常常用一些染色剂对根组织直接进行染色，例如棉蓝和乳酚，但是，用这类染色剂染色时，操作起来比较复杂，同时也是操作人员长期接触一些有毒的酚类物质。随后研究人员开始用番红-固绿对根结的石蜡切片进行染色，同时可以观察线虫和巨细胞的发育情况。但是，用番红染色一般需要8个小时，染色时间较长。线虫的个数统计，一般用贝曼漏斗法或蔗糖离心法来分离根组织中的线虫，但是贝曼漏斗法的分离效果比较低，不适宜用于线虫个数的统计。蔗糖离心法的糖耗比比较大，而且对仪器设备要求比较高。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定植物对根结线虫抗性的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了甲苯胺蓝作为染色剂在观察线虫在植物根组织中的发育状态中的应用。

本发明还保护一种观察线虫在植物根组织中的发育状态的方法，包括如下步骤：采用甲苯胺蓝作为染色剂，用含有线虫的植物根组织制作石蜡切片并进行染色，然后在显微镜下观察。

所述方法中，采用1％(体积百分比)甲苯胺蓝水溶液对所述石蜡切片进行染色。

所述染色的时间为10-15min。所述染色时间具体可为10min。

具体来说，所述染色程序依次为：(1)将所述石蜡切片置于1％(体积百分比)甲苯胺蓝水溶液中，室温10min；(2)将所述石蜡切片置于蒸馏水中，室温15min；(3)将所述石蜡切片置于乙醇中，室温2min；(4)将所述石蜡切片置于1体积份二甲苯和1体积份乙醇的混合溶液中，室温1min；(5)将所述石蜡切片置于二甲苯中，室温1min。

所述石蜡切片的制作方法依次包括如下步骤：固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片、烘片和脱蜡。

所述固定具体可为将所述植物根组织置于FAA固定液中固定24h。

所述脱水具体可为将固定好的材料依次加入70％乙醇水溶液、85％乙醇水溶液、95％乙醇水溶液和100％乙醇中进行梯度脱水(每个梯度30min)。

所述透明具体可为将脱水后材料加至由1体积份无水乙醇和1体积份二甲苯组成的混合液中浸泡30min，然后转移至二甲苯中浸泡30min，使材料呈透明状。

所述浸蜡具体可为将所述透明状材料浸没于由二甲苯和等体积熔融石蜡(熔点为54-56℃)组成的混合液中，57℃恒温干燥12h，然后使二甲苯充分挥发，60℃恒温干燥2h后弃掉液体，倒入熔融的纯石蜡(熔点为56-58℃)，60℃恒温干燥12h(期间每4个小时换一次纯石蜡)。

所述包埋具体可为取包埋纸盒，倒入熔融石蜡(熔点为56-58℃)，迅速将浸蜡处理后的组织块放入包埋纸盒底部，切面朝下，轻提纸盒，平放于冷水表面，待石蜡表面凝固后立即将纸盒按入水中，保证组织块与周围石蜡完全融为一体。

所述切片和展片具体可为取包埋后得到的蜡块用切片机切片，摊片机进行展片，蜡带轻放在水面上(水温为40℃-42℃)，亮面朝下，将洁净载玻片一端斜倾入水，将蜡带缓缓捞起。

所述烘片具体可为40℃过夜烘片。

所述脱蜡程序具体可为：二甲苯2次，每次10min；1体积份二甲苯+1体积份乙醇，15min；乙醇2次，每次5min；95％乙醇水溶液，5min；85％乙醇水溶液，5min；70％乙醇水溶液，5min；50％乙醇水溶液，5min；30％乙醇水溶液，5min；去离子水，5min。

本发明还保护一种对植物根组织中的线虫进行计数的方法，包括在计数前进行如下前处理的步骤：取含有线虫的植物根组织，进行冻融处理。

所述冻融处理依次包括如下步骤：冷冻、解冻、破碎。

所述冷冻指的是-20℃冷冻24h。

所述解冻指的是室温下自然解冻。

所述破碎指的是18000rpm搅拌5s。

所述破碎具体可采用Joyoung/九阳JYL-C50T榨汁机进行。

所述方法还包括将冻融处理后的组织过筛。

所述过筛具体可采用200目筛。所述200目筛收集的多为雌虫，为三龄和/或四龄幼虫。

所述过筛具体可采用600筛过筛。所述600目筛收集的为四龄幼虫和/或三龄幼虫和/或二龄幼虫。

所述过筛具体可采用200目筛后再采用600筛过筛。所述600目筛收集的多为二龄幼虫。

本发明还保护一种鉴定植物对线虫抗性的方法，包括如下步骤：

(1)将线虫接种植物，进行培养；

(2)完成步骤(1)后，取植物根组织，采用以上任一所述观察线虫在植物根组织中的发育状态的方法观察线虫在植物根组织中的发育状态；

(3)完成步骤(1)后，取植物根组织，采用以上任一所述对植物根组织中的线虫进行计数的方法对植物根组织中的线虫进行计数。

综合步骤(2)和(3)的结果判断植物对线虫的抗性。

所述步骤(1)中，所述接种的方法具体可为：向所述植物茎部注入线虫悬浮液。

所述线虫悬浮液的浓度具体可为250条/mL。

所述线虫悬浮液具体可为将线虫置于水溶液中得到的。

所述线虫具体可为二龄幼虫。

所述接种量具体可为500条/株。

以上任一所述植物具体可为番茄。所述番茄具体可为Lycopersicon esculentumMill cv Castlemart。

以上任一所述线虫为根结线虫。所述根结线虫具体可为南方根结线虫。

本研究将甲苯胺蓝应用于根结石蜡切片的染色，找出最佳染色时间，可以很清晰的观察到线虫和巨细胞的发育状态，而且染色时间比较快，效果比较好。针对线虫个数的统计，将研磨法和过筛法结合起来，找出最佳的研磨时间，方便根中线虫个数的统计。这两种方法结合起来应用，可以从线虫的发育状态和线虫的个数两个方面说明植株对线虫的抗性。

附图说明

图1为不同染色时间的石蜡切片观察结果。

图2为不同搅拌时间的根结线虫观察和个数统计结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特殊说明，具体实施方式内容中的％均代表体积百分比。

南方根结线虫：参考文献：刘雪娇，程春燕，杨树琼，等.南方根结线虫侵染抗感黄瓜材料根系组织特征观察[J].南京农业大学学报，2014，37(5)：69-74.；公众可以从北京农学院获得。

番茄植株(Lycopersicon esculentum Mill cv Castlemart)：参考文献：Li C，Liu G，Xu C.et al.The tomato suppressor of prosystemin-mediated responses2gene encodes a fatty acid desaturase required for the biosynthesis ofjasmonic acid and the production of a systemic wound signal for defense geneexpression.[J].Plant Cell，2003，15(7)：1646.；公众可以从北京农学院获得。

FAA固定液：18体积份的50％乙醇水溶液+1体积份的冰醋酸+1体积份的甲醛。

实施例1、鉴定植物对根结线虫抗性的方法

一、制备接种根结线虫的番茄样本

待测番茄：番茄植株(Lycopersicon esculentum Mill cv Castlemart)。

1、将南方根结线虫二龄幼虫(J2)置于水溶液中，得到悬浮液(浓度为250条/mL)。

2、取待测番茄植株(5周龄，4-5片真叶)，保证番茄生长的土壤湿润，以便于打洞和线虫的存活和移动。用玻璃棒在距离番茄茎3cm处均匀打4个深1cm的洞，将步骤1得到的悬浮液均匀注入洞中，接种量为500条/株，表面以土壤基质掩埋。接种7天后，取植株根结进行试验。

二、甲苯胺蓝染色的石蜡切片观察

1、取材：取步骤一接种根结线虫二龄幼虫7天的番茄根部根结。

2、固定：将步骤1得到的番茄根部根结置于FAA固定液中固定24h。

3、脱水：将步骤2固定好的材料依次加入70％乙醇水溶液、85％乙醇水溶液、95％乙醇水溶液和100％乙醇中进行梯度脱水(每个梯度30min)。

4、透明：完成步骤3后，将材料加至由1体积份无水乙醇和1体积份二甲苯组成的混合液中浸泡30min，然后转移至二甲苯中浸泡30min，使材料呈透明状。

5、浸蜡：将步骤4得到的透明状材料放入一个加盖的容器中，加入少量二甲苯(刚好可以使材料浸没即可)，再加入与二甲苯等体积的熔融石蜡(熔点为54-56℃)，盖上盖子放入57℃鼓风干燥箱干燥12h，然后打开盖子使二甲苯挥发，将鼓风干燥箱温度调至60℃，干燥2h后弃掉液体，倒入熔融的纯石蜡(熔点为56-58℃)，60℃干燥箱干燥12h(期间每4个小时换一次纯石蜡)。

6、包埋：取包埋纸盒，倒入熔融石蜡(熔点为56-58℃)，迅速将步骤5处理的组织块放入包埋纸盒底部，切面朝下，轻提纸盒，平放于冷水表面，待石蜡表面凝固后立即将纸盒按入水中，保证组织块与周围石蜡完全融为一体。

7、切片与展片：修整步骤6得到的蜡块，用切片机切片，摊片机进行展片，蜡带轻放在水面上(水温为40℃-42℃)，亮面朝下，将洁净载玻片一端斜倾入水，将蜡带缓缓捞起。

8、烘片：将步骤7的载破片放至于烘片机上，40℃过夜烘片。

9、脱蜡：将步骤8得到的切片依次进行如下程序脱蜡：二甲苯2次，每次10min→1体积份二甲苯+1体积份乙醇，15min→乙醇2次，每次5min→95％乙醇水溶液，5min→85％乙醇水溶液，5min→70％乙醇水溶液，5min→50％乙醇水溶液，5min→30％乙醇水溶液，5min→去离子水，5min。

10、将步骤9处理的切片进行染色，将切片分组进行如下操作

组I：1％甲苯胺蓝水溶液染色，室温5min→蒸馏水，室温15min→乙醇，室温2min→1体积份二甲苯和1体积份乙醇的混合溶液，室温1min→二甲苯室温1min。

组II：1％甲苯胺蓝水溶液染色，室温10min→蒸馏水，室温15min→乙醇，室温2min→1体积份二甲苯和1体积份乙醇的混合溶液，室温1min→二甲苯室温1min。

组III：1％甲苯胺蓝水溶液染色，室温15min→蒸馏水，室温15min→乙醇，室温2min→1体积份二甲苯和1体积份乙醇的混合溶液，室温1min→二甲苯室温1min。

11、镜检：将步骤10染色后的切片在显微镜下观察根系和根横切面结构。

结果如图1所示。图1A为组I切片的观察结果。图1B为组II切片的观察结果。图1C为组III切片的观察结果。从图中可以看出组II观察效果最好，甲苯胺蓝的最佳染色时间为10min，可以清晰地分辨出线虫和巨细胞。从图1中可以看出线虫的发育状态为J2(二龄幼虫)。

三、冻融法统计线虫个数

1、取步骤一接种根结线虫二龄幼虫7天的番茄根部，自来水冲洗干净后装入封口袋，加入适量自来水放入-20℃冷冻24h，冷冻后线虫死亡。

2、将步骤1冷冻24h的样本在室温下自然解冻，将根部剪成1cm的小段后连同封口袋内的剩余水放入榨汁机(Joyoung/九阳JYL-C50T)中，加入适量水18000rpm搅拌不同时间，破坏根组织释放线虫，然后过套筛(上200目，下600目)，用水喷头在200目筛上反复慢慢冲洗，分别用水将200目筛和600目筛上的线虫收集到50mL离心管中，静置1h后用移液器将上层清水小心吸掉，剩余约5ml液体，在倒置显微镜下观察线虫的发育状态并统计线虫个数。

200目筛收集的多为雌虫，为三龄或四龄幼虫。

600目筛收集的多为二龄幼虫。

根据搅拌时间不同进行如下分组：

组I：搅拌时间为2s。

组II：搅拌时间为5s。

组III：搅拌时间为10s。

600目筛收集的溶液中线虫观察和统计结果如图2所示。图2A为组I的观察结果。图2B为组II的观察结果。图2C为组III的观察结果。图2D为各组观察到的线虫个数统计结果。结果表明，在搅拌时间为5s的时候，线虫易观察且统计的数量较多，效果最好。时间短搅拌不充分，线虫不能完全释放；时间过长根组织过于破碎，碎渣变多，不利于观察。

Claims (2)

1.一种鉴定植物对线虫抗性的方法，包括如下步骤：

（1）将线虫接种植物，进行培养；

（2）完成步骤（1）后，取植物根组织制作石蜡切片并进行染色，然后在显微镜下观察线虫在植物根组织中的发育状态；

所述染色为采用1%甲苯胺蓝水溶液对所述石蜡切片进行染色，所述染色的时间为10min；

（3）完成步骤（1）后，取植物根组织，对植物根组织中的线虫进行计数；

在计数前进行如下前处理的步骤：取含有线虫的植物根组织，进行冻融处理；

所述冻融处理依次包括：冷冻、解冻、破碎；

所述冷冻指的是-20℃冷冻24h；所述解冻指的是室温下自然解冻；所述破碎指的是18000 rpm搅拌5s；

在计数前还包括将冻融处理后的组织过筛；

综合步骤（2）和（3）的结果判断植物对线虫的抗性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述线虫为根结线虫。

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