CN105759003A - 一种测量Fo来估算水体的初级生产力的方法 - Google Patents

一种测量Fo来估算水体的初级生产力的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种测量Fo来表征叶绿素a含量方法，包括：建立Fo?叶绿素a含量的相关性方程；测量样品的Fo；将Fo代入所得到的方程中，计算叶绿素a含量。本发明还提供了一种估算水体初级生产力的方法。将上述方法得到的叶绿素a含量代入方程P＝K·r·c(Chla)·DH得到水体的初级生产力。本发明还提供了一种测量藻细胞密度的方法，包括建立Fo?藻细胞密度的相关性方程；测量样品的Fo；将Fo代入所得到的方程中，计算藻细胞密度。通过本发明，可容易地实现对光合微藻培养液、水产养殖水体或自然水体中的叶绿素含量以及藻细胞密度的测量，并且可容易地估计水产养殖水体或自然水体中的初级生产力，评估水体的健康水平，进而为水产养殖、环境监测等提供必要的依据。

Description

一种测量Fo来估算水体的初级生产力的方法
技术领域
本发明涉及微藻领域，更特别地，本发明涉及使用Fo来测量含有微藻的水体中的叶绿素a含量和藻细胞密度，并由此估计水体的初级生产力。
背景技术
初级(或原始)生产力，又称水域第一性生产力，是水中营光合作用的植物(包括细菌)在单位面积、单位时间内固定太阳光能量产生有机物质量的能力。在水产养殖投饵量、水环境营养类型等领域，初级生产力是重要评价依据之一。为了估算初级生产力，常常需要测量叶绿素a含量，然后通过公式P＝K·r·c(Chla)·DH，其中：P为初级生产力，mg/(m3·d)；r为同化系数；c(Chla)为叶绿素a含量，mg/m3；DH为日照时间，h；K为经验常数。
目前测量水体的叶绿素a含量的方法主要有比色度法和荧光法。比色度法能得到精确结果，但是步骤繁复，并且在测量过程中要使用有机溶剂来萃取叶绿素，不利于野外操作。荧光法简便易行，但是一般需要先对水体中的藻进行全波谱扫描，找到合适的激发波长和发射波长，然后设定好激发光和所接收的发射光波长来测量荧光强度。由于自然水体中微藻成分复杂，每种藻都有各自的激发波长和发射波长，所以这种方法在对自然水体的检测中误差较大。
藻细胞密度是表征微藻生长状态的重要参数之一。目前，测量藻细胞密度的方法主要是通过在显微镜下使用细胞计数器进行计数而得，这种方法费事费力，不好操作。
调制叶绿素荧光，全称脉冲振幅调制(Pulse-Amplitude-Modulation,PAM)叶绿素荧光，国内一般简称调制叶绿素荧光，测量调制叶绿素荧光的仪器叫调制荧光仪。调制叶绿素荧光(PAM)是研究光合作用的强大工具，与光合放氧、气体交换并称为光合作用测量的三大技术。由于其测量快速、简单、可靠、且测量过程对样品生长基本无影响，目前已成为光合作用领域发表文献最多的技术。使用调制叶绿素荧光仪，经过充分暗适应后，所有电子门均处于开放态，打开测量光得到Fo，此时给出一个饱和脉冲，所有的电子门就都将该用于光合作用的能量转化为了荧光和热，此时得到的叶绿素荧光为Fm。常常根据Fm和Fo计算出PS II的最大量子产量Fv/Fm＝(Fm-Fo)/Fm，它反映了植物的潜在最大光合能力。然而，尚未有文献或专利资料记载使用调制叶绿素荧光参数Fo来表征叶绿素a的含量或微藻细胞密度。
发明内容
为了解决以上技术问题，
本发明提供了一种检测水体中的叶绿素a含量的方法，包括以下步骤：
1)建立所述水体中的Fo-叶绿素a含量的相关性方程，包括：从所述水体中取样，使用所述样品制备不同稀释度的样品，测量各稀释度样品的Fo和叶绿素a含量，以Fo为横坐标、叶绿素a含量为纵坐标作图得到Fo-叶绿素a含量的相关性方程；
2)从含有与所述水体一样的藻种类的水体中取样，测量所述样品的Fo；
3)将步骤b中所测得的Fo值代入步骤1所得到的方程中，从而计算叶绿素a含量。
进一步地，所述水体为实验室光合微藻培养液、水产养殖水体或自然水体。
进一步地，所述光合微藻为蓝藻、硅藻、绿藻、隐藻、裸藻、甲藻中的一种或任意几种的混合。
进一步地，所述蓝藻为平裂藻、色球藻、微囊藻、鱼害微囊藻、鱼腥藻、假鱼腥藻中的一种或任意几种的混合；所述硅藻为小环藻、直链藻、针杆藻、舟形藻中的一种或任意几种的混合；所述绿藻为衣藻、鼓藻、小球藻、栅藻、盘星藻中的一种或任意几种的混合。
本发明还提供了一种测量水体的初级生产力的方法，包括将根据上述方法得到的叶绿素a含量代入以下方程中得到水体的初级生产力：
P＝K·r·c(Chla)·DH
其中：P为初级生产力，单位为mg/(m3·d)；r为同化系数；c(Chla)为叶绿素a含量，单位为mg/m3；DH为日照时间，单位为h；K为经验常数。
本发明还提供了一种测量实验室光合微藻培养液的藻细胞密度的方法，包括以下步骤：
1)建立所述藻的Fo-藻细胞密度的方程，包括：从所述实验室光合微藻培养液中取样，使用所述样品制备不同稀释度的样品，测量各稀释度样品的Fo和藻细胞密度，以Fo为横坐标、藻细胞密度为纵坐标作图，得到Fo-藻细胞密度的相关性方程；
2)从含有与所述实验室光合微藻培养液一样的藻种类的藻培养液中取样，测量所述样品的Fo；
3)将步骤2中所测得的Fo的值代入步骤1所得到的方程中，从而计算藻细胞密度。
进一步地，所述光合微藻为蓝藻、硅藻、绿藻、隐藻、裸藻、甲藻中的一种或任意几种的混合。
进一步地，所述蓝藻为平裂藻、色球藻、微囊藻、鱼害微囊藻、鱼腥藻、假鱼腥藻中的一种或任意几种的混合；所述硅藻为小环藻、直链藻、针杆藻、舟形藻中的一种或任意几种的混合；所述绿藻为衣藻、鼓藻、小球藻、栅藻、盘星藻中的一种或任意几种的混合。
通过以上技术方案，本领域技术人员能够更简单快捷地测定纯培养或混合培养的微藻生物量大小及生长情况。结合建立Fo与自然水体光合微藻的生物量相关性方程，可准确计算水产养殖水体或自然水体中的初级生产力。对于易爆发水华的水体，通过检测Fo的突然增大，监测水体水华的爆发。
因此，通过本发明，可容易地实现对光合微藻培养液、水产养殖水体或自然水体中的叶绿素含量以及藻细胞密度的测量，并且可容易地估计水产养殖水体或自然水体中的初级生产力，评估水体的健康水平，进而为水产养殖、环境监测等提供必要的依据。
附图说明
图1为色球藻(FACHB-193)的Fo-叶绿素a含量的相关性曲线；
图2为针杆藻(FACHB-1684)的Fo-叶绿素a含量的相关性曲线；
图3为小球藻(FACHB-275)的Fo-叶绿素a含量的相关性曲线；
图4为水产养殖水体水样的Fo-叶绿素a含量的相关性曲线；
图5为平裂藻(FACHB-1486)的Fo-藻细胞密度的相关性曲线；
图6为小环藻(FACHB-1631)的Fo-藻细胞密度的相关性曲线；
图7为衣藻(FACHB-67)的Fo-藻细胞密度的相关性曲线。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
发明人在研究微藻叶绿素荧光的过程中，出乎意料地发现，在Fo值为103至106的范围内，调制叶绿素荧光参数中的Fo与水体中叶绿素a含量以及藻细胞数量存在显著的线性关系。基于此，在实验室培养过程中，可使用Fo作为参数来表征光合微藻的藻细胞密度、叶绿素a含量等；在水产养殖生产过程中，可通过Fo来估算养殖水体的初级生产力，从而为投饵等生产活动提供依据；在对易爆发水华的水体中，可通过持续测量Fo的突然增大来监测水体水华的爆发。
实施例1-3通过Fo测量纯的平裂藻、小环藻、衣藻培养液的叶绿素a含量。
将培养至对数期的平裂藻、小环藻、衣藻(藻种都来自中科院水生生物研究所藻种库)培养液，以2倍的梯度稀释5次，得到6个浓度梯度。
从每个浓度的藻液中分别取1mL到离心管中，在室温下12000rpm离心3min，弃去上清液，向沉淀中1mL甲醇，振荡重悬，于4℃下避光12h以上。然后，12000rpm离心5分钟，将上清液转移至比色皿中，使用分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)测量652.4nm和665.2nm处的吸光度OD652.4和OD665.2(甲醇为空白对照)。通过下式计算叶绿素a含量：
c(Chl a)(μg/mL)＝16.72×OD665.2-9.16×OD652.4
从每个浓度的藻液中分别取6mL至离心管中，暗适应20min，在黑暗下吸取3mL到比色皿中，用AquaPen-C AP-C 100(捷克共和国PSI集团有限公司)测定620nm下的叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP-620)。从AquaPen-C AP-C 100导出数据即可得到Fo。
以Fo为横坐标，相应浓度藻液下的叶绿素a含量为纵坐标进行描点作图，得到Fo-叶绿素a含量的相关性曲线和方程。结果分别见图1至3，所得的方程如下：色球藻(FACHB-193)，y＝0.0005x-0.7362，R2＝0.9533；针杆藻(FACHB-1684)，y＝0.0003x-0.0984，R2＝0.9961；小球藻(FACHB-275)，y＝0.0001x-0.3957，R2＝0.9257；其中x和y分别为Fo与叶绿素a含量(mg·L-1)。
测量培养过程中的纯藻培养液的Fo，将Fo代入方程得到叶绿素a的含量。结果见表1。
表1培养过程中纯藻培养液通过测量Fo计算叶绿素a含量
实施例4-5水产养殖水体的叶绿素
本发明所用的水产养殖的水样来自江苏省盐城市射阳县某水产养殖池塘，经检测，该水体的水样中主要含有以下光合微藻：蓝藻，例如平裂藻、色球藻、微囊藻、鱼害微囊藻、鱼腥藻、假鱼腥藻；硅藻，例如小环藻、直链藻、针杆藻、舟形藻；绿藻，例如衣藻、鼓藻、小球藻、栅藻、盘星藻；隐藻；裸藻；甲藻。2015年6月5日于该池塘中采集水样，300ml，采样深度为1m，通过抽滤(津腾隔膜真空泵，滤膜孔径0.45μm)浓缩至6ml，按实施例1中的方法建立Fo-叶绿素a含量相关性曲线(图4)，获得相关性方程为y＝0.00008754x-0.31527133，R2＝0.97082079，其中x和y分别为Fo与叶绿素a含量(mg·L-1)。
2015年7月5日于同一养殖池塘同一深度取样300ml，抽滤法浓缩至6ml，按上述方法分别检测浓缩水样的Fo，代入上一步得到相关性方程，结果见表2。
将上一步所得的叶绿素a含量代入以下公式中，以估算初级生产力：
P＝K·r·c(Chla)·DH，
其中，P为初级生产力，mg/(m3·d)；r为同化系数，采取平均同化系数3.2mg/(mg·h)；c(Chla)为叶绿素a含量，mg/m3；DH为日照时间，h，盐城夏季平均日照时间为7.35h；K为经验常数，一般晴天为2.0，阴天为1.5，采用经验常数平均值1.97，结果见表2。
表2水产养殖水体中通过测量Fo计算叶绿素a含量和估算初级生产力
实施例6-8通过Fo测量纯的平裂藻、小环藻、衣藻培养液的细胞密度。
将培养至对数期的平裂藻、小环藻、衣藻(藻种都来自中科院水生生物研究所藻种库)培养液，以2倍的梯度稀释5次，得到6个浓度梯度，从每个浓度的藻液中取1mL用于细胞计数。计数方法是：
清洗计数板(XB-K-25，上海求精生化试剂仪器有限公司)，直至镜检无污物，吹风机吹干，盖上盖玻片；用移液器吹打藻液，使之分散均匀，然后滴在盖玻片的边缘，让藻液沿缝隙依靠毛细渗透作用自动进入计数室，计数室不可有气泡；加样完毕后，静置5min。然后将计数板置于显微镜(Olympus BX53，日本奥林巴斯集团，规格：0.10mm×1/400mm2)载物台上，先用10倍物镜寻找计数室，然后转换为40倍物镜。每个计数室选5个中格(选4个角和中央的一个中格)中的藻细胞进行计数。位于格线上的藻细胞一般只数上方和右边线上的。计数上下两个计数室中的细胞个数取平均值。细胞计数板的规格是0.10mm×1/400mm2，根据此体积来计算藻细胞的密度。
根据实施例1的方法测量Fo值。以Fo为横坐标，相应浓度藻液下的藻细胞密度为纵坐标进行描点作图，得到Fo-藻细胞密度的相关性曲线和方程(图5-7)。结果分别见图1至3，所得的方程如下：平裂藻(FACHB-1486)，y＝514.06x-1187995.70，R2＝0.99；小环藻(FACHB-1631)，y＝51.36x-523453.53，R2＝0.96；衣藻(FACHB-67)，y＝62.06x-145409.63，R2＝0.99；其中x和y分别为Fo与藻细胞密度(cell·mL-1)。
测量培养过程中的纯藻培养液的Fo，将Fo代入方程计算得到藻细胞密度。结果见表3。
表3培养过程中纯藻培养液通过测量Fo计算藻细胞密度
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种检测水体中的叶绿素a含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)建立所述水体中的Fo-叶绿素a含量的相关性方程，包括：从所述水体中取样，使用所述样品制备不同稀释度的样品，测量各稀释度样品的Fo和叶绿素a含量，以Fo为横坐标、叶绿素a含量为纵坐标作图得到Fo-叶绿素a含量的相关性方程；
2)从含有与所述水体一样的藻种类的水体中取样，测量所述样品的Fo；
3)将步骤b中所测得的Fo值代入步骤1所得到的方程中，从而计算叶绿素a含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水体为实验室光合微藻培养液、水产养殖水体或自然水体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述光合微藻为蓝藻、硅藻、绿藻、隐藻、裸藻、甲藻中的一种或任意几种的混合。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述蓝藻为平裂藻、色球藻、微囊藻、鱼害微囊藻、鱼腥藻、假鱼腥藻中的一种或任意几种的混合；所述硅藻为小环藻、直链藻、针杆藻、舟形藻中的一种或任意几种的混合；所述绿藻为衣藻、鼓藻、小球藻、栅藻、盘星藻中的一种或任意几种的混合。
5.一种测量水体的初级生产力的方法，其特征在于，将根据权利要求1至4任一项所述的方法得到的叶绿素a含量代入以下方程中得到水体的初级生产力：
P＝K·r·c(Chla)·DH
其中：P为初级生产力，单位为mg/(m3·d)；r为同化系数；c(Chla)为叶绿素a含量，单位为mg/m3；DH为日照时间，单位为h；K为经验常数。
6.一种测量实验室光合微藻培养液的藻细胞密度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)建立所述藻的Fo-藻细胞密度的相关性方程，包括：从所述实验室光合微藻培养液中取样，使用所述样品制备不同稀释度的样品，测量各稀释度样品的Fo和藻细胞密度，以Fo为横坐标、藻细胞密度为纵坐标作图，得到Fo-藻细胞密度的相关性方程；
2)从含有与所述实验室光合微藻培养液一样的藻种类的藻培养液中取样，测量所述样品的Fo；
3)将步骤2中所测得的Fo的值代入步骤1所得到的方程中，从而计算藻细胞密度。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述光合微藻为蓝藻、硅藻、绿藻、隐藻、裸藻、甲藻中的一种或任意几种的混合。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述蓝藻为平裂藻、色球藻、微囊藻、鱼害微囊藻、鱼腥藻、假鱼腥藻中的一种或任意几种的混合；所述硅藻为小环藻、直链藻、针杆藻、舟形藻中的一种或任意几种的混合；所述绿藻为衣藻、鼓藻、小球藻、栅藻、盘星藻中的一种或任意几种的混合。
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