CN103163094A - 叶片中叶绿素无损测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种叶片中叶绿素无损测定方法。其方法是用两种(或三种)特定波长的光线照射在叶片和反射板上按照它们反射率计算出叶绿素含量的一种相对指数(或实际含量)，该指数(或实际含量)与叶绿素总含量(或叶绿素a、叶绿素b含量及总量)存在显著的相关关系(或定量函数关系)，进而根据这种相关性估测计算或还原出片中叶绿素的含量(或计算出叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素量)。本发明方法不受叶片厚度的限制，而现有的透射式比色测定法在叶片厚度大时，吸光度A＞1.0时，误差急速扩大；本发明所采用的漫反射式测定方法则因漫反射发生在叶片内部的任一层面，受叶片厚度的影响轻微；本发明方法对叶绿素的检测成本极低，几乎没有耗材，也无需换算模型的技术准备过程。

Description

叶片中叶绿素无损测定方法

技术领域

本发明涉及叶绿素的检测分析方法，具体涉及一种叶片中叶绿素无损测定方法。

背景技术

叶绿素含量是衡量植物光合作用与生长状况的一项重要指标，叶绿素含量检测技术的研究在农业生产、林业研究等方面有着至关重要的意义。传统的叶绿素含量检测方法都是先提取叶绿素，再用分光光度法测定其含量。这种方法具有耗时长、对叶片有破坏性、不便于野外测量、不便于连续测量等诸多缺点。而现在使用比较多的是叶绿素测定仪来进行测量，使用这种方法虽然弥补了传统测量方法的缺点，能够快速无损伤估测准确的测量叶绿素含量，但也存在许多不足之处。

迄今为止国内外叶片叶绿素无损测定普遍采用透射式比色方法，例如日本柯尼卡美能达公司的SPAD 502plus叶绿素仪、美国国OPTI电器公司CCM--200型手持叶绿素计、英国Hansatech公司CL-01叶绿素仪、美国FT绿色有限公司产品atLEAF叶绿素仪等，以及我国一些厂家所生产的SPAD的叶绿素仪，均采用透射比色方法，其测值是一个与叶绿素含量相关的相对指标。这些现有方法的优点是无损测定、方便、快捷、效率高，其不足之处主要是：

①测定的叶片厚度受限，含量浓度受限：这是由于叶片是一个透明度很低的检测对象；据SPAD说明书称其最大可测定厚度为1.2mm，实际上当叶绿素浓度较大时其分辨率就已经很低了；

②测试得到的相对指标与叶片叶绿素含量之间的关系，需要按照作物品种、生长期、取样部位建立不同的相关曲线才能取得；

③不能反映叶绿素a、叶绿素b，组成成分的数量和比例；

④不能定量，只是半定量性的估测。

目前反射式检测技术已有广泛性应用，如德国默克尔公司的RQ-reflex反射式植株营养诊断仪，通过试纸条的反射光比色，测定叶片硝酸盐含量。但它属于有损检测，需要采下叶片，处理成显色溶液才能比色测试。尚未见有关反射式比色无损测定植株叶片成分的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速简便的叶片中叶绿素无损测定方法，该测定方法不受叶片厚度限制、适用于任何作物、任何品种、任何生长期、任何采样部位，且检测成本低廉。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

设计一种叶片中叶绿素无损测定方法(2个波长法)，包括以下步骤：

①选定检测光波长：以叶绿素a吸收光谱曲线和叶绿素b吸收光谱曲线相交汇区的波长为工作波长，以叶绿素a和叶绿素b都没有吸收的近红外光谱区为参照波长；

②求叶绿素反射率：分别以工作波长、参照波长的单色光依次照射在待测叶片和参照反射板(照射在参照反射板上，目的在于调校检测仪器)上，使其产生漫反射，以光电反射仪检测记录两种波长下的漫反射率R_工、R_参1，以下式求得叶绿素反射率：

R＝R_工-r₁×R_参1，

上式中R为待测叶片中叶绿素反射率；R_参1为参照波长照射下的待测叶片基质的漫反射率；R_工为工作波长照射下的叶片的漫反射率；r₁为系数，取值0.9～1.8；

以参照波长测定待测叶片的基质反射率(在参照波长下，叶片基质对光有吸收而叶绿素对光无吸收，因而叶片的反射率就是叶片基质的反射率)，乘以一定系数r₁，在计算叶绿素反射率时予以扣减(消除叶片基质本身的干扰)，r₁的取值范围0.9～1.8，可进一步通过实验室验证进行优化选择。

③计算叶绿素反射函数：将上步所得叶绿素反射率R代入下述库比尔卡-芒克公式计算出待测叶片中所含叶绿素的反射函数F_KM：

F_KM＝(１－R)²/2R；

④计算叶绿素总含量：由下式将所述反射函数换算为待测叶片中的叶绿素总含量：

C＝B×F_KM，

上式中C为待测叶片中叶绿素总含量；B为标定的换算系数，其标定方法为测定任一个已知叶绿素含量的叶片的反射函数，求得叶绿素含量与反射函数的比值。

也可以下述步骤取代上述步骤④：

先以所述步骤①～③得到一定数量的同类植物叶片中所含叶绿素的反射函数F_KM，并按常规方法测定其叶绿素含量，然后将按常规方法测定的叶绿素含量与对应的叶片反射函数F_KM进行回归：

C＝a×F_KM+b，

所得到的回归方程如相关性显著，即作为换算方程，根据步骤①～③所得待测叶片的反射函数，由所得换算方程换算出待测叶片中的叶绿素总含量。

上述工作波长为620～670nm；参照波长为800～1500nm。

另一种叶片中叶绿素无损测定方法(3-4个波长法)，其与第一种方法(双波长法)相同处是都采用了反射法，其不同处则是增加了一个光源，由半定量提升为定量，具体包括以下步骤：

①选定检测光波长：以630±30nm为第一工作波长，以620～680nm为第二工作波长，以780～1200nm为参照波长；

②求叶绿素反射率：分别以第一工作波长、第二工作波长及参照波长的单色光依次照射在待测叶片和参照反射板上，使其产生漫反射，检测记录三种波长下的漫反射率R_λ１、R_λ2、R_参2，分别以下式求得叶绿素a的反射率R_a和叶绿素b的反射率R_b：

R_a＝R_λ2-r₂×R_参2，

R_b＝R_λ1-r₃×R_参2，

式中r₂、r₃为系数，r₂、r₃取值范围均为0.9～1.8；

③计算叶绿素反射函数：分别将上步所得叶绿素a、叶绿素b的反射率R_a、R_b代入库比尔卡-芒克公式计算出待测叶片中所含叶绿素a、叶绿素b的反射函数F_KMλ2、F_KMλ1：

F_KMλ1＝(1-R_b)²/2R_b，

F_KMλ2＝(1-R_a)²/2R_a，

④按常规建立反射函数相对于叶绿素a、叶绿素b含量的双波长方程，求解可得待测叶片中的叶绿素含量C_c：

C_a＝M₁F_KMλ2-N₁F_KMλ1，

C_b＝M₁F_KMλ1-N₂F_KMλ2，

C_c＝C_a+C_b；

式中，F_KMλ１、F_KMλ2分别为待测叶片在第一波长、第二波长的库比尔卡--芒克反射函数，M₁、N₁、M₂、N₂为双波长方程系数，其通过常规方法建立F_KMλ1与第一波长的相关工作曲线、F_KMλ2与第二波长的相关曲线，后可得到(可参照分光光度学有关双波长法(或三波长法)论述，是公知的常规方法，其曲线的纵坐标取为F_KM，横坐标取为波长)。

也可以下步骤替代所述步骤④：

先用常规方法测定待测植株叶片中所含叶绿素a、叶绿素b的吸光度A_λ２、A_λ1，将A_λ2、A_λ1与上步所得F_KMλ1、F_KMλ2进行线性回归，得如下关系式：

A_λi＝a+bF_KMλi，

根据上述对应的关系式求得待测叶片在第一波长、第二波长下的叶片吸光度A_λ１、A_λ２；再建立吸光度A_λ相对于叶绿素含量的双波长方程(或三波长方程)，求解可得待测叶片中的叶绿素含量C_c：

C_a＝M₁A_λ2-N₁A_λ1，

C_b＝M₂A_λ1-N₂A_λ2，

C_c＝C_a+C_b，

A_λ１、A_λ２分别为待测叶片在第一波长、第二波长下的叶片吸光度；M₁、N₁、M₂、N₂为双波长方程系数，其通过常规方法建立A_λ1与第一波长的相关曲线、A_λ2与第二波长的相关曲线后取得；C_a、C_b、C_c分别为叶绿素a和叶绿素b的含量及叶绿素总含量。

还可以下步骤替代上述步骤④：

分别采用线性回归方法的建立F_KMλ1、F_KMλ2相对于常规测定方法所得叶绿素b浓度、叶绿素a浓度的换算关系，再用把二者相加求出叶绿素总含量：

C_a＝A₂+B₂×F_KM2，

C_b＝A₁+B₁×F_KM1，

C_c＝C_a+C_b

式中A₁、A₂为常数；B₁、B₂为换算系数。

本发明具有积极有益的技术效果：

1.本发明方法不受叶片厚度的限制，而现有的透射式比色测定法在叶片厚度大时，吸光度A＞1.0时，误差急速扩大；本发明所采用的漫反射式测定方法则因漫反射发生在叶片内部的任一层面，受叶片厚度的影响轻微，能成功地测定玻璃翠叶片(厚3.7mm)。

2.本发明2波长法(光源为2个波长)是采用一个对叶绿素不吸收，对叶片基质吸收的波长作为参照，因而基本消除了叶片叶脉对检测结果的影响，大大减少了误差，应用该方法可以将相关性的置信水平由0.05提升至0.01；在第二种方法(光源为3-4个波长)运用中，可以结合双波长法(或三波长法)使叶片无损检测由半定量提升到定量。

3.本发明的第二方法(光源为3个以上波长法)，设计有3-4个检测波长，可以运用双波长法(或三波长法)，排除相互干扰；可以分别得到叶绿素a、叶绿素b含量，比实验室有损检测效率提高近百倍。

4.本发明的第二种方法得到的叶绿素含量，适用于任何作物、任何品种、任何生长期、任何采样部位；检测效率高，结合相关的反射式光电检测仪可直观的读取叶绿素值；能使检测工作完全从繁复的建模实验中解脱出来，降低劳动强度。

5.本发明方法对叶绿素的检测成本极低，几乎没有耗材，也无需换算模型的技术准备过程，有利于在农村大面积使用叶绿素测定值指导农业生产。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步阐述本发明。

以下实施例所涉及反射式光电检测仪器为河南农大迅捷测试技术有限公司生产的多波长多光源漫反射式比色装置(发明专利申请号：201110027702.5)，只是更换不同波长的光源完成的；用以对比的叶绿素测定方法是实验室测定叶绿素常规方法(参照国家标准GB/T22182-2008)，用以校对的仪器为721型分光光度计。

实施例1：本发明的第一种方法(2个波长法)测定桐树叶中的叶绿素含量

(1)选定工作波长620nm，参照波长960nm；

(2)分别以工作波长、参照波长的单色光依次照射在待测叶片和参照反射板(以白板为参照反射板，反射率为100％))上，使其产生漫反射，以光电反射仪检测记录两种波长下的漫反射率R_工、R_参1(结果见表1)，以下式求得叶绿素反射率：

R＝R_工-r₁×R_参1

(3)将上步所得叶绿素反射率R代入下述库比尔卡-芒克公式计算出待测叶片中所含叶绿素的反射函数F_KM(结果见表1)：

F_KM＝(1-R)²/2R；

(4)将叶绿素实测值与对应的叶片中所含叶绿素的反射函数F_KM进行回归，建立如下回归方程：

C＝0.403261×F_KM+0.142268，r＝0.8163，相关性显著，可作为换算方程。

(5)根据步骤(3)所得到的待测叶片的反射函数，由步骤(4)所得换算方程换算出待测叶片中的叶绿素总含量。

表1桐树叶中叶绿素检测过程中的相关测定参数和计算参数

n＝6    r＝0.8163(r_0.05＝0.707，r_0.01＝0.884)。

实施例2本发明第一种方法(2个波长法)测定玫瑰叶中的叶绿素含量

检测方法与实施例1基本相同，不同之处在于所选用的检测波长不同：工作波长650nm，参照波长940nm；有关检测及计算结果见表2。

待测叶片中叶绿素含量的换算方程为：

C＝0.4478×F_KM+0.0456，r＝0.834，相关性极显著。

表2玫瑰叶中叶绿素检测过程中的相关测定参数和计算参数

n＝9，r＝0.834(r_0.05＝0.602，r_0.01＝0.735)。

实施例3：本发明第二种方法(3个波长法)测定油菜叶

(1)第一波长640nm，第二波长660参照波长1000nm；

(2)分别以第一工作波长、第二工作波长及参照波长的单色光依次照射在待测叶片和参照反射板(以白板为参照反射板，反射率为100％)上，使其产生漫反射，检测记录三种波长下的漫反射率R_λ１、R_λ２、R_参2，分别以下式求得叶绿素a的反射率R_a和叶绿素b的反射率R_b：

R_a＝R_λ2-r₂×R_参2，

R_b＝R_λ1-r₃×R_参2，

式中r₂、r₃为系数，取值0.9～1.8；

(3)计算叶绿素反射函数：分别将上步所得叶绿素a、叶绿素b的反射率R_a、R_b代入库比尔卡-芒克公式计算出待测叶片中所含叶绿素a、叶绿素b的反射函数F_KMλ2、F_KMλ1：

F_KMλ1＝(1-R_b)²/2R_b，

F_KMλ2＝(1-R_a)²/2R_a

检测计算结果见表3；

(4)分别采用线性回归方法的建立F_KMλ1、F_KMλ2相对于常规测定方法所得叶绿素b浓度、叶绿素a浓度的换算关系，再用把二者相加求出叶绿素总含量

叶绿素反射计算值X_a、X_b：是按照所选波长通过建立双波长计算式与实验室常规分析值建立的换算方程得来，本例建立的换算方程为：

叶绿素X_a＝0.306275×F_KM2+0.17433，

叶绿素X_b＝0.0238×F_KM1+0.0561，总叶绿素Y＝1.0898×X_a+b+0.0122，计算表明计算值与实际值的相关系数为0.658，相关性显著。表3油菜叶中叶绿素检测过程中的相关测定参数和计算参数

n＝12    r＝0.658(r_0.05＝0.506，r_0.01＝0.712)。

实施例4：本发明第二种方法(3个波长法)测定油菜叶原始反射函数数据同实施例3，但采用双波长法计算叶绿素含量，所建立的双波长回归方程为：

X_a＝2.73803A_λ2-0.180586A_λ1

X_b＝0.334083A_λ1-0.211810A_λ2

X_a+b＝X_a+X_b。表4油菜叶中叶绿素检测过程中的相关测定参数和计算

n＝12      r＝0.98878(r_0.05＝0.506，r_0.01＝0.712)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种叶片中叶绿素无损测定方法，包括以下步骤：

①选定检测光波长：以叶绿素a吸收光谱曲线和叶绿素b吸收光谱曲线相交汇区域的波长为工作波长，以叶绿素a和叶绿素b都没有吸收的近红外光谱区为参照波长；

②求叶绿素反射率：分别以工作波长、参照波长的单色光依次照射在待测叶片和参照反射板上，使其产生漫反射，以光电反射仪检测记录两种波长下的漫反射率R_工、R_参1，以下式求得叶绿素反射率：

R＝R_工-r₁×R_参1，

上式中R为待测叶片中叶绿素反射率；R_参1为参照波长照射下的待测叶片基质的漫反射率；R_工为工作波长照射下的叶片的漫反射率；r₁为系数，取值0.9～1.8；

③计算叶绿素反射函数：将上步所得叶绿素反射率R代入下述库比尔卡-芒克公式计算出待测叶片中所含叶绿素的反射函数F_KM：

F_KM＝(1-R)²/2R；

④计算叶绿素总含量：由下式将所述反射函数换算为待测叶片中的叶绿素总含量：

C＝B×F_KM，

上式中C为叶绿素总含量；B为标定的换算系数，其标定方法为测定任一个已知叶绿素含量的叶片的反射函数，求得叶绿素含量与反射函数的比值。

2.根据权利要求1所述的叶片中叶绿素无损测定方法，其特征在于，所述工作波长为620～670nm；参照波长为800～1500nm。

3.根据权利要求1所述的叶片中叶绿素无损测定方法，其特征在于，以下述步骤取代所述步骤④：

先以所述步骤①～③得到一定数量的同类植物叶片中所含叶绿素的反射函数F_KM，并按常规方法测定其叶绿素含量，然后将按常规方法测定的叶绿素含量与对应的叶片反射函数F_KM进行回归：

C＝a×F_KM+b，

所得到的回归方程如相关性显著，即作为换算方程，根据步骤①～③所得待测叶片的反射函数，由所得换算方程换算出待测叶片中的叶绿素总含量。

4.一种叶片中叶绿素无损测定方法，包括以下步骤：

①选定检测光波长：以600～660nm为第一工作波长，以620～680nm为第二工作波长，以780～1200nm为参照波长；

②求叶绿素反射率：分别以第一工作波长、第二工作波长及参照波长的单色光依次照射在待测叶片和参照反射板上，使其产生漫反射，检测记录三种波长下的漫反射率R_λ1、R_λ2、R_参2，分别以下式求得叶绿素a的反射率R_a和叶绿素b的反射率R_b：

R_a＝R_λ2-r₂×R_参2，

R_b＝R_λ1-r₃×R_参2，

式中r₂、r₃为系数，r₂、r₃取值范围均为0.9～1.8；

③计算叶绿素反射函数：分别将上步所得叶绿素a、叶绿素b的反射率R_a、R_b代入库比尔卡-芒克公式计算出待测叶片中所含叶绿素a、叶绿素b的反射函数F_KMλ2、F_KMλ1：

F_KMλ1＝(1-R_b)²/2R_b，

F_KMλ2＝(1-R_a)²/2R_a，

④按双波长分光光度法的检测原理建立起反射函数相对于叶绿素a、叶绿素b含量的双波长方程，求解可得待测叶片中的叶绿素含量C_c：

C_a＝M₁F_KMλ2-N₁F_KMλ1，

C_b＝M₂F_KMλ1-N₂F_KMλ2，

C_c＝C_a+C_b；

式中，F_KMλ1、F_KMλ2分别为待测叶片在第一波长、第二波长的库比尔卡-芒克反射函数，M₁、N₁、M₂、N₂为双波长方程系数，是在分别建立F_KMλ1与第一波长、F_KMλ2与第二波长的工作曲线基础上，按照分光光度学双波长分析经典方法得到的相关曲线、F_KMλ2与第二波长的相关曲线后得到。

5.根据权利要求4所述的叶片中叶绿素无损测定方法，其特征在于，以下步骤替代所述步骤④：

先用常规方法测定待测植株叶片中所含叶绿素a、叶绿素b的吸光度A_λ2、A_λ1，将A_λ2、A_λ1与上步所得F_KMλ1、F_KMλ2进行线性回归，得如下关系式：

A_λi＝a+bF_KMλi，

根据上述对应的关系式求得待测叶片在第一波长、第二波长下的叶片吸光度A_λ1、A_λ2；再建立吸光度A_λ相对于叶绿素含量的双波长方程，求解可得待测叶片中的叶绿素含量C_c：

C_a＝M₁A_λ2-N₁A_λ1，

C_b＝M₂A_λ1-N₂A_λ2，

C_c＝C_a+C_b，

A_λ1、A_λ2分别为待测叶片在第一波长、第二波长下的叶片吸光度；M₁、N₁、M₂、N₂为双波长方程系数，其通过常规方法建立A_λ1与第一波长的吸收曲线、A_λ2与第二波长的吸收曲线后，按照双波长分光光度法得到的；C_a、C_b、C_c分别为叶绿素a和叶绿素b的含量及叶绿素总含量。

6.根据权利要求4所述的叶片中叶绿素无损测定方法，其特征在于，以下步骤替代所述步骤④：

分别采用线性回归方法的建立F_KMλ1、F_KMλ2相对于常规测定方法所得叶绿素b浓度、叶绿素a浓度的换算关系，再用把二者相加求出叶绿素总含量：

C_a＝A₂+B₂×F_KM2，

C_b＝A₁+B₁×F_KM1，

C_c＝C_a+C_b

式中A₁、A₂为常数；B₁、B₂为换算系数。