CN103076297A - 铜绿微囊藻替代叶绿素标准物质快速实时测定水体叶绿素的方法 - Google Patents
铜绿微囊藻替代叶绿素标准物质快速实时测定水体叶绿素的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用铜绿微囊藻替代叶绿素标准物质快速实时测定水体叶绿素的方法，该方法包括如下步骤：A.铜绿微囊藻叶绿素ａ标准溶液的制备；B.储备液中叶绿素ａ浓度的测定，用国标法标定储备液中叶绿素ａ的浓度；C.储备液荧光测定，分别测定各溶液的荧光强度；D.铜绿微囊藻标准荧光曲线的建立，将储备液的浓度对其荧光强度作图绘制铜绿微囊藻叶绿素ａ荧光法曲线；E.铜绿微囊藻校正荧光曲线的建立。根据所建立的铜绿微囊藻藻液荧光强度和叶绿素ａ浓度之间的校正曲线，只需采用荧光仪直接测出水样的荧光强度，便可实时、快速得到叶绿素ａ的浓度。
Description
技术领域
本发明涉及水体叶绿素a检测技术领域，尤其是一种廉价的、且能够在线实时对水体中叶绿素a的含量进行测定的方法。
背景技术
对于水体中叶绿素a含量的测定，相较于紫外分光光度法、高效液相色谱法等传统方法的步骤繁杂、费时且不便于在线监测等缺点，直接荧光法操作更简便、灵敏度更高，且结果与传统方法相比无显著性差异。荧光法测定叶绿素基本原理是当叶绿素a经波长为450nm左右的光激发后，会发出波长为680nm左右的荧光，荧光光强与叶绿素a含量有关因此，通过测定特定光强下浮游植物发出的叶绿素荧光强度就能检测到叶绿素a的浓度。
目前荧光法中用到的叶绿素a标准品多购自与国外，价格昂贵且剂量较小难以满足大量水体叶绿素含量分析实验的进行。针对这一现状，采用淡水湖泊中最常见且实验室极易培养的铜绿微囊藻作为研究对象，利用荧光法对比测定藻液叶绿素a提取液与叶绿素a标准品的荧光值，做出铜绿微囊藻藻液的直接荧光法校准曲线。从而直接利用此校正曲线测定水体中叶绿素a含量。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种铜绿微囊藻替代叶绿素标准物质快速实时测定水体叶绿素的方法，不仅十分廉价，而且能够在线实时对水体中叶绿素a的含量进行测定。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
铜绿微囊藻替代叶绿素标准物质快速实时测定水体叶绿素的方法，该方法包括如下步骤：
A、铜绿微囊藻叶绿素ａ标准溶液的制备
取铜绿微囊藻液，抽滤，抽滤完毕后取下滤膜，将滤膜夹在滤纸中冷冻，反复冻融，使细胞完全裂解以利于叶绿素a的提取；将滤膜放入比色管中，加入95%乙醇定容，放入4℃冰箱中静置，然后以4000r/min离心15min,将上清液分别转移至容量瓶中用95%乙醇定容；作为储备液备用；
B、储备液中叶绿素ａ浓度的测定
用国标法标定储备液中叶绿素ａ的浓度，以相应的95%乙醇作为空白，用紫外分光光度计测定储备液扫描波长在750nm、664nm、645nm和630nm处的吸光值，将测得的结果数据带入国标法计算公式：
其中chla为叶绿素a的浓度，单位ug/l；E750、E664、E645、E630分别为储备液于波长750nm、664nm、645nm、630nm处的吸光值；V乙醇为乙醇萃取液的体积，单位ml；V水样为藻液体积，单位l；＆为比色皿光程，单位cm；通过计算即获得储备液中叶绿素a的浓度chla；
C、储备液荧光测定
步骤B已经计算出储备液中叶绿素a的浓度chla，取适量上述储备液依次稀释成浓度为30、90、150、300、450、600、800、1000、1200、1500、1800ug/l的系列溶液，在激发波长440nm、发射波长684nm、激发与发射狭缝均为5nm条件下,以95%乙醇为空白参比，分别测定各溶液的荧光强度；
D、铜绿微囊藻标准荧光曲线的建立
将储备液的浓度对其荧光强度作图绘制铜绿微囊藻叶绿素ａ荧光法曲线，得到附图1，即得到铜绿微囊藻叶绿素a提取液中叶绿素ａ浓度与荧光强度的相关关系；同时计算其回归方程为y=0.1173x+7.1177，Ｒ2＝0.9947，其中，y为其荧光强度，x为叶绿素ａ浓度，单位ug/l；
E、铜绿微囊藻校正荧光曲线的建立
取铜绿微囊藻水样逐级稀释，配成体积各为20ml的一系列浓度梯度的溶液，然后，
E-1、每一份藻液溶液各取出10ml，分别测定其荧光强度，利用步骤D获得的铜绿微囊藻标准荧光曲线即可换算为藻液溶液中叶绿素ａ的浓度；
E-2、每份藻液溶液剩余的10ml不经任何处理，同条件下测定荧光强度；
E-3、将步骤E-1中所得的叶绿素ａ浓度对步骤E-2中所得的荧光强度作图，即得附图3，为铜绿微囊藻藻液叶绿素ａ浓度与铜绿微囊藻液荧光强度校正曲线；同时计算其回归方程为y=0.0129x+0.4393R2=0.9936，其中y为其荧光强度值，x为叶绿素ａ浓度，单位ug/l；
根据所建立的铜绿微囊藻藻液荧光强度和叶绿素ａ浓度之间的校正曲线，只需采用荧光仪直接测出水样的荧光强度，便可实时、快速得到叶绿素ａ的浓度。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤A的具体操作步骤如下：取200ml铜绿微囊藻液，用装好乙酸纤维滤膜的抽滤装置分四次对藻液进行抽滤，抽滤完毕后取下滤膜，将滤膜夹在滤纸中放入-20℃冰箱中冷冻，每隔30min取出在室温中解冻15min，反复冻融3次，使细胞完全裂解以利于叶绿素a的提取；将滤膜放入50ml比色管中，加入95%乙醇定容，盖上塞子振摇1-2min，放入4℃冰箱中静置，每隔30min取出振摇一次，反复操作3次，然后以4000r/min离心15min,将上清液分别转移至50ml容量瓶中用95%乙醇定容；作为储备液备用。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤E-1和E-2中，采用步骤C的荧光测定条件进行荧光测定。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明的方法不仅十分廉价，而且能够在线实时对水体中叶绿素a的含量进行测定。本方法的稳定性及测定准确率参看如下试验数据：
试验1：铜绿微囊藻叶绿素a提取液与叶绿素a标准样品荧光值测定结果，见下表：
由上表可知，通过与叶绿素a标准样品比对，铜铝微囊藻叶绿素a提取液测定结果与标准值基本一致，相对误差均小于6.6%，由此可知，生长良好的铜绿微囊藻藻液可替代叶绿素a标准样品作为测定水样中叶绿素含量的标准（本试验的具体操作过程参见具体实施方式部分，步骤1.5）。
试验2、实际水样测定结果
分别用荧光法和国标法对校园人工湖水样进行比对实验，每种水样重复测定3次，计算相对误差，荧光法和国标方法的测定结果见下表：
由上表可知，通过实际水样比对试验得采用荧光法测定水样荧光值，然后通过铜绿微囊藻直接荧光法校准曲线计算出各水样叶绿素a浓度，将计算结果与国标法进行对比，相对误差均在12.5%以内，结果较为理想，即以铜绿微囊藻作为测定水体叶绿素浓度的标准品所得数据较为理想。
试验3、铜绿微囊藻作为叶绿素标准物质的特性实验
3.1时间稳定性实验
取生长良好铜绿微囊藻藻液均分为11份，每份20ml，遮光置于室温20℃条件下。取第一份样品测定其荧光值，然后每隔30min测定一份样品的荧光值，连续测定5小时，计算与未放置的藻液荧光值之间的相对误差。结果如下表：
由上表结果可得，铜绿微囊藻藻液遮光室温放置时间在5小时之内，藻液的荧光值相对误差在5.5%以内，藻液稳定性良好，能保证在试验时间内标准物质自身不发生变化。
3.2不同酸碱条件下稳定性实验
取生长良好的铜绿微囊藻藻液均分为7份，每份20ml，遮光置于室温20℃条件下。取第一份样品测定其荧光值，荧光值为0.451。用盐酸或氢氧化钠调节剩下6份藻液pH至4、5、6、7、8、9、10分别测定不同pH下的藻液荧光值结果如下表：
由于酸度较高或较低都会加速叶绿素分解，由表中结果得藻液在pH为4-8范围内荧光值测定结果均小于1%，在该酸碱度范围内藻液稳定性良好，且该范围满足一般测试水体水质酸碱度。
综上，铜绿微囊藻作为淡水湖泊中最常见、实验室易于培养且较为廉价的藻类，由上述实验验证可得，铜绿微囊藻试验时间范围内稳定性良好，且在一定酸碱度范围内藻液稳定性较好。利用荧光法对比测定藻液叶绿素a提取液与叶绿素a标准品的荧光值发现，藻液叶绿素a提取液测定结果相对误差均在6.6%内，结果较为理想。进而做出藻液荧光法校正曲线，并用实际水样进行验证，测定结果相对误差在12.5%以内。即以铜绿微囊藻代替叶绿素a标准品运用于直接荧光法测定水体叶绿素a含量的实验中能快速、便捷、准确反应水体中藻类的生长情况，从而对水华现象进行及时预警。
附图说明
图1是铜绿微囊藻叶绿素a提取液荧光法曲线，图中给出了铜绿微囊藻叶绿素a提取液中叶绿素ａ浓度与荧光强度的相关关系；叶绿素ａ浓度在30～1800ug/l范围内，浓度与其荧光强度之间线性关系良好，其回归方程为y=0.1173x+7.1177（Ｒ2＝0.9947）；其中，y为其荧光强度，x为叶绿素ａ浓度（ug/l）。
图2是叶绿素a标准品溶液荧光法曲线，图中给出了叶绿素ａ标准样品中叶绿素ａ浓度与荧光强度的相关关系；叶绿素ａ浓度在15～1800ug/l范围内，叶绿素ａ浓度与荧光强度之间线性关系良好，回归曲线为y=0.122x+4.7366（Ｒ2＝0.9951）；其中，y为其荧光强度，x为叶绿素ａ浓度（ug/l）。
图3是铜绿微囊藻藻液荧光法校正曲线，图中，在铜绿微囊藻培养液中，叶绿素a浓度在19～330ug/l范围内，叶绿素浓度与荧光强度之间成良好的线性关系，且回归方程为y=0.0129x+0.4393R2=0.9936，y为其荧光强度值，x为叶绿素ａ浓度（ug/l）。
具体实施方式
以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。其中，供试藻铜绿微囊藻可以从中国科学院武汉水生生物研究所购买。铜绿微囊藻属于蓝藻门类，采用BG-11培养基，藻种培养基配方参考中国科学院武汉水生生物研究所提供的配方。其培养方法包括：①接种，在藻种培养的整个过程中都需要绝对的无菌操作，且在适宜藻生长的光照及温度条件下培养，7～10d转接1次。②藻种的驯化与同步培养，将保存的液体藻种转接到新鲜的培养基中，进行藻种的扩大和驯化培养。在人工气候培养箱中静置培养，光照强度为2000-3000lux，光暗比为14h:10h，温度：25±1℃，藻种达到同步生长后即可。
1.1铜绿微囊藻叶绿素ａ标准溶液的制备
取200ml实验室培养的铜绿微囊藻液，用装好乙酸纤维滤膜的抽滤装置分四次对藻液进行抽滤，抽滤完毕后取下滤膜，将滤膜夹在滤纸中放入-20℃冰箱中冷冻，每隔30min取出在室温中解冻15min，反复冻融3次，使细胞完全裂解以利于叶绿素a的提取。将滤膜放入50ml比色管中，加入95%乙醇定容，盖上塞子振摇1-2min。放入4℃冰箱中静置，每隔30min取出振摇一次，反复操作3次，然后以4000r/min离心15min,将上清液分别转移至50ml容量瓶中用95%乙醇定容。用国标法标定该储备液中叶绿素ａ的浓度作为储备液备用。
1.2储备液中叶绿素ａ浓度的测定及数据处理
以相应的95%乙醇作为空白，用紫外分光光度计测定储备液扫描波长在750nm、664nm、645nm和630nm处的吸光值，结果如下
表1.分光光度法测定铜绿微囊藻提取液结果
将表格内数值带入国标法计算公式：
得到储备液叶绿素浓度chla=1902.5ug/l；其中chla为叶绿素浓度a含量（ug/l）；E750、E664、E645、E630分别为储备液于波长750nm、664nm、645nm、630nm处的吸光值；V乙醇为乙醇萃取液的体积（ml）；V水样为藻液体积（l）；＆为比色皿光程(cm)。
1.3铜绿微囊藻提取液荧光法测定
取适量上述浓度为1902.5ug/l的铜绿微囊藻叶绿素ａ储备液稀释成浓度为30、90、150、300、450、600、800、1000、1200、1500、1800ug/l一系列溶液，在激发波长440nm、发射波长684nm、激发与发射狭缝均为5nm条件下,以95%乙醇为空白参比，分别测定各溶液的荧光强度。将浓度对铜绿微囊藻叶绿素ａ提取液的荧光强度作图绘制铜绿微囊藻叶绿素ａ荧光法曲线（图1）。
图1给出了铜绿微囊藻叶绿素a提取液中叶绿素ａ浓度与荧光强度的相关关系。叶绿素ａ浓度在30～1800ug/l范围内，浓度与其荧光强度之间线性关系良好，其回归方程为y=0.1173x+7.1177（Ｒ2＝0.9947）。其中，y为其荧光强度，x为叶绿素ａ浓度（ug/l）。
1.4叶绿素标准品荧光法曲线
取10mg叶绿素标准样品配制成10mg/l叶绿素标准溶液。将该标准溶液稀释成15、30、90、150、300、450、600、800、1000、1200、1500、1800ug/l一系列浓度梯度，在激发波长440nm发射波长684nm激发与发射狭缝均为5nm,以95%乙醇为空白参比，分别测定各溶液的荧光强度。将叶绿素浓度对荧光强度作图绘制叶绿素a标准样品荧光曲线（图2）。
图2给出了叶绿素ａ标准样品中叶绿素ａ浓度与荧光强度的相关关系。叶绿素ａ浓度在15～1800ug/l范围内，叶绿素ａ浓度与荧光强度之间线性关系良好，回归曲线为y=0.122x+4.7366（Ｒ2＝0.9951）。其中，y为其荧光强度，x为叶绿素ａ浓度（ug/l）。
1.5铜绿微囊藻叶绿素a提取液与叶绿素a标准样品荧光法结果对比
由表2可知，通过与叶绿素a标准样品比对，铜铝微囊藻叶绿素a提取液测定结果与标准值基本一致，相对误差均小于6.6%，由此可知，生长良好的铜绿微囊藻藻液可替代叶绿素a标准样品作为测定水样中叶绿素含量的标准。
表2.铜绿微囊藻叶绿素a提取液与叶绿素a标准样品荧光值测定结果
1.6铜绿微囊藻液直接荧光法校正曲线的建立
取经实验室培养铜绿微囊藻水样逐级稀释后配成体积各为20ml的一系列浓度梯度的溶液。
1.6.1每一份取出10ml藻液提取叶绿素，测定各萃取液的荧光强度利用铜绿微囊藻标准荧光曲线即可换算为铜绿微囊藻培养液中叶绿素ａ的浓度（数据见表3）。
1.6.2将每份剩余的10ml藻液不经任何处理，直接在如前所述的条件下测定荧光强度（数据见表3）。
1.6.3将步骤1.6.1中所得的叶绿素ａ浓度对步骤1.6.2中所得的荧光强度作图即得铜绿微囊藻藻液叶绿素ａ浓度与铜绿微囊藻液荧光强度校正曲线（图3）。
表3.铜铝微囊藻液直接荧光法测定结果
由图3可得人工培养的铜绿微囊藻水样中，叶绿素ａ浓度与荧光强度相关关系。在铜绿微囊藻培养液中，叶绿素a浓度在19～330ug/l范围内，叶绿素浓度与荧光强度之间成良好的线性关系，且回归方程为y=0.0129x+0.4393R2=0.9936，y为其荧光强度值，x为叶绿素ａ浓度（ug/l）。
根据已建立的铜绿微囊藻藻液荧光强度和叶绿素ａ浓度之间的校正曲线，只需采用荧光仪直接测出水样的荧光强度，便可利用它快速得到叶绿素ａ浓度。
上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。
Claims (3)
1.铜绿微囊藻替代叶绿素标准物质快速实时测定水体叶绿素的方法，其特征步骤包括：
A、铜绿微囊藻叶绿素ａ标准溶液的制备
取铜绿微囊藻液，抽滤，抽滤完毕后取下滤膜，将滤膜夹在滤纸中冷冻，反复冻融，使细胞完全裂解以利于叶绿素a的提取；将滤膜放入比色管中，加入95%乙醇定容，放入4℃冰箱中静置，然后以4000r/min离心15min,将上清液分别转移至容量瓶中用95%乙醇定容；作为储备液备用；
B、储备液中叶绿素ａ浓度的测定
用国标法标定储备液中叶绿素ａ的浓度，以相应的95%乙醇作为空白，用紫外分光光度计测定储备液扫描波长在750nm、664nm、645nm和630nm处的吸光值，将测得的结果数据带入国标法计算公式：
其中chla为叶绿素a的浓度，单位ug/l；E750、E664、E645、E630分别为储备液于波长750nm、664nm、645nm、630nm处的吸光值；V乙醇为乙醇萃取液的体积，单位ml；V水样为藻液体积，单位l；＆为比色皿光程，单位cm；通过计算即获得储备液中叶绿素a的浓度chla；
C、储备液荧光测定
步骤B已经计算出储备液中叶绿素a的浓度chla，取适量上述储备液依次稀释成浓度为30、90、150、300、450、600、800、1000、1200、1500、1800ug/l的系列溶液，在激发波长440nm、发射波长684nm、激发与发射狭缝均为5nm条件下,以95%乙醇为空白参比，分别测定各溶液的荧光强度；
D、铜绿微囊藻标准荧光曲线的建立
将储备液的浓度对其荧光强度作图绘制铜绿微囊藻叶绿素ａ荧光法曲线，得到附图1，即得到铜绿微囊藻叶绿素a提取液中叶绿素ａ浓度与荧光强度的相关关系；同时计算其回归方程为y=0.1173x+7.1177，Ｒ2＝0.9947，其中，y为其荧光强度，x为叶绿素ａ浓度，单位ug/l；
E、铜绿微囊藻校正荧光曲线的建立
取铜绿微囊藻水样逐级稀释，配成体积各为20ml的一系列浓度梯度的溶液，然后，
E-1、每一份藻液溶液各取出10ml，分别测定其荧光强度，利用步骤D获得的铜绿微囊藻标准荧光曲线即可换算为藻液溶液中叶绿素ａ的浓度；
E-2、每份藻液溶液剩余的10ml不经任何处理，同条件下测定荧光强度；
E-3、将步骤E-1中所得的叶绿素ａ浓度对步骤E-2中所得的荧光强度作图，即得附图3，为铜绿微囊藻藻液叶绿素ａ浓度与铜绿微囊藻液荧光强度校正曲线；同时计算其回归方程为y=0.0129x+0.4393R2=0.9936，其中y为其荧光强度值，x为叶绿素ａ浓度，单位ug/l；
根据所建立的铜绿微囊藻藻液荧光强度和叶绿素ａ浓度之间的校正曲线，只需采用荧光仪直接测出水样的荧光强度，便可实时、快速得到叶绿素ａ的浓度。
2.根据权利要求1所述的铜绿微囊藻替代叶绿素标准物质快速实时测定水体叶绿素的方法，其特征在于：步骤A的具体操作步骤如下：取200ml铜绿微囊藻液，用装好乙酸纤维滤膜的抽滤装置分四次对藻液进行抽滤，抽滤完毕后取下滤膜，将滤膜夹在滤纸中放入-20℃冰箱中冷冻，每隔30min取出在室温中解冻15min，反复冻融3次，使细胞完全裂解以利于叶绿素a的提取；将滤膜放入50ml比色管中，加入95%乙醇定容，盖上塞子振摇1-2min，放入4℃冰箱中静置，每隔30min取出振摇一次，反复操作3次，然后以4000r/min离心15min,将上清液分别转移至50ml容量瓶中用95%乙醇定容；作为储备液备用。
3.根据权利要求1所述的铜绿微囊藻替代叶绿素标准物质快速实时测定水体叶绿素的方法，其特征在于：步骤E-1和E-2中，采用步骤C的荧光测定条件进行荧光测定。
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