CN104969782A - 一种桃砧木抗南方根结线虫离体快速筛选方法 - Google Patents

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李海炎
曹珂
朱更瑞
王新卫
方伟超
陈昌文
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Abstract

本发明公开了一种桃砧木抗南方根结线虫离体快速筛选方法，该方法包括以下步骤：育苗；二龄根结线虫的分离；23％Pluronic F-127的制备；接种：采用6孔细胞培养板，每孔中加入5ml 23％Pluronic F-127和500条二龄根结线虫混匀，在胶将要凝固时将桃幼苗根置于孔中，保鲜膜包裹保湿培养。染色：在接种30h后取根尖采用次氯酸钠-酸性品红-甘油法染色，染色后压片。统计鉴定：显微镜下统计线虫数量，根据侵染数量界定植物的抗病性。本发明设计新颖，操作简单，安全方便，解决了试验中植物根结线虫抗性鉴定不稳定，历时长，统计复杂的问题。

Description

一种桃砧木抗南方根结线虫离体快速筛选方法
技术领域
本发明属于植物繁育技术领域，涉及一种桃砧木抗南方根结线虫离体快速筛选方法。
背景技术
根结线虫(Meloidogyne spp.)是一类世界上分布广泛的植物专性内寄生线虫，主要发生在温带和热带地区，种类繁多，寄主范围广，可侵染3000多种植物，每年可造成巨大的经济损失。根结线虫的侵染可造成植物根系统的伤害，使其对养分和水的吸收明显减少，植物长势变弱、产量降低。选育和推广抗病品种是最为经济有效地防御措施。
为了准确鉴定种质资源材料的根结线虫抗性，目前，研究人员建立了许多抗性鉴定方法，主要分为室外或温室盆栽鉴定两种方法。然而无论哪种方法，均需要根结线虫经过一个生长周期后将植物根系从土壤中拔出，清洗干净后统计根结数量或大小，根据抗感标准对植物的抗性进行判断，存在环境条件不稳定，历时较长，统计复杂等缺点。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种操作简单、安全方便的桃砧木抗南方根结线虫离体快速筛选方法。其技术方案如下：
一种桃砧木抗南方根结线虫离体快速筛选方法，包括以下步骤：
(1)育苗：将桃种子低温砂藏备用。
(2)二龄根结线虫的分离：将感染根结线虫的番茄根打碎，分别过20、100、200、500目网筛，收集500目网筛上的虫卵，通过蔗糖浮选法除杂、浓缩虫卵，将浓缩的虫卵倒于铺有一层200目网筛和两层滤纸的培养皿中，3d后收集二龄根结线虫。
(3)23％Pluronic F-127的制备：称23gPluronic F-127加入80ml 4℃预冷的无菌水，适当搅拌，放于4℃冰箱中融化。
(4)接种：采用6孔细胞培养板，每孔中加入5ml 23％Pluronic F-127和500条二龄根结线虫混匀，在胶将要凝固时将桃幼苗根置于孔中，保鲜膜包裹保湿培养。
(5)染色：在接种30h后取根尖(约1.5cm)采用次氯酸钠-酸性品红-甘油法染色，染色后压片。
(6)统计鉴定：显微镜下统计线虫数量，根据侵染数量界定植物的抗病性。
优选地，所述桃种子低温砂藏3-4个月后发芽，接种时取出。
优选地，在所述步骤(2)中收集的虫卵可经3000r/min离心3min弃部分上清增加虫卵浓度，显微镜下计算线虫浓度，达到每100μl 100条，分离后当天接种。
优选地，在所述步骤(3)中Pluronic F-127是一种共聚物，其23％水溶液在15℃以下为液态，以上为固态，根结线虫可在其中自由移动，且无毒性。
优选地，在所述步骤(5)中取根尖后，将植株根系插入23％Pluronic F-127中，仍能存活长出侧根，可以用于移栽。
优选地，在所述步骤(5)中次氯酸钠-酸性品红-甘油法染色过程如下：
1)洗净根，取长约1.5cm的根尖放于盛有50ml自来水的烧杯中，加入次氯酸钠至1.5％，处理4-6min，适当搅拌。 
2)根尖用自来水冲洗30-45s，后浸泡在自来水中15min，去除残留的次氯酸钠。
3)根尖用滤纸吸干表面水分，然后放于盛有30ml水和1ml染色剂(3.5g酸性品红，250ml乙酸，750ml蒸馏水)的烧杯中，煮沸30s。
4)冷却至室温，多余的染色剂用流水冲掉，后将根尖放于20-30ml的酸化甘油中(甘油中滴加2-3滴5mol/lHcl)，煮沸后冷却。
5)根尖可压在载玻片上观察。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明设计新颖，操作简单，安全方便，提供了一种能对植物的根结线虫抗性进行离体快速筛选的方法，解决了试验中植物根结线虫抗性鉴定不稳定，历时长，统计复杂的问题。该方法用于植物的根结线虫抗性鉴定，能在接种两天内根据根结线虫侵染数量就能对植物的根结线虫抗性作出准确的判断。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例
一种桃砧木抗南方根结线虫离体快速筛选方法，包括以下步骤：
(1)育苗：将贝蕾(高感)和白根甘肃桃(高抗)种子低温砂藏备用，砂藏3-4个月后种子发芽，用于接种时取出。
(2)二龄根结线虫的分离：将感染根结线虫的番茄根打碎，分别过20、100、200、500目网筛，收集500目网筛上的虫卵，通过蔗糖浮选法除杂、浓缩虫卵，将浓缩的虫卵倒于铺 有一层200目网筛和两层滤纸的培养皿中的，3d后收集二龄根结线虫，3000r/min离心3min弃部分上清增加虫卵浓度，显微镜下计算线虫浓度，达到每100μl 100条，分离后当天接种。
(3)23％Pluronic F-127的制备：Pluronic F-127是一种共聚物，其23％水溶液在15℃以下为液态，以上为固态，根结线虫可在其中自由移动，且无毒性。称23gPluronic F-127加入80ml 4℃预冷的无菌水，适当搅拌，放于4℃冰箱中融化。
(4)接种：采用6孔细胞培养板，每孔中加入5ml 23％Pluronic F-127和500条二龄根结线虫混匀，在胶将要凝固时将桃幼苗根置于孔中，保鲜膜包裹保湿培养。
(5)染色：在接种6、12、18、24、30、36、42、48h后取根尖(约1.5cm)，每个时期4个重复，放于盛有50ml自来水的烧杯中，加入次氯酸钠至1.5％，处理4-6min，适当搅拌；根尖用自来水冲洗30-45s，后浸泡在自来水中15min，去除残留的次氯酸钠；根尖用滤纸吸干表面水分，然后放于盛有30ml水和1ml染色剂(3.5g酸性品红，250ml乙酸，750ml蒸馏水)的烧杯中，煮沸30s；冷却至室温，多余的染色剂用流水冲掉，后将根尖放于20-30ml的酸化甘油中(甘油中滴加2-3滴5mol/lHcl)，煮沸后冷却；根尖可压在载玻片上观察。取根尖后，将植株根系插入23％Pluronic F-127中，仍能存活长出侧根，可以用于移栽。
(6)统计鉴定：显微镜下随机统计三个视野内线虫数量，根据侵染数量界定植物的抗病性。统计结果见表1，可以看出在接种30h左右侵染数量达到最高，根据此时期的侵染数量确定植物的抗、感性是最为准确的时期。抗、感材料间侵染数量差异显著，表明此方法可以用于植物的根结线虫抗性鉴定。
表1抗、感材料不同时期线虫侵染数量比较
以上所述，仅为本发明最佳实施方式，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围 。

Claims (6)

1.一种桃砧木抗南方根结线虫离体快速筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)育苗：将桃种子低温砂藏备用；
(2)二龄根结线虫的分离：将感染根结线虫的番茄根打碎，分别过20、100、200、500目网筛，收集500目网筛上的虫卵，通过蔗糖浮选法除杂、浓缩虫卵，将浓缩的虫卵倒于铺有一层200目网筛和两层滤纸的培养皿中，3d后收集二龄根结线虫；
(3)23％Pluronic F-127的制备：称23gPluronic F-127加入80ml 4℃预冷的无菌水，适当搅拌，放于4℃冰箱中融化；
(4)接种：采用6孔细胞培养板，每孔中加入5ml 23％Pluronic F-127和500条二龄根结线虫混匀，在胶将要凝固时将桃幼苗根置于孔中，保鲜膜包裹保湿培养；
(5)染色：在接种30h后取根尖采用次氯酸钠-酸性品红-甘油法染色，染色后压片；
(6)统计鉴定：显微镜下统计线虫数量，根据侵染数量界定植物的抗病性。
2.根据权利要求1所述的桃砧木抗南方根结线虫离体快速筛选方法，其特征在于，所述桃种子低温砂藏3-4个月后发芽，接种时取出。
3.根据权利要求1所述的桃砧木抗南方根结线虫离体快速筛选方法，其特征在于，在所述步骤(2)中收集的虫卵经3000r/min离心3min弃部分上清增加虫卵浓度，显微镜下计算线虫浓度，达到每100μl 100条，分离后当天接种。
4.根据权利要求1所述的桃砧木抗南方根结线虫离体快速筛选方法，其特征在于，在所述步骤(3)中Pluronic F-127是一种共聚物，其23％水溶液在15℃以下为液态，以上为固态，根结线虫在其中自由移动，且无毒性。
5.根据权利要求1所述的桃砧木抗南方根结线虫离体快速筛选方法，其特征在于，在所述步骤(5)中取根尖后，将植株根系插入23％Pluronic F-127中，仍能存活长出侧根，用于移栽。
6.根据权利要求1所述的桃砧木抗南方根结线虫离体快速筛选方法，其特征在于，在所述步骤(5)中次氯酸钠-酸性品红-甘油法染色过程如下：
1)洗净根，取长为1.5cm的根尖放于盛有50ml自来水的烧杯中，加入次氯酸钠至1.5％，处理4-6min，适当搅拌；
2)根尖用自来水冲洗30-45s，后浸泡在自来水中15min，去除残留的次氯酸钠；
3)根尖用滤纸吸干表面水分，然后放于盛有30ml水和1ml染色剂的烧杯中，煮沸30s；
4)冷却至室温，多余的染色剂用流水冲掉，后将根尖放于20-30ml的酸化甘油中，煮沸后冷却；
5)根尖压在载玻片上观察。
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