CN111896482A - 一种小球藻叶绿素含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小球藻叶绿素含量的检测方法，其特征在于，取不同生长时期的小球藻样本，在645nm和663nm波长处测样本吸光度值，计算出样本的叶绿素含量；测定样本的颜色参数a*、b*、L*和ΔE，建立藻细胞叶绿素含量与颜色参数之间的线性回归模型，将待测小球藻样本的颜色参数分别代入模型中，计算出小球藻的叶绿素含量，即对预测模型进行验证。本发明可实现无伤化快速检测普通小球藻中的叶绿素含量、无污染、精确度高、操作简单，适合推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种普通小球藻叶绿素含量的检测方法，属于植物培育工程技术领域。
背景技术
普通小球藻(Chlorella vulgaris)是一种球形单细胞淡水藻类，直径为3～8微米，是一种高效的光合植物，以光合自养生长繁殖，分布极广。普通小球藻培育简单、繁殖快速、营养价值高、应用前景广。其含有人体所需的17种氨基酸，多种天然高效维生素、藻多糖和微量元素，不仅可活化人体细胞，促进器官组织生长还具有抗氧化、清除自由基、延缓衰老、改善心、肺功能等功效。国内外相关文献还表明普通小球藻含有CGF活性生长因子，具有调节免疫功能、抗肿瘤、诱发干扰素、增强细胞吞噬的功能。
叶绿素，是高等植物和其他所有能进行光合作用的生物体含有的一类绿色色素，被誉为是肠、肾、肺血液中有害物质的"清道夫"，有很强的吸附毒素的作用。叶绿素主要是叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg)两种。叶绿素a呈蓝绿色，红区最大吸收峰在663nm附近。叶绿素b呈黄绿色，红区最大吸收峰在645nm附近。普通小球藻中叶绿素的含量是螺旋藻的5-6倍，是自然界中叶绿素含量最高的。
目前常通过热乙醇提取、冷冻丙酮萃取等方式对普通小球藻进行前处理后，采用分光光度法对其叶绿素含量进行检测，此类方法操作繁琐，实验误差大，使用化学试剂会造成残留进而污染生态环境。综合目前相关文献可知，通过对藻类颜色参数的测定可以估算其内部色素含量的变化，颜色的变化可以作为藻类生长状态变化的重要指标。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种操作方便、实验误差小的小球藻叶绿素含量的检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
一种小球藻叶绿素含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)：取不同生长时期的小球藻样本，在645nm和663nm波长处测样本吸光度值，计算出样本的叶绿素含量；
步骤2)：测定样本的颜色参数a*、b*、L*和ΔE，建立藻细胞叶绿素含量与颜色参数之间的线性回归模型如下：
y＝-2.8955x-0.3618 式1；
式1中，y代表a*；x代表叶绿素含量，单位为mg/L；判定系数R2为0.9829；
y＝13.798x-1.8539 式2；
式2中，y代表b*，x代表叶绿素含量mg/L，判定系数R2为0.9424；
y＝-7.5044x+92.672 式3；
式3中，y代表L*，x代表叶绿素含量mg/L，判定系数R2为0.9266；
y＝15.728x-1.8023 式4；
式4中，y代表ΔE，x代表叶绿素含量mg/L，判定系数R2为0.9461；
步骤3)：将待测小球藻样本的颜色参数分别代入式1-4，计算出小球藻的叶绿素含量，即对预测模型进行验证。
优选地，所述步骤1)中不同生长时期的小球藻样本的取样方法为：
无菌条件下，在OECD培养基中接种初始密度为1×105个/mL小球藻细胞，培养体积为100mL，设三个水平；用8层纱布密封瓶口防止染菌，试验环境温度为25±1℃，光照强度为3000lx，光暗比L:D＝12h:12h，静置培养，每12h测试一次藻种叶绿素含量和颜色参数变化。
优选地，步骤1)中不同生长时期的小球藻样本的叶绿素含量采用冰冻丙酮萃取法测得。
更优选地，冰冻丙酮萃取法包括以下步骤：
第一步：取10mL藻液过滤于孔径0.45μm乙酸纤维滤膜上，将滤膜取出后置于20mL离心管中，再加入10mL 90wt％丙酮，于冰箱中4℃提取过夜后，在冷冻离心机中以4000r/min的转速离心10min，取上清液；
第二步：测上清液在645nm和66nm波长处的吸光度值，计算公式为：
CA＝12.70A663nm-2.69A645nm 式4；
CB＝22.90A645nm-4.68A663nm 式5；
CT＝CA+CB 式6；
式4-6中：CA、CB、CT分别为叶绿素a(chl a)、叶绿素b(chl b)和总叶绿素(chl(a+b))的含量。
优选地，所述步骤2)中小球藻的颜色参数a*、b*、L*采用自动色差计测定，ΔE为色差，以0时测量的藻液颜色参数为标样，计算公式为：
式7中：ΔE为色差；ΔL*＝L样*-L标*；Δa*＝a样*-a标*；Δb*＝b样*-b标*。
优选地，所述的小球藻为普通小球藻。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明可实现无伤化快速检测普通小球藻中的叶绿素含量且前期无需使用化学试剂对藻液进行前处理，避免相关化学试剂的残留进而污染生态环境。该方法大大简化了操作步骤，缩短了检测时间，无污染、精确度高、操作简单，适合推广应用。
附图说明
图1-4分别为实施例中小球藻叶绿素与颜色参数a*、b*、L*、ΔE的线性拟合图；
图5-8分别为模型方程1-4中小球藻叶绿素含量实测值和预测值的相关曲线图。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例
普通小球藻(Chlorella Vulgaris)，购于南京海洱斯生物科技有限公司，实验前需在实验室中对藻种进行扩大培养。
无菌条件下，在OECD培养基中接种初始密度为1×105个/mL普通小球藻细胞，培养体积为100mL，设三个水平。用8层纱布密封瓶口防止染菌，试验环境温度为(25±1)℃，光照强度为3000lx，光暗比L:D＝12h:12h，静置培养，每12h测试一次藻种叶绿素含量和颜色参数变化。
叶绿素含量的测定：采用冰冻丙酮萃取法，取10mL藻液过滤于孔径0.45μm乙酸纤维滤膜上，将滤膜取出后置于20mL离心管中，再加入10mL 90％丙酮，于冰箱中4℃提取过夜后，在冷冻离心机中以4000r/min的转速离心10min，取上清液在645nm和663nm波长处的吸光度值，计算公式如下所示：
CA＝12.70A663nm-2.69A645nm 式4；
CB＝22.90A645nm-4.68A663nm 式5；
CT＝CA+CB 式6；
式4-6中：CA、CB、CT分别为叶绿素a(chl a)、叶绿素b(chl b)和总叶绿素(chl(a+b))的含量。
颜色参数的测定：普通小球藻颜色采用自动色差计测定，测定CIE-Lab表色系中的L*值(明度，反映色泽的明度，从0～100变化，0是黑色，100是白色)，a*值(红度，正值代表红色，负值代表绿色)，b*值(黄度，正值代表黄色，负值代表蓝色)。ΔE为色差，以0时测量的藻液颜色参数为标样，计算公式如下(每个藻液样本摇匀后，3次测量取均值)。
式7中：ΔE为色差；ΔL*＝L样*-L标*；Δa*＝a样*-a标*；Δb*＝b样*-b标*。
取17个普通小球藻在不同生长时期的藻液样本进行叶绿素含量和颜色参数间的线性回归分析，如图1-4所示。相应建立的藻细胞叶绿素含量与颜色参数之间的线性回归模型，公式如下：
y＝-2.8955x-0.3618 式1；
式1中，y代表a*；x代表叶绿素含量，单位为mg/L；判定系数R2为0.9829；
y＝13.798x-1.8539 式2；
式2中，y代表b*，x代表叶绿素含量mg/L，判定系数R2为0.9424；
y＝-7.5044x+92.672 式3；
式3中，y代表L*，x代表叶绿素含量mg/L，判定系数R2为0.9266；
y＝15.728x-1.8023 式4；
式4中，y代表ΔE，x代表叶绿素含量mg/L，判定系数R2为0.9461；
普通小球藻叶绿素含量与颜色参数(a*、b*、L*、ΔE)的线性回归方程判定系数R2均在0.9以上，表明叶绿素含量与颜色参数的线性关系优越，拟合度显著，拟合度排序为a*>ΔE>b*>L*。综上，认为可以通过普通小球藻藻液颜色参数的变化反应其叶绿素含量的差异。
再选取30个普通小球藻在不同生长时期的藻液样本，分别测定其颜色参数后代入上述四个模型中，计算出普通小球藻样本叶绿素含量的预测值。
表1不同生长时期普通小球藻叶绿素的真实值与预测值统计(n＝30)
表1是利用冷冻丙酮萃取法结合分光光度法得到的普通小球藻叶绿素含量的真实值与利用上述普通小球藻叶绿素含量预测模型计算出的预测值的统计表，结合图5-8普通小球藻叶绿素含量实测值和预测值的相关曲线图，可以得出普通小球藻叶绿素含量真实值与预测值的线性回归方程判定系数R2均在0.9以上，表明模型的线性关系优越，拟合度显著，可对普通小球藻中的叶绿素含量进行很好的预测。图5-8比较了小球藻样本用冷冻丙酮萃取法得出的叶绿素含量实际值和使用本研究中预测方程得出的预测值之间的线性相关性曲线，反应的是预测模型的准确性。
Claims (6)
1.一种小球藻叶绿素含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)：取不同生长时期的小球藻样本，在645nm和663nm波长处测样本吸光度值，计算出样本的叶绿素含量；
步骤2)：测定样本的颜色参数a*、b*、L*和ΔE，建立藻细胞叶绿素含量与颜色参数之间的线性回归模型如下：
y＝-2.8955x-0.3618 式1；
式1中，y代表a*；x代表叶绿素含量，单位为mg/L；判定系数R2为0.9829；
y＝13.798x-1.8539 式2；
式2中，y代表b*，x代表叶绿素含量mg/L，判定系数R2为0.9424；
y＝-7.5044x+92.672 式3；
式3中，y代表L*，x代表叶绿素含量mg/L，判定系数R2为0.9266；
y＝15.728x-1.8023 式4；
式4中，y代表ΔE，x代表叶绿素含量mg/L，判定系数R2为0.9461；
步骤3)：将待测小球藻样本的颜色参数分别代入式1-4，计算出小球藻的叶绿素含量，即对预测模型进行验证。
2.如权利要求1所述的小球藻叶绿素含量的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中不同生长时期的小球藻样本的取样方法为：
无菌条件下，在OECD培养基中接种初始密度为1×105个/mL小球藻细胞，培养体积为100mL，设三个水平；用8层纱布密封瓶口防止染菌，试验环境温度为25±1℃，光照强度为3000lx，光暗比L:D＝12h:12h，静置培养，每12h测试一次藻种叶绿素含量和颜色参数变化。
3.如权利要求1所述的小球藻叶绿素含量的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中不同生长时期的小球藻样本的叶绿素含量采用冰冻丙酮萃取法测得。
4.如权利要求3所述的小球藻叶绿素含量的检测方法，其特征在于，所述的冰冻丙酮萃取法包括以下步骤：
第一步：取10mL藻液过滤于孔径0.45μm乙酸纤维滤膜上，将滤膜取出后置于20mL离心管中，再加入10mL 90wt％丙酮，于冰箱中4℃提取过夜后，在冷冻离心机中以4000r/min的转速离心10min，取上清液；
第二步：测上清液在645nm和66nm波长处的吸光度值，计算公式为：
CA＝12.70A663nm-2.69A645nm 式4；
CB＝22.90A645nm-4.68A663nm 式5；
CT＝CA+CB 式6；
式4-6中：CA、CB、CT分别为叶绿素a(chl a)、叶绿素b(chl b)和总叶绿素(chl(a+b))的含量。
5.如权利要求1所述的普通小球藻叶绿素含量的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中小球藻的颜色参数a*、b*、L*采用自动色差计测定，ΔE为色差，以0时测量的藻液颜色参数为标样，计算公式为：
式7中：ΔE为色差；ΔL*＝L样*-L标*；Δa*＝a样*-a标*；Δb*＝b样*-b标*。
6.如权利要求1-5任意一项所述的小球藻叶绿素含量的检测方法，其特征在于，所述的小球藻为普通小球藻。
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| JP2006101795A (ja) * | 2004-10-07 | 2006-04-20 | Yakult Honsha Co Ltd | 高クロロフィル及び高カロテノイド含有性のクロレラ及びその製造方法 |
| CN103353439A (zh) * | 2013-07-05 | 2013-10-16 | 浙江大学 | 一种基于光谱技术的小球藻叶绿素含量与生物量同时检测的方法 |
| CN105651713A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-06-08 | 浙江工业大学 | 一种基于计算机图像分析的青菜叶片叶绿素定量检测方法 |
| CN108152229A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-06-12 | 河海大学 | 一种地表水体浮游藻类叶绿素a含量测定方法 |
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| CN113316632A (zh) * | 2018-11-21 | 2021-08-27 | 微藻控股有限公司 | 小球藻的改良菌株及生产方法 |
| CN114563362A (zh) * | 2022-01-29 | 2022-05-31 | 大连海事大学 | 一种船舶压载水微藻含量的检测方法 |
-
2020
- 2020-07-17 CN CN202010689435.7A patent/CN111896482A/zh active Pending
Patent Citations (7)
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