CN106996890A - 一种孢囊线虫卵的收集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种孢囊线虫卵的收集方法,首先研磨孢囊,使其破碎,将卵从其中释放出来,然后通过冲洗和离心,将卵粒从孢囊碎片和各种杂质中分离出来,获得大量的、完整的、有活性的线虫卵。本发明简单,易操作,由于采用电力供能、机械钻头转动研磨破碎线虫孢囊,操作省力、简便;可用于大量收集研究用孢囊线虫的卵,工作效率高收集到的孢囊线虫卵,杂质含量低,纯度高,卵的破损率低,质量高。
Description
技术领域
本发明涉及一种孢囊线虫卵的收集方法,属植物病原线虫研究领域。
背景技术
孢囊线虫是一类重要的植物病原线虫,引起包括小麦、水稻、大豆、甜菜和马铃薯等许多重要作物的产量损失。重要的孢囊线虫隶属于孢囊线虫属(Heterodera)和球形孢囊线虫属(Globodera),其中,以孢囊线虫属种类最多,我国严重发生的主要有小麦孢囊线虫病和大豆孢囊线虫病。
小麦孢囊线虫病分布范围广,已遍布全世界40多个国家。小麦孢囊线虫病主要危害植物根部,使小麦植株生长受到影响,引起产量的下降。我国从1989发现该病以来,目前已遍布16个省(市、区),发病面积为1700多万亩,造成的产量损失达30%以上,并且危害程度逐年增加。一旦该病害爆发,将会严重影响我国小麦的生产,甚至威胁到我国的粮食和经济安全。大豆孢囊线虫病是大豆上最重要的病害之一,具有分布广、寄主范围宽、传播途径多、危害严重等特点。大豆主要生产国如美国、巴西、中国和日本都有大面积发生。我国仅东北和黄淮海大豆产区每年发生面积就有2000万亩以上,受害大豆一般减产30%~50%, 严重的减产70%~90%,甚至绝产。
孢囊线虫的卵成熟后,只有少数被雌虫排出体外,绝大部分卵保留在雌虫体内。当雌虫老熟后,表皮变硬、鞣质化,颜色变褐,可保护其中的卵长期存活。孢囊内的卵具有很强的抗逆性,能在土壤中存活多年。孢囊线虫的卵是重要的试验材料,不论是在孢囊线虫的发生情况调查、基数检测,还是在孢囊线虫致病性测定、生理小种鉴定、品种抗病评价,以及生物测试等科学研究和实践中,都需要收集大量的卵作为试验材料。因此,研发一种简单、易操作,同时可获得大量、高质量的线虫卵的收集技术是开展上述科学研究和实践的基础。
目前,尚缺乏简单、高效地收集孢囊线虫卵的技术,在该类线虫的研究中,多采用橡胶塞研磨或玻璃匀质器手工研磨破碎孢囊,然后通过冲洗杂质获得卵粒。这些方法不易操作,用力轻时,孢囊不能充分破碎,用力过大,则易破损卵粒;且工作效率较低,获得的卵粒混杂较多孢囊壳碎片,质量不高。
发明内容
本发明提供一种孢囊线虫卵的收集方法。由于孢囊线虫卵保存于表皮坚硬、抗逆性很强的褐色孢囊中,本发明首先需要研磨孢囊,使其破碎,将卵从其中释放出来,然后通过冲洗和离心,将卵粒从孢囊碎片和各种杂质中分离出来,获得大量的、完整的、有活性的线虫卵。
本发明提供的技术方案是:一种孢囊线虫卵的收集方法,其包括如下步骤:
第一步,将孢囊线虫的孢囊冲入55-65目的第一筛中,将第一筛放在180-220目第二筛和450-550目第三筛构成的套筛之上,其中450-550目筛在最下面;
第二步,用研磨器低档研磨,并不时用小水冲刷;
第三步,待第一筛上的孢囊被破碎后,经流水冲至其下的180-220目和450-550目的套筛上;
第四步,轻轻冲洗180-220目筛,将卵、孢囊碎片和杂质冲洗到450-550目筛上;
第五步,再将所述卵、孢囊碎片和杂质冲洗到离心管中,离心使卵沉降。
所述的孢囊线虫卵的收集方法,优选地,所述第一筛为60目;所述第二筛为200目;所述第三筛为500目;第五步中的离心是以2100r/min的转速进行。
所述的孢囊线虫卵的收集方法,进一步包括如下步骤:
第六步,在第五步离心后,用吸掉部分水后用抽吸卵悬浮液,将其轻轻覆盖于35-45%的蔗糖溶液上,再次离心,在蔗糖和水面交界处可见一层白色卵液。
所述的孢囊线虫卵的收集方法,进一步包括如下步骤:
第七步,将卵液移至第一步中所述的筛套上,用水冲洗以清除蔗糖溶液;最后,将卵冲入干净的容器中,即得到卵的悬浮液。
本发明具有以下有益效果:
1、本发明简单,易操作。由于采用电力供能、机械钻头转动研磨破碎线虫孢囊,操作省力、简便。
2、本发明可用于大量收集研究用孢囊线虫的卵,工作效率高。
3、本发明收集到的孢囊线虫卵,杂质含量低,纯度高,卵的破损率低,质量高。
具体实施方式
本发明孢囊线虫卵的收集方法方法的具体操作步骤如下:
一、孢囊的分离和收集:将含有孢囊的土壤样本混合均匀,风干后,倒入塑料桶中,然后将水加入塑料桶中搅拌均匀,静置1-2min后将悬浮液依次倒入26目和60目的筛网过滤,重复2-3次。然后用强水流冲洗26目筛网上的残余物,将孢囊全部冲入60目的筛网中。再用小水流从正面轻轻淋洗60目筛,冲洗干净后,将网上的残余物用洗瓶冲入小盘上的60-80目尼伦纱布上,在体视解剖镜下收集孢囊。
二、60目小筛的制作:截取高分别为5cm、1cm,内径为4cm的PVC管,用木工砂纸将截面打磨平整。裁剪60目的钢丝网,将60目的钢丝网通过PVC胶水粘于5cm×4cmPVC管和1cm×4cmPVC管之间,得到60目小筛。
三、孢囊研磨器的制作:将小型台式钻(BG-5168E微型台钻)的钻头尖端插入3号橡胶塞(26mm×23mm×18mm),将其安装至台式钻床(可从商业途径得到)上备用。
四、用孢囊研磨器收集卵:将孢囊冲入自制的60目小筛中,将60目小筛放在200目和500目套筛(500目在最下面)之上。用制作的孢囊研磨器低档研磨,研磨时不要太用力,并不时用小水冲刷。60目上的孢囊被破碎后,经流水冲至其下的200目和500目套筛上。然后,轻轻冲洗200目筛,将卵、孢囊碎片和杂质冲洗到500目筛上。
五、离心漂浮法纯化卵:用洗瓶将卵从500目筛上冲洗到50ml圆底离心管中,以2100r/min的转速离心5min,使卵沉降。用注射器轻轻吸掉3/4水(离心管中约剩下15-20ml)。向50ml锥形底离心管中加入约25ml的40%蔗糖溶液,然后用注射器抽吸卵悬浮液,将其轻轻覆盖于蔗糖溶液上。以2100r/min的转速离心5min。此时,蔗糖和水面交界处可见一层白色卵液。用注射器将卵液移至200目和500目筛上,用水冲洗15s,以清除蔗糖溶液。最后,将卵冲入干净的锥形底离心管,即得到卵的悬浮液。
Claims (7)
1.一种孢囊线虫卵的收集方法,其特征在于包括如下步骤:
第一步,将孢囊线虫的孢囊冲入55-65目的第一筛中,将第一筛放在180-220目第二筛和450-550目第三筛构成的套筛之上,其中450-550目筛在最下面;
第二步,用研磨器低档研磨,并不时用小水冲刷;
第三步,待第一筛上的孢囊被破碎后,经流水冲至其下的180-220目和450-550目的套筛上;
第四步,轻轻冲洗180-220目筛,将卵、孢囊碎片和杂质冲洗到450-550目筛上;
第五步,再将所述卵、孢囊碎片和杂质冲洗到离心管中,离心使卵沉降。
2.如权利要求1所述的孢囊线虫卵的收集方法,其特征在于:所述第一筛为60目。
3.如权利要求1所述的孢囊线虫卵的收集方法,其特征在于:所述第二筛为200目。
4.如权利要求1所述的孢囊线虫卵的收集方法,其特征在于:所述第三筛为500目。
5.如权利要求1所述的孢囊线虫卵的收集方法,其特征在于:第五步中的离心是以2100r/min的转速进行。
6.如权利要求1所述的孢囊线虫卵的收集方法,其特征在于进一步包括如下步骤:
第六步,在第五步离心后,用吸掉部分水后用抽吸卵悬浮液,将其轻轻覆盖于35-45%的蔗糖溶液上,再次离心,在蔗糖和水面交界处可见一层白色卵液。
7.如权利要求6所述的孢囊线虫卵的收集方法,其特征在于进一步包括如下步骤:
第七步,将卵液移至第一步中所述的筛套上,用水冲洗以清除蔗糖溶液;最后,将卵冲入干净的容器中,即得到卵的悬浮液。
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