CN111141574B - 一种油菜叶片dab染色的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种油菜叶片DAB染色的方法，所述方法包括以下步骤：将油菜叶片进行高光胁迫处理；将处理后的油菜叶片浸没于DAB染色液中，在无光照环境中真空处理，然后将油菜叶片移至无光照环境中静置染色；将染色后的叶片取出置于玻璃器皿中，加入配制的脱色液浸没叶片，水浴加热至叶片绿色完全脱去；将脱色后的叶片放入无水乙醇中固定，染色完成。本发明将油菜叶片放入高浓度DAB染液后放入真空干燥器中抽真空，使油菜叶片获得更好的染色效果。避免了大叶片染色过程中由于表面张力等因素而难以染色的情况。
Description
技术领域
本发明涉及DAB染色技术领域，具体涉及一种油菜叶片DAB染色的方法。
背景技术
在自然状态下,植物的整个生长周期均处于固着状态,不像动物能够主动自发地躲避不良环境,因此必然会受到来自外界生物与非生物胁迫的影响。正是由于植物处于这样一个极易受到环境胁迫的状态,其自身进化出一系列自我保护和适应与抵制不良环境的机制(Boyko and Kovalchuk,2008)。对植物生长发育的胁迫包括内部或外部因素。内部胁迫主要为植物自身基因的突变或异常细胞对机体代谢产生的不利影响；外部胁迫则可分为生物与非生物胁迫。生物胁迫包括病原感染、食草动物和种内竞争等；非生物胁迫由不利的环境条件引起(如不适宜的温度、水分和营养物质的利用以及光照条件等),这两种外部胁迫可以是永久性的也可以是临时状态(Madlung and Comai,2004)。
植物在自然环境中经常会受到干旱、高光、低温、重金属污染等各种非生物胁迫，这些非生物胁迫都会对植物的生长、发育、结实造成严重的不良影响。植物无法自由移动，因此，在长期的进化过程中，植物从分子、细胞、生理生化水平等各个层面形成相应的机制来应对这些恶劣胁迫，使其能够在各种环境下生存自然界中的光合生物(包括光合细菌、藻类、绿色植物)可以利用光能进行光合作用,将无机物(CO2和H2O)转化为有机物,并且释放出O2。光合作用是生物赖以生存的基础,也是地球碳氧循环的重要媒介(Vinyard等2013)；尽管光对于植物光合作用是必需的,但是过量的光也会对光系统(如PSII)造成损伤。尤其是在高光条件下,对其造成损伤引起光抑制的发生,并由此降低植物的光合活性、影响植株的长势和产量。
过氧化氢(H2O2)是重要的活性氧之一，高光等胁迫刺激可以诱导细胞内H2O2的产生和积累，继而调控植物的气孔运动、生长发育、衰老和逆境应答等诸多生理过程。因此，对H2O2的测定，是植物生理学最常用的测定指标。DAB，即3,3-二氨基联苯胺，DAB染色方法是目前比较常见的H2O2测定方法，其测定原理：H2O2在过氧化酶的催化下可与DAB迅速反应生成棕色化合物，从而定位组织中的H2O2。该技术是对H2O2进行原位定位染色的方法，通过观察产生的斑点便可检测H2O2的聚集情况。该方法操作简单，成本较低，H2O2的产生具有专一性，同时能够肉眼直观地看到由于H2O2的积累产生的斑点大小与深度，常被用来检测植物受到环境胁迫时H2O2的累积情况。但是对大叶片来说，由于叶片的表面张力等原因染色液不容易进入植物叶片，DAB染色液染色效果不好，常常会出现染色不完整等情况。现有的染色方法只能染叶片的某一部分，完整叶片染色通常需要对叶片的叶脉进行处理，对叶片造成机械损伤，导致染色后脱色效果不明显且不能将叶片上的杂色脱尽，无法直观、准确地反映由胁迫导致的H2O2累积情况。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种油菜叶片DAB染色的方法，能够降低大叶片的表面张力，使染色液更容易进入植物叶片，染色效果好。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种油菜叶片DAB染色的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将油菜叶片进行高光胁迫处理；
(2)将步骤(1)处理后的油菜叶片浸没至DAB染色液中，在无光照环境中真空处理，然后将油菜叶片移至无光照环境中静置染色；
(3)将步骤(2)染色后的油菜叶片取出置于玻璃器皿中，加入脱色液浸没叶片，水浴加热至叶片绿色完全脱去；
(4)将脱色后的油菜叶片放入无水乙醇中固定，染色完成。
优选的，步骤(1)中，所述DAB染色液由以下方法配制：将DAB粉末加入蒸馏水稀释至1mg/ml，再用NaOH调pH至5.8。
优选的，步骤(1)中，所述高光胁迫处理为：将油菜叶片置于1200umol·m-2·s-1光强下12～24h。
优选的，步骤(2)中，油菜叶片浸没至染色液中的方法为：取处理后的油菜叶片置于康宁管中并在叶片上方塞入泡沫块防止叶片上浮，然后倒入新配好的DAB染色液至叶片完全浸没。
优选的，步骤(2)中，所述真空处理具体为：将浸没有DAB染色液的油菜叶片置于真空装置中，抽真空至真空表读数为0.8Kg/cm2，并维持该真空条件至DAB染色液中的油菜叶片下沉。
优选的，步骤(2)中，所述静置染色的时间为8～12h，温度为室温。
优选的，步骤(3)中，所述脱色液由以下方法配制：将无水乙醇稀释得到体积浓度为80％乙醇溶液。
优选的，步骤(3)中，所述水浴加热的温度为100℃～110℃。
本发明的有益效果：
本发明将油菜叶片放入高浓度DAB染液后放入真空干燥器中抽真空，使油菜叶片获得更好的染色效果，染色后脱色效果非常明显且能将叶片上的杂色脱尽，直观、准确地反映由胁迫导致的H2O2累积情况。避免了大叶片染色过程中由于表面张力等因素而难以染色的情况。
附图说明
图1：油菜叶片放入50ml康宁管示意图；
图2：油菜叶片抽真空示意图；
图3：油菜叶片高光胁迫处理后DAB染色结果图；
图4：未经真空处理的油菜叶片高光胁迫处理后DAB染色结果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术所述，对大叶片来说，由于叶片的表面张力等原因染色液不容易进入植物叶片，DAB染色液染色效果不好，为了提高染色效果，需要在叶脉两端扎对称的孔，使得染色液由叶脉进入叶片，但会对叶片造成损伤，扎孔处在染色脱色后会形成一个深色的点，影响后续的观察效果，并且染色液通过叶脉进入叶片染色效果沿叶脉逐渐减弱。而油菜叶片的抗逆性较强，由于表面张力等因素，很难染色。基于此，本发明提供一种油菜叶片DAB染色的方法。此方法在不破坏叶片的情况下，使DAB染色液均匀进入叶片中，脱色后效果显著。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1
1.配制染色液：先称取DAB干粉(Biotopped)，加入蒸馏水稀释至1mg/ml，使DAB干粉完全溶解于蒸馏水中，使用前再用NaOH调PH至5.8。染色液现用现配。
2.样品处理：取幼苗期油菜在1200umol·m-2·s-1光强下进行12h高光胁迫处理。
3.样品DAB染色：取处理后的完整油菜叶片小心放入50ml康宁管中，注意不要对叶片造成机械性损伤。放入康宁管中后在叶片上方塞入适宜大小的泡沫块用来防止叶片的上浮(泡沫块能够卡在康宁管中但又不完全覆盖康宁管)，随后倒入新配好的染色液至叶片完全浸泡在染液中。之后将康宁管放入真空干燥器中黑暗环境中抽真空2h至叶片中空气抽出叶片下沉，然后移至室温黑暗环境中染色8h。
4.脱色液的配制：将无水乙醇稀释至体积浓度为80％，配制体积浓度为80％的乙醇备用。
5.对样品进行脱色处理：将染色结束后的样品放入装有80％乙醇的玻璃容器中，水浴煮沸处理10min以上至叶片绿色完全脱去为止。
6.叶片脱色完成后将叶片放入无水乙醇中固定，进行观察。
实施例2
1.配制染色液：先称取DAB干粉(Biotopped)，加入蒸馏水稀释至1mg/ml，使DAB干粉完全溶解于蒸馏水中，使用前再用NaOH调PH至5.8。染色液现用现配。
2.样品处理：取幼苗期油菜在1200umol·m-2·s-1光强下进行24h高光胁迫处理。
3.样品DAB染色：取处理后的完整油菜叶片小心放入50ml康宁管中，注意不要对叶片造成机械性损伤。放入管中后在叶片上方塞入适宜大小的泡沫块用来防止叶片的上浮(泡沫块能够卡在康宁管中但又不完全覆盖康宁管)，随后倒入新配好的染色液至叶片完全浸泡在染液中。之后将康宁管放入真空干燥器中黑暗环境中抽真空至叶片中空气抽出叶片下沉，然后移至室温黑暗环境中染色12h。
4.脱色液的配制：将无水乙醇稀释至体积浓度为80％，配制体积浓度为80％的乙醇备用。
5.对样品进行脱色处理：将染色结束后的样品放入装有80％乙醇的玻璃容器中，水浴煮沸处理10min以上至叶片绿色完全脱去为止。
6.叶片脱色完成后将叶片放入无水乙醇中固定，进行观察。
对比例1
1.配制染色液：先称取DAB干粉(Biotopped)，加入蒸馏水稀释至1mg/ml，使DAB干粉完全溶解于蒸馏水中，使用前再用NaOH调PH至5.8。染色液现用现配。
2.样品处理：取幼苗期油菜叶片在1200umol·m-2·s-1光强下分别进行0h，6h，12h，24h高光胁迫处理。
3.样品DAB染色：取处理后的完整油菜叶片小心放入50ml康宁管中，注意不要对叶片造成机械性损伤。放入管中后在叶片上方塞入适宜大小的泡沫块用来防止叶片的上浮(泡沫块能够卡在康宁管中但又不完全覆盖康宁管)，随后倒入新配好的染色液至叶片完全浸泡在染液中，然后移至室温黑暗环境中染色8h。
4.脱色液的配制：将无水乙醇稀释至体积浓度为80％，配制体积浓度为80％的乙醇备用。
5.对样品进行脱色处理：将染色结束后的样品放入装有80％乙醇的玻璃容器中，水浴煮沸处理10min以上至叶片绿色完全脱去为止。
6.叶片脱色完成后将叶片放入无水乙醇中固定，进行观察。
对比例2
1.配制染色液：先称取DAB干粉(Biotopped)，加入蒸馏水稀释至1mg/ml，使DAB干粉完全溶解于蒸馏水中，使用前再用NaOH调PH至5.8。染色液现用现配。
2.样品处理：取幼苗期油菜叶片在1200umol·m-2·s-1光强下分别进行0h，6h，12h，24h高光胁迫处理。
3.样品DAB染色：取处理后的完整油菜叶片小心放入50ml康宁管中，注意不要对叶片造成机械性损伤。放入管中后在叶片上方塞入适宜大小的泡沫块用来防止叶片的上浮(泡沫块能够卡在康宁管中但又不完全覆盖康宁管)，随后倒入新配好的染色液至叶片完全浸泡在染液中，然后移至室温黑暗环境中染色12h。
4.脱色液的配制：将无水乙醇稀释至体积浓度为80％，配制体积浓度为80％的乙醇备用。
5.对样品进行脱色处理：将染色结束后的样品放入装有80％乙醇的玻璃容器中，水浴煮沸处理10min以上至叶片绿色完全脱去为止。
6.叶片脱色完成后将叶片放入无水乙醇中固定，进行观察。
以油菜叶片高光胁迫处理0h为本发明的对照处理，油菜叶片染色按本发明的方法进行处理，作为实施例1和2染色脱色后油菜叶片的对照，油菜叶片染色后的照片见图3。由于油菜叶片抗逆性较强，实施例1高光胁迫处理12h后，H2O2累积情况较对照处理略好。实施例2高光胁迫处理24h后，能够较明显的观察到H2O2累积情况。而对比例1和对比例2的油菜叶片均未经真空处理，很难染色，见图4。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种油菜叶片DAB染色的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）将油菜叶片进行高光胁迫处理；所述高光胁迫处理为：将油菜叶片置于1200umol·m-2·s-1光强下12~24h；
（2）将步骤（1）处理后的油菜叶片浸没至DAB染色液中，在无光照环境中真空处理，然后将油菜叶片移至无光照环境中静置染色；油菜叶片浸没至染色液中的方法为：取处理后的油菜叶片置于康宁管中并在叶片上方塞入泡沫块防止叶片上浮，然后倒入新配好的DAB染色液至叶片完全浸没；所述DAB染色液由以下方法配制而成：将DAB粉末加入蒸馏水稀释至1mg/mL，再用NaOH调pH至5.8；所述真空处理具体为：将浸没有DAB染色液的油菜叶片置于真空装置中，抽真空至真空表读数为0.8Kg/cm2，并维持该真空条件至DAB染色液中的油菜叶片下沉；所述静置染色的时间为8~12h，温度为室温；
（3）将步骤（2）染色后的油菜叶片取出置于玻璃器皿中，加入脱色液浸没叶片，水浴加热至叶片绿色完全脱去；所述脱色液由以下方法配制：将无水乙醇稀释得到体积浓度为80%乙醇溶液；所述水浴加热的温度为100℃；
（4）将脱色后的油菜叶片放入无水乙醇中固定，染色完成。
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