CN111024670A - 一种基于pea荧光曲线测定水体初级生产力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测水体中的初级生产力的方法，包括以下步骤S1：建立所述水体中的PEA荧光曲线下面积‑初级生产力的相关性方程；S2：从含有与所述水体一样的微藻种类的水体中取样，测定并绘制所述样品的PEA荧光曲线，并计算PEA荧光曲线下面积；S3：将S2中所测得的PEA荧光曲线下面积代入S1所得到的方程中，从而计算得到初级生产力。通过本发明，可容易地实现对光合微藻培养液、水产养殖水体或自然水体中的叶绿素含量以及藻细胞密度的测量，并且可容易地估计水产养殖水体或自然水体中的初级生产力，评估水体的健康水平，进而为水产养殖、环境监测等提供必要的依据。

Description

一种基于PEA荧光曲线测定水体初级生产力的方法

技术领域

本发明涉及微藻领域，更特别地，本发明涉及一种基于PEA荧光曲线测定含有微藻的水体中的叶绿素a含量和水体初级生产力的方法。

背景技术

初级生产力，是水中营光合作用的植物(包括细菌)在单位面积、单位时间内固定太阳光能量产生有机物质量的能力。在水产养殖行业，需要根据水体的初级生产力来评估投饵量和养殖规模传统的估算初级生产力方法需要测量叶绿素a(Chla)含量，然后根据Chla含量来估算初级生产力。

目前测量水体的叶绿素a含量的方法主要有比色度法和荧光法。比色度法能得到精确结果，但是步骤繁复，并且在测量过程中要使用有机溶剂来萃取叶绿素，不利于野外操作。荧光法简便易行，但是一般需要先对水体中的藻进行全波谱扫描，找到合适的激发波长和发射波长，然后设定好激发光和所接收的发射光波长来测量荧光强度。由于自然水体中微藻成分复杂，每种藻都有各自的激发波长和发射波长，所以这种方法在对自然水体的检测中误差较大。

因此，需要一种新的方法来测定或估算水体的Chla含量及初级生产力水平。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种检测水体中的初级生产力的方法，包括以下步骤：

S1：建立所述水体中的PEA荧光曲线下面积-初级生产力的相关性方程，包括：从所述水体中取样，使用所述样品制备不同稀释度的样品，测量各稀释度样品的PEA荧光曲线下面积和初级生产力，以PEA荧光曲线下面积为横坐标、初级生产力为纵坐标作图得到PEA荧光曲线下面积-初级生产力的相关性方程；

S2：从含有与所述水体一样的微藻种类的水体中取样，测定并绘制所述样品的PEA荧光曲线，并计算PEA荧光曲线下面积；

S3：将S2中所测得的PEA荧光曲线下面积代入S1所得到的方程中，从而计算得到初级生产力。

在一个具体实施方案中，所述水体为实验室光合微藻培养液、水产养殖水体或自然水体。

在一个具体实施方案中，所述光合微藻培养液中的光合微藻为集胞藻、聚球藻、莱茵衣藻、小球藻的一种或任意几种的混合。

在一个优选实施方案中，所述PEA荧光曲线通过在620nm波长下，1800μmol m^-2s^-1饱和脉冲，50μmol m^-2s^-1测量光下测量得到。

在一个优选实施方案中，所述述PEA荧光曲线下面积的取值区间为0-40×10¹⁰。

本发明还提供了一种检测水体中的叶绿素a含量的方法，包括以下步骤：

1)建立所述水体中的PEA荧光曲线下面积-叶绿素a含量的相关性方程，包括：从所述水体中取样，使用所述样品制备不同稀释度的样品，测量各稀释度样品的PEA荧光曲线下面积和叶绿素a含量，以PEA荧光曲线下面积为横坐标、叶绿素a含量为纵坐标作图得到PEA荧光曲线下面积-叶绿素a含量的相关性方程；

2)从含有与所述水体一样的微藻种类的水体中取样，测定并绘制所述样品的PEA荧光曲线，并计算PEA荧光曲线下面积；

3)将步骤2)中所测得的PEA荧光曲线下面积代入步骤1)所得到的方程中，从而计算叶绿素a含量。

在一个具体实施方案中，所述水体为实验室光合微藻培养液、水产养殖水体或自然水体。

在一个具体实施方案中，所述光合微藻培养液中的光合微藻为集胞藻、聚球藻、莱茵衣藻、小球藻的一种或任意几种的混合。

在一个优选实施方案中，所述PEA荧光曲线通过在620nm波长下，1800μmol m^-2s^-1饱和脉冲，50μmol m^-2s^-1测量光下测量得到。

在一个优选实施方案中，所述述PEA荧光曲线下面积的取值区间为0-40×10¹⁰。

通过以上技术方案，本领域技术人员能够更简单快捷地测定纯培养或混合培养的微藻生物量大小及生长情况。结合建立PEA荧光曲线下面积与光合微藻的生物量相关性方程，可准确计算水产养殖水体或自然水体中的初级生产力。对于易爆发水华的水体，通过检测PEA荧光曲线下面积的突然增大，监测水体水华的爆发。

因此，通过本发明，可容易地实现对光合微藻培养液、水产养殖水体或自然水体中的叶绿素含量以及藻细胞密度的测量，并且可容易地估计水产养殖水体或自然水体中的初级生产力，评估水体的健康水平，进而为水产养殖、环境监测等提供必要的依据。

附图说明

图1为莱茵衣藻CC4533(a)、CC125(b)、小球藻C2(c)、聚球藻PCC7942(d)、集胞藻PCC6803(e)以及和及其混合水样(f)中的Chla含量与PEA曲线下面积之间的相关性曲线；

图2为莱茵衣藻CC4533(a)、CC125(b)、小球藻C2(c)、聚球藻PCC7942(d)、集胞藻PCC6803(e)以及和及其混合水样(f)中的藻细胞密度与PEA曲线下面积之间的相关性曲线；

图3为莱茵衣藻CC4533(a)、CC125(b)、小球藻C2(c)、聚球藻PCC7942(d)、集胞藻PCC6803(e)以及和及其混合水样(f)中的初级生产力与PEA曲线下面积之间的相关性曲线；

图4为武汉市某水产养殖水体水样中的藻细胞密度(a)、Chla含量(b)和初级生产力(c)与PEA曲线下面积之间的相关性曲线。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

发明人在研究微藻叶绿素荧光的过程中，出乎意料地发现，在620nm波长下，1800μmol m^-2s^-1饱和脉冲，50μmol m^-2s^-1测量光下测量得到的叶绿素荧光动态诱导曲线(PEA荧光曲线或OJIP曲线)的曲线下面积与叶绿素a含量呈现线性相关。

本文中以举例说明的方式列举了几种微藻培养物的PEA荧光曲线下面积与叶绿素a含量的关系，所列举的微藻既有原核的蓝藻，也有真核的绿藻，可见PEA荧光曲线下面积与叶绿素a含量的线性关系具有普遍性，并非局限于本文所列举的藻株。

1、藻株及培养

本文用到了集胞藻PCC6803、聚球藻PCC7942、小球藻C2以及莱茵衣藻CC125和CC4533。其中，集胞藻PCC6803、聚球藻PCC7942、小球藻C2在BG11培养基培养，培养条件为温度30℃、光照强度30μmol m^-2s^-1、120rpm振荡；在TAP培养基中培养，培养条件为温度25℃、光照强度40μmol m^-2s^-1、120rpm振荡。

2、水产养殖水体的水样采集

水样取自武汉市的一个养殖池塘。于各取样点收集50ml水样，以0.45μm的滤膜过滤水样对其PEA荧光曲线下面积和细胞密度、Chla含量分别进行测定。

3、PEA荧光曲线测定

使用手持叶绿素荧光仪AquaPen-C AP-C 100(Photon Systems Instruments，Brno，Czech Republic)进行PEA荧光曲线的测定。测量前，取3mL藻液在黑暗条件下暗适应15min。在620nm波长，1800μmol m^-2s^-1饱和脉冲，50μmol m^-2s^-1测量光下测定叶绿素荧光动态诱导曲线。使用统计软件对PEA荧光曲线进行积分，求得曲线下面积。

4、传统方法测定细胞密度

使用微流成像颗粒分析系统(CytoFlex S)进行细胞密度测定，测定前将1mL不同细胞密度的样品使用200目纱布过滤。测定时设置样本流速为10μl min^-1，每个样本采集10000个细胞。最后由软件计算出细胞密度。

5、传统方法测定Chla含量

取不同细胞密度的藻液1mL，1200rpm离心3min，弃上清，加入1mL100％(v/v)甲醇，充分震荡，4℃避光萃取24h。12000rpm离心3min，取上清用紫外分光光度计在470nm、625.4nm、665.2nm处测定其吸光度，以100％(v/v)甲醇为空白对照。计算公式如下：

叶绿素a(Chla)(μg mL^-1)＝16.72A_665.2-9.16A_652.4

6、纯培养微藻的PEA荧光曲线下面积与Chla含量和藻细胞密度的关系

将集胞藻PCC6803、聚球藻PCC7942、小球藻C2以及莱茵衣藻CC125和CC4533培养至对数期，取藻样分成两部分，一部分分别进行梯度稀释，以2倍的梯度稀释5次，得到6个浓度梯度；另一部分用于等体积混合，然后以2倍的梯度稀释5次，得到6个浓度梯度，通过上文中的方法测定绘制PEA荧光曲线，计算PEA荧光曲线下面积，并测定Chla含量和藻细胞密度。

结果如图1-3所示，集胞藻PCC6803、聚球藻PCC7942、小球藻C2以及莱茵衣藻CC125和CC4533，以及这些微藻培养物的混合物，的PEA荧光曲线下面积均与藻细胞密度和Chla含量具有线性相关性。根据我们的进一步研究显示，在PEA荧光曲线下面积的取值为0-40的范围内时，该线性关系有效。以上所测试的微藻涵盖了原核藻类和真核藻类的培养物，以及原核藻类和

7、水产养殖水体水样的PEA荧光曲线下面积与Chla含量、藻细胞密度和初级生产力的关系

对进行梯度稀释，通过上文中的方法测定绘制PEA荧光曲线，计算PEA荧光曲线下面积，并测定Chla含量和藻细胞密度，并计算初级生产力。初级生产力计算公式：

P＝K·r·c(Chla)·DH，

其中，P为初级生产力，mg/(m³·d)；r为同化系数，采取平均同化系数3.2mg/(mg·h)；c(Chla)为叶绿素a含量，mg/m³；DH为日照时间，h，武汉冬季平均日照时间为3.80h；K为经验常数，一般晴天为2.0，阴天为1.5，采用经验常数平均值1.97。

结果如图4所示，养殖水体水样的PEA荧光曲线下面积均与藻细胞密度、Chla含量和具有线性相关性。根据我们的进一步研究显示，在PEA荧光曲线下面积的取值为0-40的范围内时，该线性关系有效。

8、使用PEA荧光曲线下面积测定水样的Chla含量、细胞密度和初级生产力

取集胞藻PCC6803、聚球藻PCC7942、小球藻C2、莱茵衣藻CC125和CC4533以及养殖水体的水样，分别测定其PEA荧光曲线，用传统方法检测Chla含量和藻细胞密度，并通过Chla含量计算初级生产力。同时，根据上文的线性关系整理出相应的线性方程(表1)，对这些水样测定绘制PEA荧光曲线，将PEA荧光曲线下面积代入到线性方程中计算Chla含量、藻细胞密度和初级生产力。结果如表2所示，对于纯培养的微藻水样以及这些微藻水样的混合水样，根据PEA荧光曲线下面积计算得到的Chla含量和初级生产力与传统方法之间的偏差为3-6％，属于误差范围内；对于养殖水体水样，根据PEA荧光曲线下面积计算得到的Chla含量和初级生产力与传统方法之间的偏差为1-3％，属于误差范围内。从实验数据显示，通过PEA荧光曲线下面积来估算Chla含量和初级生产力是可行并可靠的。

表1 PEA荧光曲线下面积与Chla含量、藻细胞密度和初级生产力之间的线性方程

表2通过PEA荧光曲线下面积计算得到的Chla含量、藻细胞密度和初级生产力与传统方法测定值的比较

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测水体中的初级生产力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：建立所述水体中的PEA荧光曲线下面积-初级生产力的相关性方程；

S2：从含有与所述水体一样的微藻种类的水体中取样，测定并绘制所述样品的PEA荧光曲线，并计算PEA荧光曲线下面积；

S3：将S2中所测得的PEA荧光曲线下面积代入S1所得到的方程中，从而计算得到初级生产力。

2.根据权利要求1所述的检测水体中的初级生产力的方法，其特征在于，所述水体为实验室光合微藻培养液、水产养殖水体或自然水体。

3.根据权利要求2所述的检测水体中的初级生产力的方法，其特征在于，所述光合微藻培养液中的光合微藻为集胞藻、聚球藻、莱茵衣藻、小球藻的一种或任意几种的混合。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的检测水体中的初级生产力的方法，其特征在于，所述PEA荧光曲线通过在620nm波长下，1800μmol m^-2s^-1饱和脉冲，50μmol m^-2s^-1测量光下测量得到。

5.根据权利要求4所述的检测水体中的初级生产力的方法，其特征在于，所述述PEA荧光曲线下面积的取值区间为0-40×10¹⁰。

6.一种检测水体中的叶绿素a含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)建立所述水体中的PEA荧光曲线下面积-叶绿素a含量的相关性方程；

2)从含有与所述水体一样的微藻种类的水体中取样，测定并绘制所述样品的PEA荧光曲线，并计算PEA荧光曲线下面积；

3)将步骤2)中所测得的PEA荧光曲线下面积代入步骤1)所得到的方程中，从而计算叶绿素a含量。

7.根据权利要求6所述检测水体中的叶绿素a含量的方法，其特征在于，所述水体为实验室光合微藻培养液、水产养殖水体或自然水体。

8.根据权利要求7所述检测水体中的叶绿素a含量的方法，其特征在于，所述光合微藻培养液中的光合微藻为集胞藻、聚球藻、莱茵衣藻、小球藻的一种或任意几种的混合。

9.根据权利要求6-8中任一项所述检测水体中的叶绿素a含量的方法，其特征在于，所述PEA荧光曲线通过在620nm波长下，1800μmol m^-2s^-1饱和脉冲，50μmol m^-2s^-1测量光下测量得到。

10.根据权利要求9所述检测水体中的叶绿素a含量的方法，其特征在于，所述述PEA荧光曲线下面积的取值区间为0-40×10¹⁰。

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